李博鈺 孟 丹

由于顱面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜解剖，顱面組織從創(chuàng)傷、手術(shù)切除或先天性畸形中完全恢復(fù)是極具挑戰(zhàn)性的［1］。而作為金標(biāo)準(zhǔn)的自體骨移植也由于其外形難以與受區(qū)匹配，存在一定的局限性。在近幾十年來，骨組織工程（bone tissue engineering, BTE）快速發(fā)展。骨組織工程的三個主要研究內(nèi)容分別是骨組織工程三維多孔支架、骨種子細(xì)胞和生長因子［2］。其中支架的材料與制造是研究的重點(diǎn)，它需要適合細(xì)胞的生長繁殖并在結(jié)構(gòu)上能夠使再生的組織成熟并行使功能。

3D生物打?。?D bioprinting, 3DBP）源于3D打印，通過逐層打印由生物材料和（或）細(xì)胞以及生物因子組成的生物墨水（bioinks），以高分辨率制造載有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)［3,4］。相比于3D打印，理想的3D生物打印可以更好地控制細(xì)胞和生物因子在支架中的分布，從而更利于組織再生，但目前也面臨著許多挑戰(zhàn)，比如可打印性、機(jī)械性能、血管化等［5］。隨著3D生物打印技術(shù)和材料學(xué)的不斷發(fā)展，研究者們致力于通過改進(jìn)生物打印的參數(shù)和發(fā)現(xiàn)更合適的材料以解決現(xiàn)存的挑戰(zhàn)。本文將概述骨組織工程的3D生物打印及其研究進(jìn)展。

1.骨組織工程

骨組織工程作為一個十分有前景的研究方向，通過結(jié)合生物活性分子、細(xì)胞和生物材料來構(gòu)建仿生支架來恢復(fù)病變或受損的骨組織［6］。傳統(tǒng)意義上的骨組織工程是將種子細(xì)胞接種于支架上后進(jìn)行培養(yǎng)。傳統(tǒng)的骨組織工程支架制備方法包括溶液澆鑄/離子洗出法、原位成型法、靜電紡絲法、相分離/凍干法、氣體成孔法等［7］，雖然用這些工藝制備出的支架進(jìn)行骨組織工程取得了一定的成果，但研究者們的要求并不止于此。

首先傳統(tǒng)的支架制備方法是減法制造，即從整塊的材料中去除部分材料以得到目標(biāo)結(jié)構(gòu)［7］。但這類方法控制幾何形狀的能力有限，無法實(shí)現(xiàn)對支架材料和孔隙結(jié)構(gòu)的精確控制，結(jié)構(gòu)形狀也無法與骨缺損部位完全契合，不能實(shí)現(xiàn)個性化植入物的制備［8］。另外，這種在體外制造支架后再接種種子細(xì)胞的方法屬于無細(xì)胞支架制造技術(shù)，無法精準(zhǔn)控制細(xì)胞的分布，無法保證所需的細(xì)胞密度、細(xì)胞鋪展、粘附、遷移和體內(nèi)外相互作用［9］。

2.3D生物打印

隨著增材制造（additive manufacturing,AM）——也稱作3D打印——的出現(xiàn)，其逐層打印的方式克服了傳統(tǒng)支架制造方法在結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和空間異質(zhì)性上的限制。而3D生物打印則克服了支架制造-細(xì)胞接種方法的弊端，將細(xì)胞在打印過程中直接封裝在支架內(nèi)，即同時將生物材料和細(xì)胞沉積到設(shè)計的位置。其高通量制造和對細(xì)胞的精準(zhǔn)控制［10］，在近十年來備受關(guān)注。

2.1 3D生物打印技術(shù) 目前可以有效地在骨支架內(nèi)沉積和分布細(xì)胞的3D生物打印技術(shù)有基于噴墨的生物打?。?1］、基于光的生物打印［12］、基于擠出的生物打?。?3,6］。

