陳穎 綜述 付煒 審校

【提要】為了降低藥物開發(fā)的成本，以及對心臟特定疾病的發(fā)生發(fā)展進行準確的臨床預(yù)測并制訂個性化的治療方案，需要開發(fā)相關(guān)的體外試驗平臺。這個平臺既要具備高度精確性，能模擬復(fù)雜的心臟微環(huán)境，又要保證操作簡易、經(jīng)濟成本低廉，心臟芯片應(yīng)運而生。心臟芯片利用其精細的結(jié)構(gòu)，精確模擬體內(nèi)環(huán)境，大大提升了體外試驗平臺的可靠程度，成為未來心臟組織工程領(lǐng)域最重要的發(fā)展方向之一。本文將對心臟芯片的基本組成及優(yōu)化進行闡述。

近年來，心血管疾病已經(jīng)成為危害國民健康的頭號殺手。在過去的半個世紀中，大約20%的藥物因心臟毒性召回，并且在藥物開發(fā)過程中，因藥物誘導(dǎo)的心臟毒性導(dǎo)致藥物開發(fā)損耗占了很大比例。由于缺乏有效的體外檢測方法準確評估藥物對心臟的毒性作用，以及動物實驗成本高昂，因此需要開發(fā)相關(guān)的體外平臺，使之既能再現(xiàn)心臟組織水平的功能，促進組織發(fā)育、器官生理學(xué)和疾病病因?qū)W的研究［1］，又能在藥物開發(fā)中，研究分子作用機制、毒性測試和生物標志物鑒定［2］，廉價且可靠地測試候選藥物。

體外研究的核心是組織器官的建模。理想情況下，體外模型應(yīng)具備高精度以及與天然組織的相似性，可以模擬復(fù)雜和動態(tài)的體內(nèi)環(huán)境，同時易于操作、成本低廉。傳統(tǒng)體外研究是建立在組織培養(yǎng)皿上，在靜態(tài)條件下進行單層的細胞培養(yǎng)。然而，通過標準的細胞培養(yǎng)方法很難再現(xiàn)心臟生理和病理學(xué)的復(fù)雜性。微流控心臟芯片可在單細胞水平、多細胞水平和3D 組織水平進行體外研究，從而解決了這一難題。

1 微流控心臟芯片

心臟芯片是利用微米大小的流體腔室，在連續(xù)灌注的條件下培養(yǎng)細胞，以模仿健康和患病心臟組織的生理學(xué)和病理生理學(xué)。其目標不是構(gòu)建一個完整的活體心臟，而是合成再現(xiàn)心臟功能的最小單位。芯片技術(shù)將材料科學(xué)、細胞生物學(xué)、生理學(xué)和組織工程學(xué)的方法與微系統(tǒng)工程學(xué)和微流控技術(shù)相結(jié)合，利用微流控芯片系統(tǒng)對微流體、細胞及其微環(huán)境精確、靈活的操控能力，創(chuàng)造了一種活細胞的微生理環(huán)境。心臟芯片最簡單的系統(tǒng)是含有一種細胞的單個灌注微流體室。在更復(fù)雜的設(shè)計中，可以由兩個或多個微流體室培養(yǎng)不同的心臟細胞類型［3］。這些細胞從一個細胞腔室連接到另一個腔室，以模擬不同細胞之間的生理相互作用或研究體外藥物分布。心臟芯片可以結(jié)合生理水平的理化刺激［4］，進行活細胞的生化、遺傳和代謝活動分析。

2 心臟芯片的制作與材料進展

“芯片”的制造方法源于制造計算機微芯片的光蝕刻法的改進形式，微流體培養(yǎng)系統(tǒng)通常是通過“軟光刻”制造的。心臟芯片可使用微成型、微蝕刻、激光蝕刻、注塑、光聚合、固體印刷和其他微制造方法。這些技術(shù)用于設(shè)計和制造具有高空間分辨率（最高達幾微米），并且具有生物相容性和高度定制化的三維結(jié)構(gòu)［5］。在組織工程技術(shù)較為成熟的環(huán)境下，芯片裝置可實現(xiàn)精確的微圖案化。這些裝置可與微傳感器集成［6］，用于分析生化因子、細胞遷移和流體壓力等［7］。

2.1 硅／玻璃基底系統(tǒng)

芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計首要問題是選取芯片材料。心臟芯片所利用的材料在近十年來已不斷優(yōu)化。最早的芯片是構(gòu)建在硅片上的，由于硅電滲穩(wěn)定性及生物兼容性不如石英玻璃，因此被取而代之。這些系統(tǒng)可以長期、多次使用，例如硼硅酸鹽玻璃、銦錫氧化物玻璃等。此類系統(tǒng)具有不可滲透氧氣的顯著特性，因此常常結(jié)合常氧／缺氧條件［8］來模仿正常／病理學(xué)病癥進行體外研究［9］。但是，由于這類系統(tǒng)成本高昂且制造過程復(fù)雜，因此并未得到廣泛使用。

