謝凌峰， 賀莉雅， 王獻哲， 嚴佳寶， 袁娟娜， 范瑞強， 謝婷

1.廣東省中醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006

白念珠菌(Candidaalbicans)是一種臨床常見的條件致病菌，近年來因為激素、生物制劑的廣泛應(yīng)用，以及癌癥、HIV和糖尿病發(fā)病率升高等，患者免疫力下降，白念珠菌發(fā)病率不斷升高[1-3]。而隨著抗真菌藥物在臨床的大量使用，白念珠菌臨床耐藥性的問題也日漸突出，現(xiàn)在常見的抗真菌藥物面臨耐藥、治療周期長和肝腎毒性等問題[4]。中藥單體成分有良好的抗真菌作用，且具有毒副作用小、來源廣泛、較少出現(xiàn)耐藥等優(yōu)點，可以在抗白念珠菌中發(fā)揮重要作用。

中醫(yī)認為白念珠菌感染引起的疾病有外因和內(nèi)因兩種，外因由寒濕襲表、濕郁蘊熱、濕熱阻滯肌表所致；內(nèi)因由脾腎虧虛、內(nèi)生濕濁、蘊而生蟲所致。臨床常用具清熱、祛濕、殺蟲、補益脾腎等功效的藥物。中藥單體成分是通過精油提取、乙醇提取、酸水溶液提取、超聲提取等方法，從中藥中提取得到的主要有效成分之一。本文綜述中藥單體成分抗白念珠菌實驗研究進展。

1 清熱藥

1.1 小檗堿

黃連、黃柏具有清熱燥濕的功效，小檗堿是其主要有效成分之一，因提取時常用鹽酸提取，又叫鹽酸小檗堿，具有廣泛的抗菌作用。早期的體外實驗顯示鹽酸小檗堿對白念珠菌浮游菌的MIC值平均為32 μg/mL[5]。白念珠菌的毒力與其形成菌絲、細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化以及細胞壁完整性密切相關(guān)，楊玉等[6]發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿在64～512 μg/mL時可以降低白念珠菌菌絲代謝；在256～512 μg/mL時可以抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化；512 μg/mL以上則可以明顯破壞白念珠菌細胞壁完整性；通過實時熒光定量技術(shù)發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以下調(diào)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因ECE1的表達水平2.72倍；還可以降低β-葡聚糖合成酶調(diào)控相關(guān)基因FKS1和FKS2的表達，暴露β-葡聚糖進而破壞細胞壁完整性。雍江堰等[7]發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿和氟康唑?qū)σ种瓢啄钪榫哂袇f(xié)同作用，通過免疫熒光標記法、流式細胞技術(shù)觀測白念珠菌Ca2+內(nèi)流情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組、小檗堿組可以觀測到Ca2+內(nèi)流現(xiàn)象，而氟康唑組、空白組無該現(xiàn)象，分析小檗堿抗白念機制可能與鹽酸小檗堿破壞白念珠菌的細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)有關(guān);進一步通過qRT-PCR技術(shù)，檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組菌株的基因YVC1表達量比鹽酸小檗堿組和氟康唑組分別高1.62倍、6.74倍，聯(lián)用組和鹽酸小檗堿組菌株的鈣泵相關(guān)基因PMC1表達下調(diào)，而氟康唑組表達上調(diào)，提示其協(xié)同機制與影響基因YVC1、PMC1的表達相關(guān)。

1.2 黃芩苷

黃芩具有清熱燥濕的功效。黃芩苷是源于黃芩的黃酮類化合物，常用水提法提取，對多種細菌、真菌、病毒都有抑制作用。早期的研究按照M27-A方案測定黃芩苷對白念珠菌MIC為1 mg/mL[8]。XTT法檢測黃芩苷對白念珠菌生物膜活性影響，結(jié)果顯示黃芩苷在8 mg/mL時可以使白念生物膜活性和生物量分別減少(90.6±5.2)%和(90.3±2.6)%[9]。采用流式細胞技術(shù)檢測出黃芩苷可以提高白念珠菌浮游菌的凋亡率，利用同位素標記法測定前體3H-UdR、3H-TdR和3H-leucine，可發(fā)現(xiàn)白念珠菌浮游菌對這三種前體的攝取效率下降，提示其DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成下降，進一步測定其琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性，發(fā)現(xiàn)黃芩苷誘導白念珠菌浮游菌凋亡機制可能與降低其活性有關(guān)[10]。有實驗發(fā)現(xiàn)加入黃芩苷后白念珠菌生物膜的凋亡率升高，其機制與活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)升高、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)下降、細胞色素C由線粒體釋放入細胞質(zhì)有關(guān)，進一步分析其中Ras-cAMP-PKA通路相關(guān)基因的表達水平，結(jié)果顯示RAS1、TPK1表達上升，CAP1、PDE2表達下降[11]。黃芩苷與氟康唑聯(lián)用抗白念珠菌浮游菌的FICI均值為0.41之間，對白念珠菌生物膜形成的FICI介于0.16～0.5之間，黃芩苷聯(lián)合氟康唑使黏附相關(guān)基因ALS1、ALS3、EAP1、SUN41和CSH1的表達分別下調(diào)6%、51%、24%、13%和39%[12]。

