王先寶，陳甜甜，高楚玥，張雨笛，謝怡俐，孫 靜，孫福樂,張安龍

(1.陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安市第五再生水廠，陜西 西安 710021)

0 引言

胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substance，EPS)是微生物在生長和代謝過程中自身分泌產(chǎn)生的一類高分子聚合物，其組成與污水處理系統(tǒng)的運行方式有較大相關(guān)性[1]，一部分來自于微生物細(xì)胞代謝的分泌，一部分來源于外界環(huán)境中的化合物[2].根據(jù)EPS在微生物細(xì)胞外空間分布特征可將EPS分為溶解型EPS和結(jié)合型EPS.結(jié)合型EPS具有雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層由緊密結(jié)合型EPS(Tightly Bound EPS，TB-EPS)組成，其具有一定的形狀；外層由松散結(jié)合型EPS(Loosely Bound EPS，LB-EPS)組成，是一個松散、沒有明顯邊緣的黏液層[2].

長期以來，關(guān)于EPS的研究主要集中于其對重金屬和有機污染物的吸附和絡(luò)合作用.EPS中存在羧基、巰基、羥基及含磷基團(tuán)等官能團(tuán)能夠吸附重金屬[3,4]，污泥中溶解性EPS吸附重金屬能力比結(jié)合型EPS高[5]；由于EPS帶負(fù)電荷，因而能夠吸附部分有機污染物，如苯類、染料和腐殖酸[6].但近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)EPS中含有氧化還原介體(如腐殖酸、細(xì)胞色素c、黃素等)，這類物質(zhì)能作為電子載體參與胞外電子傳遞過程.Cao等[7]采用蛋白質(zhì)組學(xué)法發(fā)現(xiàn)EPS中含有20種氧化還原蛋白，其中有兩種是與胞外電子轉(zhuǎn)移有關(guān)的單胞菌MR-1c型細(xì)胞色素MtrC和OmcA的同系物；Yang等[8]研究表明Geobacter 生物膜提取的EPS中含有細(xì)胞色素c、血紅素蛋白等氧化還原活性物質(zhì)；Li等[9]研究表明EPS中血紅素結(jié)合蛋白是 S.oneidensis 和 P.putida菌的關(guān)鍵氧化還原產(chǎn)物.

目前研究表明EPS通過參與胞外電子傳遞可將多種高價態(tài)重金屬離子(如U(VI)和Cr(VI))還原成低價態(tài)毒性相對較小的或容易被固定的狀態(tài)[10,11]，減少對環(huán)境的危害；這對有機污染物和重金屬等物質(zhì)的污染修復(fù)有著重大應(yīng)用潛力，因此，學(xué)者們越來越關(guān)注EPS的氧化還原特性.有研究表明EPS能夠介導(dǎo)種間直接電子傳遞提高污泥厭氧消化產(chǎn)甲烷過程，李青[12]的研究表明EPS的介導(dǎo)和電子傳遞作用是針鐵礦加速甲烷產(chǎn)率的主要原因；Zhu等[13]研究發(fā)現(xiàn)EPS中的黃酮在針鐵礦-產(chǎn)甲烷體系中發(fā)揮重要作用；Hu等[14]的研究表明EPS提高了體系中核黃素和細(xì)胞色素c含量，并降低體系電阻、提高電子轉(zhuǎn)移能力從而促進(jìn)污泥產(chǎn)甲烷性能.

目前，EPS氧化還原特性的研究以電活性微生物為主，關(guān)于活性污泥EPS氧化還原特性的研究較少.Lu等[15]采用不同提取方法探究活性污泥EPS電化學(xué)特性，研究結(jié)果表明EPS含有氧化還原活性物質(zhì)，通過電化學(xué)方法證明其具有一定的電子轉(zhuǎn)移能力.有研究表明不同運行工藝及不同生化單元中污泥EPS的組成和性能存在一定差異，然而目前關(guān)于不同生物處理單元EPS電化學(xué)特性的研究尚未見報道.

同時，目前研究將EPS作為一個整體探討其電化學(xué)性質(zhì)，并未對分層EPS的電化學(xué)特性進(jìn)行解析.因此，本研究以城市污水處理廠中AAO工藝中厭氧池、缺氧池和好氧池中污泥為研究對象，采用加熱法分別提取LB-EPS和TB-EPS，通過循環(huán)伏安、計時安培等電化學(xué)方法考察EPS中氧化還原物質(zhì)，旨在揭示AAO工藝各單元活性污泥中不同類型EPS的氧化還原性能.

