劉柯慧 王暉

丙型肝炎病毒(HCV)感染是肝臟疾病發(fā)生和死亡的主要原因之一。全球有7 100萬慢性丙型肝炎(CHC)患者，每年死于HCV感染相關(guān)疾病的人數(shù)不少于40萬[1]。自HCV發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于其病毒學(xué)、免疫發(fā)病機(jī)制、治療等方面的研究都取得了巨大進(jìn)展。直接作用抗病毒藥物(DAA)的研發(fā)和臨床應(yīng)用革新了CHC的治療策略，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率幾乎達(dá)到100%[1]。然而，要實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織2030年全球性根除CHC這一目標(biāo)，仍需要預(yù)防性疫苗。本文主要探討HCV感染后T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，尤其是影響病毒免疫清除的相關(guān)因素、免疫失敗的機(jī)制等，這些均為成功設(shè)計(jì)疫苗需要考慮的因素。

人類和黑猩猩急性HCV感染的研究證實(shí)，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與HCV感染后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。HCV特異性T細(xì)胞的出現(xiàn)與病毒清除和肝臟疾病的發(fā)生相關(guān)[2]。適應(yīng)性免疫包括B細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞均參與病毒清除。有報(bào)道多克隆的特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞在感染早期已出現(xiàn)，這一現(xiàn)象甚至不因感染的不同轉(zhuǎn)歸而有差異[3]。臨床上，T細(xì)胞免疫失敗似乎很少發(fā)生，大多數(shù)患者均能誘導(dǎo)HCV特異性CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而，與自發(fā)清除病毒的患者相比，CHC患者的T細(xì)胞免疫反應(yīng)在頻率和廣度上下降更快[3]。因此，除了充分啟動(dòng)外，持續(xù)的病毒特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)才是實(shí)現(xiàn)病毒清除的關(guān)鍵因素。表型分析顯示，病毒特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞均表達(dá)活化標(biāo)記物和抑制性受體，如程序性細(xì)胞死亡-1 (PD-1)，且與轉(zhuǎn)歸無關(guān)，但表達(dá)水平隨病毒的清除而下降。此外，HCV特異性CD8+T細(xì)胞高表達(dá)CD127與病毒清除相關(guān)[4]。轉(zhuǎn)錄因子T-bet調(diào)節(jié)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞干擾素和細(xì)胞毒性因子的產(chǎn)生，并與病毒感染后轉(zhuǎn)歸呈正相關(guān)[5]。在慢性病毒感染狀態(tài)，T細(xì)胞向記憶T細(xì)胞的分化被阻斷，病毒特異性CD8+T細(xì)胞只保持低頻率的激活狀態(tài)并表達(dá)PD-1及其他抑制性受體。另外T細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)錄在急性病毒清除和持續(xù)病毒感染這兩種狀態(tài)之間也存在差異。在急性持續(xù)性感染早期，病毒特異性CD8+T細(xì)胞的代謝、核小體和免疫基因等功能失調(diào)，與缺乏CD4+T細(xì)胞的輔助有關(guān)[6]。耗竭的病毒特異性CD8+T細(xì)胞中也顯示糖酵解和線粒體功能受損相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子顯著上調(diào)[7]。盡管有這些重要發(fā)現(xiàn)，但確切的免疫因素及其對病毒清除與持續(xù)病毒感染的作用機(jī)制仍未完全闡明。

對人和黑猩猩的研究表明[2]，與初次感染相比，再次感染后實(shí)現(xiàn)病毒清除的可能性更高，這與記憶性病毒特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞的快速出現(xiàn)有關(guān)。值得注意的是，在缺乏足夠CD4+T細(xì)胞輔助的情況下，HCV感染的慢性化與病毒特異性CD8+T細(xì)胞靶向的MHCⅠ類表位出現(xiàn)病毒逃逸突變有關(guān)。另外CD8+T細(xì)胞的耗竭可導(dǎo)致病毒血癥持續(xù)時(shí)間的延長[8]。這些結(jié)果表明，CD8+T細(xì)胞是清除病毒的主要效應(yīng)細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞的輔助亦至關(guān)重要，它可維持CD8+T細(xì)胞的免疫效應(yīng)，防止病毒在CD8+T細(xì)胞靶向的表位內(nèi)出現(xiàn)逃逸突變。這些結(jié)果進(jìn)一步激發(fā)了人們對HCV T細(xì)胞疫苗的興趣，疫苗雖然不能預(yù)防再次感染，但能夠在再次感染后誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，從而增加病毒清除的可能性。但必須指出的是，即使再次暴露于同源病毒，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫保護(hù)可能會(huì)失敗。因此，明確T細(xì)胞衰竭的機(jī)制是成功研制T細(xì)胞為基礎(chǔ)的HCV疫苗的前提。