2.1.1 基于噴墨的生物打印 基于噴墨的生物打?。╥nkjet-based bioprinting, IBP）通過熱、壓電或聲產(chǎn)生的力將液滴噴射到控制臺上，由于其高速、高通量、高精度且低成本的特點(diǎn)使其應(yīng)用廣泛［14］。但它的缺點(diǎn)是生物墨水必須呈液態(tài)且呈低粘度，否則易堵塞噴嘴。這限制了生物墨水的細(xì)胞密度。而且液滴噴出后固化的延遲限制了垂直方向上（z軸）的分辨率［15,16］。

2.1.2 基于光的生物打印 基于光的生物打?。╨ight-based bioprinting, LBP）是所有打印技術(shù)中速度最快、最精確的技術(shù)，且不受材料粘度的限制，包括激光輔助打?。╨aser-assisted printing，LAP）和立體光刻（stereolithography，SLA）［15］。前者是一種基于激光誘導(dǎo)前向轉(zhuǎn)移（laser-induced forward transfer，LIFT）的無噴嘴技術(shù)，它利于打印二維結(jié)構(gòu)（例如皮膚），但最近的一些研究發(fā)現(xiàn)可以用這種方法制造復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)［9,15］。后者利用光（紫外線或可見光）逐層選擇性地固化液態(tài)的光固化材料，擁有非常好的形狀保真度。激光打印的優(yōu)點(diǎn)是高分辨率、可以打印復(fù)雜結(jié)構(gòu)和高粘度（高細(xì)胞密度）材料，但光對組織的損害以及高成本是它的缺點(diǎn)［15］。

2.1.3 基于擠出的生物打印 基于擠出的生物打?。╡xtrusion-based bioprinting）是最常用于骨組織工程的3D生物打印技術(shù)［4］，通過氣動或機(jī)械驅(qū)動將連續(xù)的生物墨水流以設(shè)定的速度和量從噴嘴中擠出到工作臺上［3,17］。它可以打印的生物材料范圍十分廣泛，包括水凝膠、共聚物和球形細(xì)胞團(tuán)。但它主要的缺點(diǎn)是剪切應(yīng)力、細(xì)胞聚集和沉淀會導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。生物墨水的流變性（粘度）、打印速度（流速）等因素都會影響細(xì)胞所受的剪切應(yīng)力。通過改善打印參數(shù)（流速、打印噴嘴的形狀和長度等）、尋找適當(dāng)?shù)纳锎蛴〈翱冢╞iofabrication window）——即在打印性能和細(xì)胞活力之間權(quán)衡——研究材料的熱交聯(lián)和剪切稀化的能力，可以優(yōu)化此打印技術(shù)［3,18-20］。另一個問題是分辨率低，100μm為最佳分辨率，但是特別適用于高粘度、高細(xì)胞密度的生物墨水［21-23］。

2.2 生物墨水 生物墨水（bioinks）是3D生物打印的重要環(huán)節(jié)，也是近十幾年來的研究熱點(diǎn)［4］。生物墨水被裝載在打印機(jī)料筒中（EBP和IBP），經(jīng)由打印噴嘴將其放置在設(shè)計的位置后固化，或在打印平臺上，由光/激光固化（LBP）。它可以由一種或多種天然或合成生物材料制成，也可以由沒有任何其他生物材料的細(xì)胞聚集體制成［4,8］。本文僅討論含細(xì)胞的生物墨水。用于骨組織工程的生物墨水中封裝的細(xì)胞常用的有人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（hMSCs）、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（hASCs）、前成骨細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）等，與無細(xì)胞支架制造技術(shù)應(yīng)用的接種細(xì)胞種類大體一致。理想的載細(xì)胞生物墨水有以下要求：（1）具有良好的生物相容性，能夠模仿天然組織的微環(huán)境，并可生物降解；（2）可打印性：具有良好的流變特性，且在打印后有良好的形狀保真度；（3）具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，且與目標(biāo)組織相匹配；（4）保持細(xì)胞活力，且促進(jìn)細(xì)胞分化；（5）可定位功能性生物因子（例如血管內(nèi)皮生長因子VEGF）以利于植入后封裝細(xì)胞的活性和新生組織向內(nèi)生長［4,24］。