1 實驗部分

1.1 實驗原料

污泥樣品取自西安市某污水處理廠，該廠設(shè)計處理能力為40 萬m3/d，采用AAO工藝.以AAO中厭氧池、缺氧池和好氧池的污泥作為研究對象.采集的污泥樣品均在1.5 h內(nèi)運至實驗室，使用之前儲存在4 ℃的冰箱中，所有試驗均在采集污泥樣品后一周內(nèi)完成.

1.2 實驗方法

1.2.1 EPS提取

活性污泥中LB-EPS和TB-EPS采用改良后的加熱方法[16].首先，在600 rmp，10 min的條件下將活性污泥離心，倒去上清液，加入70 ℃的0.9% NaCl溶液至原體積，然后將混合物置于搖床上80 r/min振蕩1 min，在4 ℃，8 000 g下離心15 min，將上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾得到LB-EPS；將提取LB-EPS后的污泥重新懸浮于0.9% NaCl溶液中，將混合液置于60 ℃水浴鍋中加熱30 min，在4 ℃，9 000 g下離心20 min，上清液經(jīng)0.45μm膜過濾得到TB-EPS，置于4 ℃下保存待用.

1.2.2 EPS組分測定

EPS中多糖(Polysaccarides，PS)含量采用苯酚-硫酸法測定；蛋白質(zhì)(Proteins，PN)和腐殖酸(Humin Acid，HA)含量采用修正的Folin-酚法測量；DNA采用二苯胺法進(jìn)行測定.其中EPS總量為PS、PN、HA和DNA之和，單位為mg·g-1(以VSS計).所有測試結(jié)果為重復(fù)3次的平均值.

1.2.3 電化學(xué)特性測定

采用電化學(xué)工作站(辰華660E)進(jìn)行循環(huán)伏安、計時電流和電化學(xué)阻抗譜試驗，以玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，Pt網(wǎng)為對電極.進(jìn)行電化學(xué)測試之前，向電解液中持續(xù)通入氮氣5 min，使其維持在一個近乎無氧的狀態(tài).循環(huán)伏安試驗中掃描速度為50 mV/s，電勢掃描范圍為-1.0 V至+0.5 V.進(jìn)行計時電流法試驗時，測量電子接受能力(Electron-accepting Capacity，EAC)時設(shè)置的還原電位為Eh=-0.6 V，電子供給能力(Electron-donating Capacity，EDC)的氧化電位為Eh=+0.5 V.電化學(xué)阻抗譜試驗中開路電壓值設(shè)為初始電壓，高頻為106Hz，低頻為0.1 Hz.

1.2.4 光譜掃描

采用UV2600A紫外可見分光光度計掃描不同處理單元污泥LB-EPS和TB-EPS溶液.采用1.0 cm的石英比色皿，以超純水作空白，掃描區(qū)間為200～500 nm.采用三維熒光光譜儀(愛丁堡FS5)測定LB-EPS和TB-EPS的組分和物質(zhì)結(jié)構(gòu)，激發(fā)波長Ex為220～500 nm，其增量為5 nm，發(fā)射波長Em為230～600 nm，其增量為1 nm，響應(yīng)時間為0.1 s.

2 結(jié)果與討論

2.1 EPS的化學(xué)組分

本試驗采用加熱法提取LB-EPS和TB-EPS.由表1可知，TB-EPS中組分含量高于LB-EPS.以厭氧池污泥為例，LB-EPS和TB-EPS總量分別為18.39 mg·g-1和76.96 mg·g-1，其中DNA占比分別為4.57%和8.07%.Liao等[17]的研究表明DNA在EPS總量的2%～15%內(nèi)，可認(rèn)為EPS在提取過程中沒有發(fā)生嚴(yán)重破裂.因此，本試驗采用的加熱法沒有引起嚴(yán)重的細(xì)胞裂解.PN含量占EPS總量的60%～75%，是兩類EPS的主要成分部分，這與溫丹丹等[18]的研究結(jié)果一致，而袁冬琴等[19]的研究結(jié)果表明PS是EPS的主要組成部分，造成EPS組成的不同主要是由于其容易受到進(jìn)水水質(zhì)、工藝類型、運行參數(shù)提取方式等諸多因素影響[20-23]，樊鵬超等[24]的研究也表明EPS中PS、DNA和HA含量與水質(zhì)情況、運行參數(shù)及工藝類型存在一定的相關(guān)性.此外，LB-EPS和TB-EPS含有一定量的HA，HA中存在大量氧化還原功能基團(tuán)，可作為微生物和污染物間的電子穿梭體或直接作為微生物厭氧呼吸的電子受體參與電子傳遞[25].

AAO不同單元污泥提取的EPS中各組分含量略有差異.由表1可知，EPS總量隨著AAO工藝沿程減少，可能是由于隨著AAO工藝運行，廢水所能提供的可供微生物消耗的物質(zhì)逐漸減少，使其消耗EPS內(nèi)部儲存的營養(yǎng)進(jìn)行生命供給，使得PN、PS含量降低[26].