HCV特異性CD8+T細(xì)胞的免疫失敗主要?dú)w因于兩種機(jī)制：T細(xì)胞衰竭和病毒逃逸。T細(xì)胞衰竭是在抑制信號(hào)背景下抗原慢性刺激的結(jié)果，是嚴(yán)重喪失效應(yīng)功能的狀態(tài)，其特征為多個(gè)抑制性受體高表達(dá)、細(xì)胞代謝改變、生存受損；并表現(xiàn)為獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄程序，包括關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的改變和潛在、獨(dú)特的表觀遺傳性。從CHC患者中分離的HCV特異性CD8+T細(xì)胞大多具有這些特征[9]。在LCMV小鼠模型中已首次報(bào)道了轉(zhuǎn)錄因子TCF-1和TOX的重要生物學(xué)作用。TCF-1能夠維持病毒特異性CD8+T細(xì)胞抵抗病毒感染的慢性化[10]； TOX是免疫細(xì)胞衰竭的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，可將持久性抗原刺激轉(zhuǎn)化為特定的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳程序[11]。TOX的表達(dá)與PD-1等抑制性受體的表達(dá)密切相關(guān)。具體地說，TOX過度表達(dá)導(dǎo)致衰竭的CD8+T細(xì)胞的祖細(xì)胞亞群更易存活[11]。因此，從小鼠模型到人類免疫系統(tǒng)的新發(fā)現(xiàn)提示，HCV感染是重要的人體免疫學(xué)模型。

病毒逃逸突變是HCV應(yīng)對CD8+T細(xì)胞免疫清除的結(jié)果，通常發(fā)生在感染后的前6個(gè)月。逃逸突變可導(dǎo)致蛋白酶功能的改變、肽表位與MHC I類分子的結(jié)合位點(diǎn)減少或T細(xì)胞受體的識(shí)別受損，這些均抑制CD8+T細(xì)胞對病毒的識(shí)別。長期慢性感染過程中，發(fā)生病毒逃逸突變并不常見，反映了該階段缺乏T細(xì)胞介導(dǎo)的選擇壓力[12]。病毒逃逸將在病毒特異性CD8+T細(xì)胞表型上留下印記[9]，也會(huì)對丙型肝炎病毒的復(fù)制能力產(chǎn)生影響。這種適應(yīng)性突變有助于特定HLA類型的保護(hù)作用，例如HLA-B27、-B57或-A3類型，其與高水平的自發(fā)HCV清除相關(guān)[13]。顯然，不易耐受序列變異的病毒保守區(qū)域是T細(xì)胞疫苗的最佳靶點(diǎn)。近期研究表明，疫苗可以誘導(dǎo)T細(xì)胞對病毒的保守區(qū)域產(chǎn)生免疫效應(yīng)[14]。CD8+T細(xì)胞衰竭的兩種機(jī)制，均與CD4+T細(xì)胞的反應(yīng)直接相關(guān)。慢性感染時(shí)，CD4+T細(xì)胞僅以非常低的頻率存在，且增殖能力受損、PD-1和CTLA-4[3]等抑制性受體高表達(dá)。因此，缺乏足夠的CD4+T細(xì)胞的輔助可能是導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞衰竭的主要因素之一。目前尚不清楚為什么持續(xù)感染狀態(tài)下CD4+T細(xì)胞不能維持應(yīng)答。