確定最佳的載細(xì)胞生物墨水配方是成功生物打印的關(guān)鍵步驟，到目前為止，各種具有特定特征的天然和合成生物材料已經(jīng)被用作生物墨水［4］。常用的生物材料主要是水凝膠類，還可將其與多種材料結(jié)合組成復(fù)合材料。

2.2.1 水凝膠 水凝膠有著很好的生物相容性、可降解性和保水性。多數(shù)還有利于細(xì)胞粘附、增殖、分化的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)［4］。水凝膠可以分為天然水凝膠和合成水凝膠。已用于骨組織工程的天然水凝膠包括海藻酸鹽（alginate, Alg）、殼聚糖（chitosan, CS）、明膠（gelatin, Gel）、膠原、絲蛋白（silk fibroin, SF）和透明質(zhì)酸（HAc）等，后者包括甲基丙烯酸化明膠（GelMA）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDMA）、Pluronic F-127等［4,15,25］。水凝膠可通過熱、離子、酶促和光交聯(lián)。高溫可能會對細(xì)胞造成不可逆的損傷，然而有研究已經(jīng)證明周圍環(huán)境溫度上升4-10℃，2μs內(nèi)不會對細(xì)胞產(chǎn)生致命損傷［26］，熱會在細(xì)胞膜上造成瞬時的孔，但會在打印后2h內(nèi)修復(fù)，且孔有利于基因和大顆粒的遞送［27］。蛋白質(zhì)類的水凝膠多用酶促交聯(lián)，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是較溫和；CaCl2是最常用的海藻酸鹽離子交聯(lián)劑［6］。對于離子交聯(lián)和酶促交聯(lián)來說，如果在打印過程中交聯(lián)，則需要共擠出生物墨水和交聯(lián)劑，或依次沉積兩種組分；若在打印后交聯(lián)，則需要多種交聯(lián)機(jī)制的混合物［28］。例如Chen等［29］用雙交聯(lián)的方式，先后用轉(zhuǎn)谷酰胺酶TG交聯(lián)明膠并用Ca2+溶液交聯(lián)藻酸鹽，制備了藻酸鹽/明膠水凝膠的互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)（interpenetrating polymer network，IPN），提高了構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)完整性。

2.2.2 復(fù)合材料 復(fù)合材料結(jié)合了每種組分的優(yōu)點(diǎn)，在機(jī)械強(qiáng)度、可打印性、生物相容性和凝膠化特性方面有所提升［15］。例如海藻酸鹽雖然有高吸水性、生物相容性和生物降解性，但它是一種相對生物惰性的材料，缺乏細(xì)胞粘附配體。但通過對其進(jìn)行修飾，例如將RGD肽偶聯(lián)到海藻酸鹽上以產(chǎn)生細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)［4］。