2.2 聚合物基底系統(tǒng)

高分子聚合物兼具硅／玻璃的系統(tǒng)優(yōu)勢，而且種類眾多、可重復(fù)變形、價廉，更適合于批量生產(chǎn)、一次性使用，因此成為制作微芯片的理想材料。各種聚合物（如PDMS、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等）已被用作微型設(shè)備的生物相容性基材。在眾多聚合物中，由于PDMS 對氧氣的滲透性和成本效益較好，是最流行用于芯片制造的材料。一些天然來源的聚合物，如瓊脂糖、纖維蛋白和膠原蛋白等，也被用于微流控細胞培養(yǎng)。Lee 等［10］利用聚對二甲苯層覆蓋聚氨酯纖維，制成超軟生物集成電子設(shè)備以監(jiān)測動態(tài)的心肌細胞搏動情況。Lind 等［11］綜合利用多種黏彈性油墨材料進行3D 印刷制作芯片，可集成各種功能、結(jié)構(gòu)和生物材料，提高了模型的制作效率。Derda 等［12］提出了一種紙基微流體系統(tǒng)，該技術(shù)將多張薄片彼此堆疊以模仿3D 架構(gòu)，后續(xù)可以進行逐層分子分析。Li 等［13］首次利用3D 微流控紙基分析裝置實現(xiàn)了對3 個急性心肌梗死生物標志物的同時測定。

3 心臟芯片的細胞來源

從心臟分離出的心肌細胞用于研究心臟生理已有一個多世紀。然而，這些研究大多利用了無方向性生長的未成熟細胞，不能準確再現(xiàn)體內(nèi)組織功能和藥物反應(yīng)。目前，用于芯片上心臟發(fā)育的材料來源主要是組織活檢和原代細胞，也是研究心臟生理學(xué)的最佳體外模型。

3.1 動物源性心肌細胞

動物源性心肌細胞易于獲取且可在培養(yǎng)物中維持更長的時間，因此在早期的研究中應(yīng)用廣泛。1963 年，首次分離出新生大鼠心室肌細胞（NRVM），這些可以自發(fā)跳動的細胞成為研究心血管生理的寶貴資源［14］。早期的研究經(jīng)常從相對較大的動物中分離出成體心肌細胞，如貓、兔、犬和豚鼠等。與成體心肌細胞相比，新生動物心肌細胞相對容易分離，并且可以使用非病毒基因轉(zhuǎn)移方法進行轉(zhuǎn)染。由于心肌細胞是終末分化的，在培養(yǎng)中不會分裂，因此研究嘗試獲得永生化的心肌細胞系，如AT-1、HL-1、H9C2 細胞等，但是這些細胞系不能準確地再現(xiàn)心肌細胞的結(jié)構(gòu)和生理功能。組織活檢和原代細胞的表型在體外會隨著時間而改變，因此并不是在微系統(tǒng)中建立模型的最佳選擇［15］。

3.2 人源性心肌細胞

近來的研究轉(zhuǎn)向在體外從多種細胞來源產(chǎn)生組織工程化的心肌組織，如使用人干細胞。干細胞具有分化成其他類型細胞的可能性以及自我更新和再生的能力，在適當(dāng)?shù)纳L因子或理化刺激下可以分化成心肌細胞。

3.2.1 骨髓干細胞

骨髓干細胞又稱骨髓單核細胞（Bone marrow mononuclear cell，BM-MNC），包括間充質(zhì)干細胞、造血干細胞和內(nèi)皮祖細胞。間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)可分化為心肌細胞。由于骨髓干細胞作為自體細胞來源具有易得性，因此成為心肌損傷相關(guān)研究的重要細胞來源［16］。

3.2.2 脂肪干細胞

脂肪干細胞（Adipose-derived stem cell，ASC）具有多向分化的潛能，由脂肪干細胞來源的心肌細胞可以觀察到橫紋肌的橫紋、多核和跳動的細胞，這些都強烈提示脂肪源性干細胞能夠分化為功能性的心肌細胞。Yamada 等［17］成功鑒定出棕色脂肪組織中的心臟祖細胞，棕色脂肪衍生干細胞（BADSC）提供了一種新的心肌細胞來源［18］。

3.2.3 胚胎干細胞

胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESC）來源于早期囊胚的多能性內(nèi)細胞團，可以修復(fù)受損的染色體端粒末端，從而實現(xiàn)無限的細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制Wnt／β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以促進ESCs 向心肌細胞分化［19］。但是，取材困難和倫理問題限制了ESC 在心臟研究領(lǐng)域的進展。

