趙宇昊 何易祥 高昭 趙海燕 王文己

臨床上很多疾病與骨和軟骨缺損及再生相關(guān)，因此學(xué)者們對(duì)骨發(fā)育及修復(fù)的探究從未停止[1]。作為新興生物材料，肝素水凝膠在骨組織工程中的骨缺損修復(fù)、誘導(dǎo)分化等方面發(fā)揮重要作用。肝素廣泛存在于體內(nèi)，它的分子結(jié)構(gòu)中含有大量磺基和羧基，表面帶有大量負(fù)電，通過肝素結(jié)構(gòu)上的特定結(jié)合域能靜電吸附許多重要的生物分子，從而與生物活性蛋白相互作用[2]。因此，肝素水凝膠除具有水凝膠的組織相容性好、溶脹不溶解等優(yōu)點(diǎn)外，還具有參與調(diào)控細(xì)胞因子釋放等生物學(xué)特性。

1 誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可分化為骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，是一種很好的干細(xì)胞治療來源，對(duì)于骨相關(guān)疾病的治療尤為重要[3]。肝素能與許多成骨細(xì)胞及骨祖細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白相互作用，加之水凝膠本身具有交聯(lián)網(wǎng)狀的3D分子結(jié)構(gòu)，因此肝素水凝膠可維持MSC存活，誘導(dǎo)MSC分化[4]。Choi等[5]將肝素泊洛沙姆/結(jié)冷膠雙網(wǎng)水凝膠作為MSC載體進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在肝素提供改善黏附增殖表面的前提下，兩種水凝膠復(fù)合對(duì)細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用。而肝素泊洛沙姆水凝膠解決了天然多糖結(jié)冷膠在裝載細(xì)胞時(shí)成膠溫度高、凝膠本身缺乏配體結(jié)合部等問題，MSC存活且形態(tài)表現(xiàn)良好，表明肝素水凝膠不僅可以影響MSC，而且組織細(xì)胞毒性較低。Chen等[6]研究提示，肝素水凝膠較明膠水凝膠更容易促進(jìn)MSC成軟骨分化，抑制成骨分化。Seto等[7]將MSC與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)于肝素水凝膠中，MSC雖然成骨明顯，但細(xì)胞邊緣礦化卻十分明顯，這也提示肝素本身帶有負(fù)電荷，因此可以選擇性地與可溶性帶正電荷的蛋白相互作用，從而影響成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用。此外， Kim等[8]將肝素水凝膠與MSC共培養(yǎng)，結(jié)果顯示MSC具有細(xì)胞黏附性好等優(yōu)勢(shì)，且經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)條件培養(yǎng)的MSC生物學(xué)性能優(yōu)于經(jīng)普通細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的MSC，這也提示肝素水凝膠發(fā)揮作用并未借助吸附于肝素水凝膠表面的生物蛋白，而是肝素本身與細(xì)胞間的作用。

2 促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖

軟骨組織的自我修復(fù)能力有限，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不存在血管、神經(jīng)或淋巴組織，因此損傷后不會(huì)發(fā)生明顯再生，且修復(fù)后的軟骨組織缺乏軟骨正常功能所需的典型帶狀結(jié)構(gòu)。目前研究表明，水凝膠具有軟骨組織樣特征，水凝膠吸水后可以保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此水凝膠是目前治療軟骨缺損的前沿研究方向[9]。研究表明，肝素添加水凝膠后可顯著抑制MSC成骨作用，促進(jìn)軟骨細(xì)胞表型增殖，加強(qiáng)成軟骨作用[6,10]。Moreira-Teixeira等[10]探究右旋糖酐酪胺水凝膠對(duì)軟骨修復(fù)的影響時(shí)摻入肝素，結(jié)果細(xì)胞發(fā)生黏附，并觸發(fā)了右旋糖酐酪胺水凝膠中的細(xì)胞歸位，證明在水凝膠中加入肝素能誘導(dǎo)細(xì)胞募集。肝素濃度改變可對(duì)細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化產(chǎn)生影響，原因可能為肝素與生長(zhǎng)因子和趨化因子的高親和力。因此，肝素水凝膠促進(jìn)軟骨修復(fù)除能誘導(dǎo)MSC分化外，還可能誘導(dǎo)周圍細(xì)胞參與修復(fù)[10]。Jin等[11]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，水凝膠中加入肝素可增加水凝膠本身的溶脹性能，更好地為細(xì)胞輸送營(yíng)養(yǎng)；與單純右旋糖酐酪胺水凝膠相比，當(dāng)肝素在水凝膠中占比達(dá)一半時(shí)，培養(yǎng)基中軟骨細(xì)胞活力和增殖能力可達(dá)到最佳狀態(tài)，并能促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生。Kunisch等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水凝膠中肝素的存在可防止軟骨區(qū)礦化，有利于抑制鈣化軟骨成骨的長(zhǎng)期發(fā)展，并使鄰近水凝膠誘導(dǎo)的透明樣軟骨層Ⅹ型膠原明顯增多，且肝素水凝膠參與Ⅱ型膠原和蛋白多糖調(diào)控，穩(wěn)定軟骨形成。Park等[13]將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β3加入肝素水凝膠中，發(fā)現(xiàn)能更好地激活軟骨細(xì)胞生物活性，為軟骨再生提供了新的理論可能。