納米粒子（nanoparticles）由于量子效應(yīng)和較大的表面積對體積比，具有各種尺寸、形態(tài)和表面修飾的納米材料具有獨(dú)特的物理、機(jī)械、光學(xué)、化學(xué)和生物特性，可以用來修飾支架的性能，比如機(jī)械性能、骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)和骨整合性能，還可以用于藥物傳遞［30,31］。納米羥基磷灰石（nHA）可以以粉末或涂層的形式與殼聚糖、膠原、海藻酸鹽、明膠等材料復(fù)合［31,32］。Gao等人［33］將含hMSCs的PEGDMA材料與nHA用熱噴墨技術(shù)共打印，發(fā)現(xiàn)HA可顯著刺激hMSCs的成骨分化以及成骨ECM的產(chǎn)生，PEG-nHA組中膠原蛋白的產(chǎn)生最多，堿性磷酸酶的活性最高。Miina等人［34］在明膠-海藻酸鹽生物墨水中加入木質(zhì)纖維素納米纖絲（wood-based cellulose nanofibrils，CNF）和生物活性玻璃（BG），發(fā)現(xiàn)BG有刺激早期成骨作用，但生物墨水的粘度也隨之增加導(dǎo)致剪切應(yīng)力增加，細(xì)胞活力下降，加入CNF后依賴其剪切稀化特性降低粘度，改善流變性，提高了可打印性。G.Cidonio等人［35］將帶靜電的納米硅酸鹽（nSi）加入到納米處理離子共價纏結(jié)（nanoengineered ionic covalent entanglement，NICE）生物墨水中，共價交聯(lián)的彈性GelMA和離子交聯(lián)的脆性κ卡拉膠（κCA）通過應(yīng)力分散提高了機(jī)械強(qiáng)度和粘度，nSi與前兩者形成非共價靜電鍵，提高了剪切稀化能力，且在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平誘導(dǎo)成骨分化。碳納米管（Carbon Nanotubes，CNTs）［36］是石墨空心管狀結(jié)構(gòu)，由通過sp2鍵連接的碳原子片制成，具有出色的電學(xué)性能和較高的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性［30］，可以改善支架的機(jī)械性能［37］。雖然它有一定的細(xì)胞毒性，但有研究用CNT和明膠、海藻酸鹽做混合材料打印血管結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)少量（0.5%，w/v%）應(yīng)用對細(xì)胞毒性很小［38］。納米纖維素由模仿膠原纖維網(wǎng)的納米纖維組成，含水量高，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和剪切稀化能力［3］，如上文研究［34］中所述可以改善生物墨水的可打印性。硅酸鎂鋰（Laponite，LPN）是一種合成納米黏土，可以與蛋白質(zhì)相互作用，刺激成骨作用；改善生物墨水的機(jī)械強(qiáng)度，提高生物墨水的粘度和尺寸穩(wěn)定性；改變流變特性，剪切稀化能力［24,39］。Yang-Hee等人［24］將LPN與GelMA結(jié)合形成復(fù)合生物墨水，hBMSC活力在LPN-GelMA中培養(yǎng)21d沒有顯著變化且能觀察到增殖，而hBMSC活力在GelMA中顯著下降。載hBMSC的LPN-GelMA支架中有礦化結(jié)節(jié)形成，且LPN-GelMA-VEGF支架顯示出比GelMA-VEGF更好的血管穿透性。Zhao等人［40］用羧甲基殼聚糖（CMCh）和無定形磷酸鈣（ACP）制成復(fù)合納米顆粒水凝膠支架。ACP相比于磷酸三鈣（TCP）和HA來說有更好的骨傳導(dǎo)性和生物降解性，但高度不穩(wěn)定，故利用殼聚糖的陰離子衍生物CMCh穩(wěn)定ACP 納米顆粒。該支架顯著增強(qiáng)骨形成蛋白-9（BMP-9）誘導(dǎo)的體內(nèi)骨形成的效率和成熟度，同時抑制長期異位成骨中發(fā)生的骨吸收。

2.2.3 生長因子 還可以根據(jù)需求在水凝膠中添加相應(yīng)的生長因子，例如骨誘導(dǎo)劑地塞米松、骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP、骨形成肽BFP-1，血管生成誘導(dǎo)劑VEGF等［35,37］。Luo等人［41］研究了雙肽負(fù)載的海藻酸鹽基水凝膠系統(tǒng)。因海藻酸鹽不含細(xì)胞粘附配體，故用整合素結(jié)合配體（RGD肽）與海藻酸鹽聚合物鏈偶聯(lián)，增強(qiáng)細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增后，載有BFP-1的中孔二氧化硅納米粒子（MSN）pep@MSNs 釋放BFP-1，誘導(dǎo)hMSC 成骨分化。雖然生長因子如BFP-1、BMP-2可以刺激成骨，但半衰期短，很快被血液清除。如果要實(shí)現(xiàn)生長因子在缺損部位的高濃度持續(xù)刺激，同時避免大劑量使用的副作用（水腫、神經(jīng)刺激等），可以通過（1）轉(zhuǎn)運(yùn)載體中BMP-2蛋白的物理結(jié)合或捕獲來控制釋放；（2）運(yùn)用基于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞基因工程［42,43］。例如將BMP-2封裝在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微粒［42］或殼聚糖微球中［37］，能持續(xù)釋放BMP-2超過30d；或用明膠水凝膠［42］捕獲BMP-2，也可以持續(xù)釋放BMP-2。殼聚糖這種天然陽離子聚合物可作為DNA質(zhì)粒的有效載體，轉(zhuǎn)染外源基因到人體細(xì)胞中［37］，Zeng等人［44,52］將含有BMP-4和血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR1）基因的重組質(zhì)粒與殼聚糖制備成納米顆粒，植入骨缺損兔子中，與對照組相比骨缺損修復(fù)速度更快，新生骨質(zhì)更多。Lin等人［42］將BMP-2慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的hBMSCs封裝于明膠水凝膠中，用基于可見光的立體光刻技術(shù)打印了支架。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出較直接加入BMP-2的對照組更有效地保持BMP-2濃度和生物活性，促進(jìn)更快更有效的骨形成（成骨基因的表達(dá)以及成骨的體積及質(zhì)量均有顯著性差異）。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO），是一種含多種官能團(tuán)的芳香烴，尺寸通常在納米至數(shù)微米。Goeun等人［45］在3w/v%的海藻酸鹽中混合0.5mg/mL GO，提高了生物墨水的可打印性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、成骨誘導(dǎo)性。