1.3 苦參堿

苦參具有清熱燥濕、殺蟲的功效；山豆根具有清熱解毒的功效，通過醇提法和酸提法從苦參、山豆根提取的中藥單體成分苦參堿是其主要活性成分之一，具有多種藥理作用。SHAO等[13]通過微量稀釋法測定苦參堿MIC80為1 mg/mL，苦參堿與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同作用(FICI=0.197)；通過Spider培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察白念珠菌菌絲生長,發(fā)現(xiàn)1 mg/mL苦參堿可以抑制白念珠菌菌絲生長，進一步通過qRT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)苦參堿可以使菌絲形成相關(guān)基因ALS3、SUN41和PBS2下調(diào)29%、45%和61%。

1.4 穿心蓮內(nèi)酯

穿心蓮內(nèi)酯是從清熱解毒類中藥穿心蓮中提取的二萜內(nèi)酯類化合物，具有消炎抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種作用。穿心蓮內(nèi)酯可以抑制黏附基因ALS3、EAP1表達水平，從而抑制白念珠菌早期(2 h)的黏附作用，但對基因ALS1的表達水平具有促進作用[14]。施高翔等[15]研究穿心蓮內(nèi)酯對白念珠菌生物膜分散的影響，結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯在250～1 000 μg/mL能劑量依賴性誘導白念珠菌生物膜分散，進一步研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可以提高促分散基因HSP90表達，同時抑制抗分散基因UME6表達，雖然在該研究中另一個促分散基因PES1表達受到抑制，但穿心蓮內(nèi)酯總體發(fā)揮促白念珠菌生物膜分散的效應(yīng)。

2 祛濕藥

2.1 漢防己甲素

粉防己又叫漢防己，是防己科植物，具有祛濕祛風的作用。漢防己甲素是來自于粉防己根部的生物堿，具有廣泛的藥理活性。在體外實驗中，漢防己甲素對氟康唑抗白念珠菌生物膜的最初期(0 h)、早期(4 h)有增效作用；而中期(24 h)、成熟期(48 h)無增效活性[16]。動物實驗發(fā)現(xiàn)漢防己甲素在91 mg/kg時對系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠具有治療作用，其機制與調(diào)節(jié)細胞免疫有關(guān)[17]。漢防己甲素與氟康唑在抑制播散性小鼠模型中白念珠菌感染具有協(xié)同作用(FICI<0.05)，且在CDR1/CDR2、MDR1過表達的菌株中，兩者協(xié)同作用表現(xiàn)更強，提示其抗耐藥機制可能與白念珠菌轉(zhuǎn)運功能有關(guān)[18]。

2.2 土槿乙酸

中藥土槿皮具有祛濕、殺蟲的功效。土槿乙酸(PAB)是其主要有效成分之一，具有抗菌作用。土槿乙酸對白念珠菌MIC為32～128 μg/mL，且與氟康唑聯(lián)合抗白念珠菌有協(xié)同作用(FICI<0.05)[19]；對白念珠菌出芽生長和生物膜形成過程有抑制作用(SMIC50為256～512 μg/mL)[20]。劉麗英等[21]通過HPLC法測定白念珠菌細胞膜中麥角淄醇含量，結(jié)果顯示PAB抑菌活性機制為抑制真菌的麥角甾醇生物合成。在槿乙酸增加油相和表面活性劑之后得到PAB-ME凝膠，體外實驗和白念珠菌感染豚鼠的體內(nèi)實驗中均表現(xiàn)出抗真菌活性[22]，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