DAA治療后適應(yīng)性免疫恢復(fù)的關(guān)鍵問題是抗原被去除后，HCV特異性CD8+T細(xì)胞是否仍然耗盡、能否恢復(fù)其效應(yīng)功能。這一問題不僅對疫苗設(shè)計(jì)，而且對研究抗原特異性T細(xì)胞免疫都非常關(guān)鍵。通過研究DAA治療患者的HCV特異性CD8+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)以TCF-1+CD127+PD-1+表達(dá)為特征的記憶樣CD8+T細(xì)胞的祖細(xì)胞在HCV治愈后仍能被檢測到，從而實(shí)現(xiàn)HCV治愈后特異性CD8+T細(xì)胞功能的恢復(fù)[15]。但在病毒復(fù)發(fā)后體內(nèi)抗原再激活的情況下，TCF1+CD127+PD-1+T細(xì)胞群體增多，并伴隨著終末衰竭的Eomeshi TCF1-CD127-PD-1hi HCV特異性CD8+T細(xì)胞的出現(xiàn)，表明至少在TCF1+CD127+PD-1亞群中存在某種記憶潛能[15]。但這些重新出現(xiàn)的T細(xì)胞未能清除病毒，提示DAA治療后持續(xù)存在的HCV特異性CD8+T細(xì)胞可能有缺陷，不能簡單地通過清除病毒來恢復(fù)其功能。另一項(xiàng)研究證實(shí)了此觀點(diǎn)，在DAA治療前后CHC患者中，在HCV特異性CD8+T細(xì)胞中均可檢測到?jīng)Q定CD8+T細(xì)胞衰竭的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TOX，但在HCV感染自發(fā)清除的患者中未檢測到[11]。另外，對于HCV特異性CD4+T細(xì)胞的研究也獲得了相似的結(jié)果，這些細(xì)胞在DAA治療后仍保持非常低的頻率[16]。

上述研究為我們提供了HCV T細(xì)胞疫苗的重要研究基礎(chǔ)。預(yù)防性T細(xì)胞疫苗的概念首先在黑猩猩模型中得到驗(yàn)證。接種表達(dá)所有非結(jié)構(gòu)蛋白的重組缺陷型腺病毒疫苗能夠保護(hù)黑猩猩免于發(fā)生急性丙型肝炎[17]。接種疫苗后T細(xì)胞的反應(yīng)出現(xiàn)更早、功能更強(qiáng)、持續(xù)頻率更高。兩種設(shè)計(jì)用于預(yù)防HCV感染的T細(xì)胞疫苗也已在人體內(nèi)進(jìn)行了免疫原性試驗(yàn)。一種含有HCV核心蛋白和ISCOMATRIX佐劑的疫苗在健康志愿者中僅誘導(dǎo)出較弱的免疫反應(yīng)[18]。另一種基于復(fù)制缺陷的猴腺病毒載體(ChAd3)和編碼NS3、NS4、NS5A、NS5B的改良安卡拉痘苗載體的異種增強(qiáng)疫苗，在I期健康志愿者的研究中發(fā)現(xiàn)能夠持續(xù)誘導(dǎo)記憶和效應(yīng)T細(xì)胞群[19]。疫苗誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群在其表型和轉(zhuǎn)錄譜上與記憶性T細(xì)胞相似，這些細(xì)胞在自發(fā)分離后保持高CD127和低Eomes表達(dá)，表明它們在遇到病毒后可迅速擴(kuò)增[19]。但隨后的II期臨床研究并未顯示出該疫苗對病毒感染具有持續(xù)保護(hù)作用[20]。這一研究結(jié)果至少表明疫苗介導(dǎo)了一些免疫效應(yīng)，還需要詳細(xì)的分析來解釋這些疫苗接種后T細(xì)胞免疫失敗的機(jī)制。疫苗設(shè)計(jì)的另一個(gè)問題是病毒不同基因型和T細(xì)胞表位的復(fù)雜性，僅覆蓋一個(gè)基因型的疫苗很難解決所有問題。

目前仍有許多問題亟待解答，例如：實(shí)現(xiàn)CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的病毒清除的機(jī)制是什么？為什么這些細(xì)胞在持續(xù)感染中不能維持或只能維持在低頻率？如何才能最好地誘導(dǎo)保護(hù)性免疫？B細(xì)胞和中和抗體的作用是什么？對急性和慢性HCV感染的患者以及接受DAA治療或接種疫苗人群的深入研究，才能更好地破譯保護(hù)性T細(xì)胞免疫的分子、代謝和轉(zhuǎn)錄特征，從而提高對不同CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群及肝炎病毒破壞機(jī)體免疫機(jī)制的新認(rèn)知，促進(jìn)疫苗研發(fā)。