3.研究進(jìn)展

3D生物打印骨組織工程支架一直以來的挑戰(zhàn)是水凝膠機(jī)械強(qiáng)度不足以及血管化［7,15］。機(jī)械強(qiáng)度可以通過上述復(fù)合材料的方式增強(qiáng)，也有學(xué)者通過制造生物陶瓷-載細(xì)胞水凝膠雙相支架構(gòu)建支架［46,47］，初步解決了這個問題。

在過去的20年里，人們一致認(rèn)為重建能保證穩(wěn)定灌注的多級血管網(wǎng)對于成功建造大多數(shù)復(fù)雜組織是十分重要的［48,49］。一直以來骨組織工程面臨的挑戰(zhàn)就是構(gòu)建體的血管化。大型結(jié)構(gòu)的構(gòu)建存在幾何結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組成多樣以及血管化的限制。雖然在幾何復(fù)雜性方面取得了重大進(jìn)展，多組分結(jié)構(gòu)也可以通過多噴嘴打印解決，但血管化的問題仍然困擾著研究者們，如同組織工程中的圣杯［50,51］。盡管通過單純地?fù)饺隫EGF等因子可以一定程度上促進(jìn)血管生成，但是還是需要研發(fā)一些特殊的打印方法如結(jié)構(gòu)仿生、時空控制釋放生物活性因子等，以完成復(fù)雜且互相連通的血管網(wǎng)絡(luò)的形成。Irene等人［52］用順序誘導(dǎo)法，先打印明膠-nHA支架，接種hMSC后先后在生長培養(yǎng)基（GM）和成骨培養(yǎng)基（OM）中培養(yǎng)1周和2周，獲得含有預(yù)分化的hMSC的支架，再將含有HUVEC：hMSC為4∶1的GelMA-纖維蛋白水凝膠填充到支架的大孔中，光交聯(lián)后在含或不含成骨培養(yǎng)基的內(nèi)皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。發(fā)現(xiàn)在有良好的骨生成的同時成功地誘導(dǎo)了穩(wěn)定的復(fù)雜且互連的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)形成。水凝膠中未分化的hMSC作為周細(xì)胞穩(wěn)定了脈管系統(tǒng)。Takahisa等人［53］通過兩步式數(shù)字光處理（digital light processing，DLP）技術(shù)，先在外圍打印含磷酸八鈣（OCP）的GelMA環(huán)模仿骨皮質(zhì)，之后在中央打印包含HUVEC球體的GelMA環(huán)模仿骨髓空間。HUVEC可以在GelMA水凝膠中形成3D毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)。植入缺損部位后，均勻地嵌在GelMA中的OCP刺激間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化，預(yù)血管化將促進(jìn)骨組織修復(fù)，血管化后宿主中遷移的MSCs或前成骨細(xì)胞可在OCP 的影響下分化為成骨細(xì)胞。Charlotte等人［54］用裝載兩種——成骨（MSC）和血管源性（大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞）——獨(dú)立的細(xì)胞群的纖維蛋白生物墨水與PCL共打印制備3D生物打印雙相類骨支架。纖維蛋白具有誘導(dǎo)血管生成并促進(jìn)細(xì)胞附著和增殖以及體外促進(jìn)成骨的潛力，但是缺乏機(jī)械強(qiáng)度。機(jī)械強(qiáng)度高且多孔的基質(zhì)PCL與纖維蛋白水凝膠共打印，降低了降解速率，維持長時間的機(jī)械穩(wěn)定性，允許新的骨骼形成。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)出更好的成骨能力和血管生成能力。Batzaya等人［55］用基于擠出的生物打印制造了包含可灌注血管腔的微結(jié)構(gòu)類骨組織構(gòu)建體。該構(gòu)建體由28個圓柱體組成一個三棱柱，中央的一個圓柱體由裝載HUVECs和hMSCs的低質(zhì)量分?jǐn)?shù)GelMA（GelMALOW）的生物墨水打印，打印外圍圓柱體的生物墨水由裝載hMSCs的共價結(jié)合VEGF的高質(zhì)量分?jǐn)?shù)GelMA（GelMAHIGH）組成，同時含有nSi以誘導(dǎo)hMSCs的成骨分化，VEGF的濃度從內(nèi)到外逐漸增高。GelMALOW較GelMAHIGH降解速率高，體外培養(yǎng)12天后內(nèi)芯降解留下開放的管腔和500μm的可灌注通道，HUVECs和hMSCs遷移到該通道的內(nèi)表面，可灌注通道充當(dāng)中央血管；構(gòu)建體外圍的nSi以及成骨培養(yǎng)基的持續(xù)灌注誘導(dǎo)了的hMSC分化為骨組織。在體外研究中觀察到了毛細(xì)血管狀網(wǎng)絡(luò)形成。