3 其他

3.1 大蒜素

大蒜素是百合科植物，具有抑菌、殺菌等作用，是自然界中的植物廣譜抗菌素。中醫(yī)認為大蒜具有解毒殺蟲的作用，其有效成分是大蒜素。CLSI-M27-A3微量液基稀釋法檢測顯示大蒜素對白念珠菌的最小抑菌濃度為25 μg/mL，通過倒置顯微鏡觀察大蒜素對Spider培養(yǎng)基中白念珠菌形成的影響，同時用qRT-PCR法檢驗其相關(guān)基因表達水平變化，發(fā)現(xiàn)大蒜素在25～100 μg/mL濃度能有效抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化，其作用機制可能與相關(guān)基因HWP1、ALS1、EFG1、PDE2表達水平有關(guān)[23]。XTT法檢測顯示大蒜素對白念珠菌生物膜的SMIC80為64～256 μg/mL，且白念生物膜相關(guān)基因ALS1等表達均下調(diào)[24]。體外實驗發(fā)現(xiàn)大蒜素和制霉菌素在對白念生長的抑制中有協(xié)同作用(FICI≤0.5)[25]。在白念感染免疫抑制小鼠的體內(nèi)實驗中，利用雙抗體夾心ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)大蒜素可以提高小鼠體液中IgG、IL-4、IL-12的水平[26]，增強免疫抑制小鼠的免疫功能，增加機體抗白念珠菌的能力，為臨床研究提供參考。

3.2 丁香酚

丁香具有補腎助陽的功效，丁香酚是丁香提取物丁香精油的主要有效成分[27]，具有消炎、抗菌的作用。高原等[28]通過二倍稀釋法、XTT法測定丁香酚對白念珠菌的MIC為1.64 mg/mL，對白念珠菌作用24 h的SMIC50為9.80 mg/mL。丁香酚與氟康唑?qū)σ种聘∮涡桶啄钪榫袇f(xié)同作用(FICI=0.313)[29]；與兩性霉素B對抗白念珠菌具有協(xié)同作用(FICI=0.27)，其機制可能與細胞質(zhì)中細胞色素C的增加，細胞內(nèi)鈣離子濃度上升等誘導細胞凋亡因素相關(guān)[30]；對臨床分離的氟康唑耐藥白念珠菌具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，在第7～8代恢復(fù)對氟康唑敏感[31]。

3.3 白藜蘆醇等

白藜蘆醇可以誘導白念珠菌細胞凋亡，其機制可能與提高細胞內(nèi)ROS水平和降低MMP水平有關(guān)[32]。紫檀芪通過聚乳酸-羥基乙酸納米顆粒搭載時對白念珠菌生物膜BMIC50為16 μg/mL，其抑制生物膜活性高于游離的PTB[33]，提示搭載合適的載體后，可以增強有效成分對白念珠菌的抑制作用[34]。

芒果苷與氟康唑?qū)拱啄钣袇f(xié)同作用(FICI<0.2)，其機制與下調(diào)白念珠菌外排泵相關(guān)基因CDR1、MDR1的表達有關(guān)[35]。

肉桂醇對白念珠菌的MIC為160～320 μg/mL，與氟康唑具有協(xié)同作用(FICI=0.375)，進一步實驗檢測發(fā)現(xiàn)肉桂醇與氟康唑合用可以減少白念珠菌毒力因子磷脂酶B的釋放，機制與下調(diào)其調(diào)控基因PLB1表達有關(guān)[36]。

4 中藥單體成分抗白念珠菌機制

白念珠菌的凋亡受許多因素的影響。線粒體是為細胞供能的重要細胞器，SDH是三羧酸循環(huán)中唯一與線粒體內(nèi)膜結(jié)合的酶，可以在一定程度上反應(yīng)細胞的能量供應(yīng)能力，中藥單體成分黃芩苷加入后，白念珠菌的SDH活性下降，細胞功能受損，但目前的研究表明黃芩苷對呼吸鏈中心酶——細胞色素C氧化酶(cytochromec oxidase,COX)影響不顯著。ROS水平、MMP水平變化是白念珠菌凋亡的早期表現(xiàn)，若MMP消耗殆盡則其凋亡則無法逆轉(zhuǎn)，黃芩苷、白藜蘆醇均可使ROS水平上升，MMP水平下降[11, 32]。Ras/cAMP/PKA途徑不僅在白念珠菌的生長凋亡中起關(guān)鍵調(diào)控作用，對其生物膜形成、毒力也有重要影響[37]。黃芩苷可以使Ras/cAMP/PKA途徑相關(guān)基因RAS1、TPK1表達上升，CAP1、PDE2表達下降[11]。內(nèi)環(huán)境離子穩(wěn)態(tài)對細胞活性至關(guān)重要，Ca2+-Mg2+ATP酶可以通過將細胞內(nèi)多余的Ca2+泵到細胞外來維持細胞穩(wěn)態(tài)，黃芩苷加入后可以下調(diào)Ca2+-Mg2+ATP酶活性，從而破壞離子穩(wěn)態(tài)使白念珠菌壞死[10]。土槿皮乙酸則可以發(fā)揮類似吡咯類藥物的作用，減少白念珠菌細胞膜上麥角脂醇含量[20]，但其上游機制是否與14α-去甲基化酶(14DM)相關(guān)尚未得到深入研究。