表1 活性污泥分層EPS組分含量

2.2 EPS的電化學(xué)特性分析

2.2.1 循環(huán)伏安

循環(huán)伏安法可以用來檢測EPS的氧化還原活性和電化學(xué)特性.圖1(a)、(b)分別為AAO工藝活性污泥LB-EPS和TB-EPS的循環(huán)伏安圖.從圖1中可看出，LB-EPS和TB-EPS在-0.3 V附近均有一個氧化峰，其峰值電流大小基本相同，張恩華[27]的研究表明該峰可能屬于結(jié)合態(tài)黃素/Mtrc的氧化峰，但其對應(yīng)的還原峰在本試驗中沒有觀察到，可能是由于溶液中有多個相對含量較近的氧化還原物質(zhì)時，其循環(huán)伏安由于電位分布較寬，其對應(yīng)的氧化還原峰表現(xiàn)得不明顯[15].此外，LB-EPS和TB-EPS在-0.7 V處有一個還原峰，該峰隨著AAO工藝運行逐漸減小，說明其含量逐漸降低.

(a)LB-EPS循環(huán)伏安圖

2.2.2 EPS的電子轉(zhuǎn)移能力

為了進(jìn)一步驗證活性污泥提取的EPS是否具有電子轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)行了計時電流法.從圖2中可看出,LB-EPS和TB-EPS均有一定的電子轉(zhuǎn)移能力.由圖2(a)可知，三種LB-EPS的EDC值相差不大，EAC值大小依次為缺氧池>好氧池>厭氧池，說明缺氧池污泥LB-EPS含有更高的電子轉(zhuǎn)移能力；而厭氧池、缺氧池和好氧池污泥TB-EPS的電子轉(zhuǎn)移能力依次為0.652μmole-·g-1、0.640μmole-·g-1和0.676 mole-·g-1；有研究表明電子轉(zhuǎn)移能力依賴于EPS中氧化還原組分的含量[28]，說明好氧池污泥TB-EPS中含有更多的氧化還原物質(zhì).

本試驗中活性污泥EPS的EAC和EDC值分別為0.373～0.568μmole-·g-1和0.066～0.113μmole-·g-1，與Ye等[29]研究結(jié)果相近；但與其他文獻(xiàn)中報道的電活性微生物EPS相比，本試驗所采用的活性污泥EPS的電子轉(zhuǎn)移能力較低，可能是由于電活性微生物中含有更多可以導(dǎo)電的細(xì)胞色素c類蛋白、黃素類物質(zhì)[30].此外，本試驗中的LB-EPS和TB-EPS的EAC值均高于EDC值，與Lu等[15]的研究結(jié)果一致，可能是由于EPS中氧化還原物質(zhì)主要以氧化態(tài)的形式存在[30].

(a)LB-EPS的電子轉(zhuǎn)移能力圖

2.2.3 電化學(xué)阻抗譜

圖3是LB-EPS和TB-EPS的電化學(xué)阻抗譜圖，并對其進(jìn)行等效電路擬合.等效電路主要由Rs、CPE、Rf和Rct組成，其中Rs代表溶液電阻.由表2可看出，TB-EPS中各電阻值小于LB-EPS中的，這可能是由于TB-EPS中含有更多腐殖質(zhì)類物質(zhì)，使得電子能夠更有效的傳遞從而降低電阻.對于LB-EPS 而言，缺氧池中Rf和Rct最小，其次是好氧池，該結(jié)論與計時電流法相對應(yīng).TB-EPS的Rf和Rct值由大到小依次是缺氧池、厭氧池和好氧池，說明好氧池污泥TB-EPS的電阻最小，電子轉(zhuǎn)移能力更大，推測認(rèn)為其含有更多的氧化還原介體.

(a)LB-EPS的電化學(xué)阻抗譜圖

表2 LB-EPS和TB-EPS的電阻值

2.3 EPS的紫外掃描

圖4展示了不同類型EPS的紫外-可見光譜圖.由圖4可以看出，LB-EPS和TB-EPS在254 nm(UV254)處有一個清晰的峰.UV254值反映的是水體中存在的腐殖質(zhì)類有機物及含有C=C雙鍵和C=O雙鍵的芳香族化合物等物質(zhì)的含量[15].一般來說，UV254值越大，其對應(yīng)的芳香度就越大、腐殖化程度越深.TB-EPS中的UV254值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LB-EPS，說明TB-EPS中含有更多的有機質(zhì)，與前面EPS中組分總量相對應(yīng).