3 促進(jìn)血管形成

在骨組織重建中，細(xì)胞募集與血管形成對(duì)于組織成活至關(guān)重要。有研究表明，肝素水凝膠具有恢復(fù)斷裂血管連接的功能，可以完善上皮結(jié)構(gòu)，同時(shí)肝素的抗凝特性并未影響組織再生[14]。這表明肝素水凝膠促進(jìn)血管再生存在可能。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，它從肝素水凝膠中緩慢、穩(wěn)定釋放，使得肝素水凝膠經(jīng)VEGF修飾可在成血管方面發(fā)揮較好的作用[15]。Krieger等[16]利用脫硫肝素聚乙二醇二丙烯酸酯水凝膠釋放傳遞外源性基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1α，從水凝膠中釋放的SDF-1α可調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，直接或間接參與微血管網(wǎng)絡(luò)生長(zhǎng)，顯著增加周圍微血管口徑和數(shù)量。McGonigle等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肝素水凝膠聯(lián)合骨保護(hù)素可有效刺激體內(nèi)血管生成。Zieris等[18]同時(shí)將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)與VEGF加入肝素水凝膠中，結(jié)果表明肝素水凝膠可以大量結(jié)合FGF-2和VEGF等細(xì)胞因子，交聯(lián)固化，并可以分別調(diào)節(jié)FGF和VEGF釋放，成血管作用明顯。上述研究均表明，肝素水凝膠可通過控制釋放含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)因子，成為有效的細(xì)胞因子傳遞基質(zhì)，從而加速新生血管形成。

4 作為細(xì)胞因子載體

水凝膠結(jié)構(gòu)含有80%～90%的水和三維多孔結(jié)構(gòu)，而肝素分子本身呈負(fù)電性且具有特殊結(jié)構(gòu)域[19]，可以與許多重要的生物蛋白如凝血酶、脂蛋白、生長(zhǎng)因子、趨化因子、病毒外殼蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等相互作用，兩者相互結(jié)合實(shí)現(xiàn)肝素水凝膠在體內(nèi)外的控釋功能[20]。肝素修飾促進(jìn)了水凝膠整體與細(xì)胞因子結(jié)合的特異性和親和力，具有細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。Chen等[21]將低分子肝素加入羧甲基殼聚糖氧化硫酸軟骨素水凝膠中，裝載TGF-β3作為外周血MSC的基質(zhì)，以促進(jìn)軟骨修復(fù)，實(shí)驗(yàn)證明水凝膠中低分子肝素使TGF-β3凝膠化時(shí)間縮短，機(jī)械強(qiáng)度增高，降解速度減慢，TGF-β3釋放穩(wěn)定持久。Chung等[22]將負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2的肝素化納米顆粒水凝膠用于增強(qiáng)骨再生，結(jié)果表明在肝素化納米顆粒水凝膠作用下，培養(yǎng)基中獲得成熟和高度礦化的骨，BMP-2促進(jìn)新骨重塑作用明顯增強(qiáng)。Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，肝素化殼聚糖水凝膠對(duì)BMP的生物活性具有保護(hù)作用，其可能機(jī)制為水凝膠通過抑制BMP拮抗劑Noggin活性來增強(qiáng)BMP效力。Levinson等[24]將可注射肝素透明質(zhì)酸水凝膠作為生物支架，裝載TGF-β1并有效控制其釋放。肝素本身含有大量磺基和羧基，這使其分子本身帶有負(fù)電[2]。Peng等[25]將帶正電的小分子抗炎藥物龍膽紫加入肝素水凝膠中，結(jié)果表明龍膽紫釋放緩慢且可在釋放后維持自身生物活性，為肝素水凝膠成為藥物載體提供理論可能性。

5 結(jié)語(yǔ)

骨組織工程涉及骨與軟骨細(xì)胞增殖、分化等，對(duì)于臨床疾病治療具有重大的指導(dǎo)意義。肝素水凝膠具有組織相容性好、免疫原性低、細(xì)胞毒性低、兼具一定的機(jī)械強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛研究。由于肝素本身的抗凝活性及自身電荷分布，對(duì)其羧基稍加修飾取代，就可用于凝膠合成。肝素水凝膠可誘導(dǎo)MSC分化修復(fù)骨缺損，并可作為細(xì)胞因子載體及誘導(dǎo)成軟骨分化和控制藥物釋放，具有較好的生物學(xué)活性。但目前肝素水凝膠絕大部分的實(shí)驗(yàn)僅對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行現(xiàn)象分析，并未過多的探究肝素水凝膠生物活性具體機(jī)制，且實(shí)驗(yàn)較多偏向于體外研究，涉及動(dòng)物體內(nèi)的研究較少。此外，形成肝素水凝膠的交聯(lián)分子材料種類繁多，如何選擇更實(shí)用的材料，兼顧生物性能與費(fèi)用，值得探究。