白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化、生物膜形成與黏附、菌絲形成和細胞壁功能相關(guān)。白念珠菌的孢子或浮游菌的黏附是形成生物膜的起點，體外實驗中，黃芩苷可以抑制白念珠菌對口腔上皮細胞和陰道上皮細胞的黏附能力，黃芩苷、苦參堿和大蒜素可以抑制白念珠菌黏附相關(guān)基因ALS1、ALS3、ALS4、SUN41、EAP1、CSH1的表達[12-13, 38]。黏附后可形成芽孢酵母的微菌落，而出芽形成菌絲，由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化是白念珠菌增強毒力的關(guān)鍵。小檗堿、苦參堿可以下調(diào)菌絲形成相關(guān)基因ECE1、ALS3、SUN41和PBS2[13]。細胞壁不僅可以維持細胞形態(tài)，還參與白念珠菌的黏附和毒力因子的釋放，小檗堿可以破壞細胞壁的完整性。在胞外聚集基質(zhì)中，菌絲相和酵母相細胞構(gòu)建起一個復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，白念珠菌由浮游菌向生物膜完成形態(tài)轉(zhuǎn)化，形成白念珠菌生物膜后，其毒力和耐藥性都會提高。穿心蓮內(nèi)酯則可以促進白念珠菌生物膜分散至浮游菌狀態(tài)[15]。

在細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化過程中，白念珠菌的耐藥能力不斷增強，其耐藥性與抗菌藥結(jié)合位點的表達、外排泵轉(zhuǎn)運藥物能力和細胞器膜轉(zhuǎn)運離子能力相關(guān)。白念珠菌外排泵主要受兩種類型基因調(diào)控，一種為ATP依賴型CDR1和CDR2；另一種則是質(zhì)子交換型MDR1和FLU1;芒果苷可以下調(diào)兩種基因的表達[35]。因為在形成生物膜的早期，外排泵的能力對耐藥性影響較大，所以有研究推測只在形成生物膜的早期和中期對氟康唑有協(xié)同作用的漢防己甲素的作用位點在外排泵上[16]。

液泡是白念珠菌內(nèi)儲存Ca2+的主要細胞器，液泡膜上鈣離子調(diào)節(jié)器/通道蛋白Pmclp Vcxlp可以將細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運至液泡中；調(diào)節(jié)器Yvcxlp則可以將Ca2+從液泡轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，氟康唑可以抑制Vvcxlp的功能打破白念珠菌Ca2+穩(wěn)態(tài)達到抗菌目的，但白念珠菌高表達Pmclp時則可以代償被抑制的調(diào)節(jié)器Vcxlp的功能從而對氟康唑耐藥[39]，中藥單體成分小檗堿不僅可以下調(diào)基因PMC1表達，抑制Pmclp轉(zhuǎn)運能力，還能上調(diào)基因YVC1表達，促進Yvclp向內(nèi)轉(zhuǎn)運Ca2+與氟康唑發(fā)揮協(xié)同抑菌作用[7]?？拐婢幬镌诎啄钪榫系慕Y(jié)合位點通常是麥角脂醇及其上游調(diào)節(jié)酶，EGR11基因編碼14DM的構(gòu)象，當它發(fā)生突變時，白念珠菌因無法被吡咯類藥物結(jié)合而形成耐藥。目前針對EGR11基因表達的中藥單體成分研究較少，尚有待進一步深入。

5 結(jié)語

白念珠菌的常規(guī)抗真菌治療方法常面臨肝腎損害、耐藥和可選擇藥物較局限等問題的困擾，中藥單體成分與氟康唑、兩性霉素B等抗真菌藥物對耐藥標準株有協(xié)同作用，能降低其MIC，并可能對臨床耐藥菌有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。中藥單體成分的抗白念珠菌機制與抑制菌絲形成、阻滯白念珠菌形態(tài)改變、破壞細胞壁完整性和改變胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)。在體內(nèi)實驗中，中藥單體成分能提高免疫抑制型小鼠的IgG、IL-4、IL-12水平，增強其免疫力進而抗擊白念珠菌。中藥單體成分抗白念珠菌具有許多優(yōu)勢，且中藥單體成分豐富多樣、來源廣泛，對白念珠菌的臨床治療有重要意義，但很多機制尚未完全明確，有待于進一步深入研究。