(a)LB-EPS的紫外掃描

有文獻(xiàn)表明EPS中還含有少量的細(xì)胞色素c，可以利用紫外可見光譜來探究該物質(zhì)是否存在.圖4(c)表明TB-EPS在402 nm處有個特征吸收峰，該峰的位置與氧化態(tài)細(xì)胞色素c一致[30].厭氧池、缺氧池和好氧池LB-EPS在402 nm處的吸光度分別為0.011、0.011和0.010，而其對應(yīng)的TB-EPS的吸光度分別為0.292、0.280和0.210，說明活性污泥中絕大部分細(xì)胞色素c位于TB-EPS.有研究表明以鐵離子為中心的卟啉環(huán)細(xì)胞色素c蛋白是介導(dǎo)電子傳遞的關(guān)鍵組分，TB-EPS中含有較高濃度的細(xì)胞色素c是其含有更高的電子轉(zhuǎn)移能力的原因之一.此外，細(xì)胞色素c的吸光度隨著AAO工藝的運行逐漸降低，說明AAO工藝活性污泥EPS中細(xì)胞色素c含量沿程減少.

2.4 EPS的三維熒光掃描

EEM可用來進(jìn)一步檢測LB-EPS和TB-EPS的組分分布.由圖5可看出，EPS中主要存在兩個明顯的特征峰peak A (Ex/Em:230/310-350)和peak B (Ex/Em:280-290/310-350)，這2個峰屬于絡(luò)氨酸、色氨酸蛋白類物質(zhì)[8,15]，說明AAO工藝中活性污泥EPS主要以蛋白類物質(zhì)為主，這與先前采用化學(xué)方法測定EPS組分的結(jié)論一致.此外，還有peak C (Ex/Em:230-245/450)和peak D (Ex/Em:340-350/440-450)，這些峰屬于類富里酸和類腐殖酸[31,32].研究表明富里酸的三維熒光強度與電子轉(zhuǎn)移能力具有較高的相關(guān)性，富里酸的存在可以作為自然環(huán)境有機廢水中具有電子傳遞能力活性的重要依據(jù)[32].LB-EPS中Peak C相對峰強度大小依次是：缺氧池>好氧池>厭氧池，說明缺氧池中存在相對較多的富里酸，即缺氧池活性污泥LB-EPS具有更大的電子轉(zhuǎn)移能力活性，這與計時電流法測定的研究結(jié)果一致.

從圖5可看出，TB-EPS中peak B的熒光強度隨著AAO工藝運行沿程減小，表明PN含量逐漸降低.而peak D峰值由大到小依次是：好氧池>厭氧池>缺氧池，說明HA含量先減小后增加，與前文比色法測定結(jié)果不一致，這是由于熒光光譜比色譜法具有更高的靈敏度[21,33].HA是一類典型的具有氧化還原能力的物質(zhì)，其氧化還原能力很大程度上歸因于其結(jié)構(gòu)中醌官能團(tuán)，是HA中重要且普遍存在的熒光團(tuán)[15].EEM和計時電流結(jié)果表明AAO工藝活性污泥EPS中HA的含量與其電子轉(zhuǎn)移能力相時應(yīng)，因此，可以推測出腐殖質(zhì)類物質(zhì)是活性污泥EPS參與電子轉(zhuǎn)移過程中的重要組成部分.

(a)～(c)LB-EPS的三維熒光圖 (d)～(f)TB-EPS的三維熒光圖圖5 LB-EPS和TB-EPS的三維熒光圖

3 結(jié)論

(1)在AAO工藝中，PN是活性污泥EPS的重要組成部分，TB-EPS各組分含量高于LB-EPS，LB-EPS和TB-EPS總量沿程逐漸減少.

(2)循環(huán)伏安試驗表明活性污泥EPS中存在氧化還原物質(zhì)，計時電流試驗表明LB-EPS的電子轉(zhuǎn)移能力大小依次為缺氧池>好氧池>厭氧池，TB-EPS的電子轉(zhuǎn)移能力強弱依次是好氧池>厭氧池>缺氧池.

(3)紫外可見光譜研究表明AAO工藝中活性污泥EPS中含有細(xì)胞色素c，絕大部分細(xì)胞色素c位于TB-EPS中，并且細(xì)胞色素c含量隨著AAO工藝流程逐漸減少.

(4)EEM圖結(jié)果表明蛋白類物質(zhì)是LB-EPS和TB-EPS的主要熒光物質(zhì).對于LB-EPS而言，缺氧池污泥中含有更多的富里酸和腐殖質(zhì)類物質(zhì)，其次是好氧池；對于TB-EPS而言，腐殖質(zhì)類物質(zhì)的熒光強度依次是好氧池>厭氧池>缺氧池，與其電子轉(zhuǎn)移能力一致，因此推測富里酸和腐殖質(zhì)類物質(zhì)是EPS參與電子轉(zhuǎn)移過程中的主要物質(zhì).