4.總結(jié)與展望

盡管3D打印在過去的幾十年里已經(jīng)發(fā)展得較為成熟，但可以在高溫、高壓力等條件下進(jìn)行的3D打印的難度無法與載細(xì)胞的3D生物打印相提并論。3D生物打印皮膚、肝臟等組織器官已經(jīng)成功設(shè)計并植入人體內(nèi)，但骨組織工程的3D生物打印由于其對機(jī)械強(qiáng)度的要求尚處于起步階段且僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走。

目前3D生物打印已經(jīng)走向骨組織工程的商業(yè)化和最終進(jìn)展階段，盡管該領(lǐng)域取得了顯著的進(jìn)步，但為復(fù)雜的組織制造設(shè)計合適的生物墨水仍然是一個長期的挑戰(zhàn)。其中3D生物打印技術(shù)已經(jīng)形成較為成熟的體系，這一方面的改進(jìn)是通過優(yōu)化打印參數(shù)，在兼顧細(xì)胞相容性的同時提高可打印性；而對生物墨水和打印方法的創(chuàng)新是探索同時滿足機(jī)械強(qiáng)度和良好的細(xì)胞相容性以及血管化這兩個主要方面。載細(xì)胞打印將生物墨水限定于水凝膠，通過結(jié)合多種新型材料、生物因子以改善機(jī)械性能、可打印性、細(xì)胞活力、成骨能力和血管化能力。而對打印方法的改進(jìn)多數(shù)基于對天然骨小梁和（或）血管結(jié)構(gòu)的模仿，結(jié)合水凝膠與其他聚合物打印雙相甚至支架，在空間上制造生物因子濃度梯度，誘導(dǎo)支架在成熟過程中形成目標(biāo)組織。

對于骨組織工程的一大難題——血管化——也已經(jīng)有了許多新思路，通過順序誘導(dǎo)或多相材料共同培養(yǎng)等方法模仿天然的復(fù)雜骨結(jié)構(gòu)。甚至可以將時間概念與3D生物打印結(jié)合，也就是4D生物打印，通過研發(fā)刺激響應(yīng)型水凝膠，在3D生物打印過程結(jié)束后可以自發(fā)地在各種刺激下改變其特性，更順應(yīng)體內(nèi)微環(huán)境［23,36,56,57］。但目前仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，距離實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。在不遠(yuǎn)的將來，我們?nèi)孕枰嘌芯縼韺?shí)現(xiàn)將具有良好血管化能力的3D生物打印骨組織工程支架應(yīng)用到臨床。