3.2.4 誘導(dǎo)多能干細胞

誘導(dǎo)多能干細胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）由體細胞重編程形成，來源廣泛，避開了倫理問題和免疫排斥問題。面對臨床個體差異的挑戰(zhàn)，iPSC 以個體匹配的方式為藥物開發(fā)進程和治療效果帶來了突破和進展，使其成為構(gòu)建人類心臟模型的絕佳來源［20］。Zhang 等［21］利用人iPSC來源的心肌細胞（iPSC -CMs）構(gòu)建內(nèi)皮化的心肌。Kolanowski 等［22］通過優(yōu)化微流體系統(tǒng)，利用血流動力來增強iPSC-CMs 的成熟。當(dāng)前干細胞培養(yǎng)的分化效率低，需要使用大量試劑，芯片技術(shù)的應(yīng)用可以有望解決這些問題［23］。

4 心臟芯片的構(gòu)建條件及優(yōu)化

在體內(nèi)，細胞與鄰近細胞／細胞外基質(zhì)（ECM）相互作用，形成復(fù)雜的3D 結(jié)構(gòu)，使心臟組織成為協(xié)調(diào)的整體，在動態(tài)環(huán)境刺激（例如，電脈沖、機械收縮、氧氣變化等）下維持或破壞組織的穩(wěn)態(tài)。心臟芯片可以在嚴格控制的生化和生理條件下維持心肌組織活性，模擬人類心臟的生物特性。

4.1 電刺激

體內(nèi)心肌細胞不斷受到電信號的作用以促進同步收縮。電刺激可用于改善心肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能［24］以及同步跳動組織的形成。電場與心臟芯片的集成系統(tǒng)還可以精確控制細胞行為、細胞遷移，并將干細胞分化為心臟細胞類型。電極材料對細胞的自發(fā)跳動具有強烈的影響，可以使用各種類型的電極進行細胞的電刺激，如不銹鋼棒、聚碳酸酯導(dǎo)線、炭棒、鉑電極、氧化銦錫薄膜等。Cheah 等［25］通過鉑絲電極對心臟組織進行電刺激，證明電刺激可使心臟組織存活時間延長。還有一些電氣系統(tǒng)通過集成的微電極陣列（MEA）進行場電位的細胞外記錄，對細胞功能進行非侵入性和多部位監(jiān)測［26］。另外，還可以將導(dǎo)電材料與PDMS 混合，并從專用通道注入導(dǎo)電混合物，從而將電極嵌入芯片［27］。

4.2 機械刺激

4.2.1 機械循環(huán)應(yīng)變

心肌細胞在體內(nèi)受到有節(jié)奏的心臟跳動誘導(dǎo)的周期性機械應(yīng)變。在芯片內(nèi)，可以利用循環(huán)拉伸模擬細胞在生理條件下所處的環(huán)境信號，以促進體外組織成熟。通過載有誘導(dǎo)循環(huán)應(yīng)變的氣動致動系統(tǒng)，心臟芯片能促進受刺激的細胞發(fā)生心臟分化，以及表現(xiàn)出電和機械耦合［28］。Rogers 等［29］報道了一種心臟芯片，在病理血流動力學(xué)負荷下誘導(dǎo)細胞形態(tài)和基因表達的改變，模擬肥厚性和擴張性心肌病。Nguyen等［30］提出了類似的模型模擬了左心室的工作周期，機械刺激的細胞相較于未受機械刺激的細胞表現(xiàn)出更強的F-肌動蛋白定向排列與更高的α-肌動蛋白表達和增殖率。

4.2.2 剪切應(yīng)力

在微流控系統(tǒng)中運輸營養(yǎng)、廢物、細胞因子或其他化學(xué)物質(zhì)時，流體會在其內(nèi)部培養(yǎng)的細胞上產(chǎn)生剪切應(yīng)力。細胞上的剪切應(yīng)力大小取決于所施加的液體流速和微通道幾何形狀［7］。剪切應(yīng)力已成功用于將干細胞分化為心肌細胞［31］、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞等。Figallo 等［32］提出了一種用PDMS 制造的微型設(shè)備，該系統(tǒng)能降低細胞所受的流體壓力并使之具有較高的剪切應(yīng)力。在剪切應(yīng)力作用下的人類胚胎干細胞表現(xiàn)出較高水平的血管分化。

4.2.3 表面／結(jié)構(gòu)刺激

表面／結(jié)構(gòu)刺激也稱為被動機械刺激。由于基質(zhì)的結(jié)構(gòu)尺寸、機械特性、孔隙率和形態(tài)不同，在ECM 上培養(yǎng)的細胞會受生物力學(xué)信號的影響。ECM 的結(jié)構(gòu)和成分會直接或間接影響細胞形態(tài)、黏附、方向、遷移和細胞膜的變形。ECM剛度的變化會影響心肌細胞的成熟和收縮力。Wang 等［33］發(fā)現(xiàn)，新生大鼠心室肌細胞在具有深溝槽的軟基底上的收縮效果更好。Battista 等［34］提出了材料組成和結(jié)構(gòu)在促進ESCs 分化中的作用。纖連蛋白可優(yōu)先刺激血管生成，而層黏連蛋白的誘導(dǎo)可將細胞分化為跳動的心肌。

4.3 基質(zhì)支持

用于支持3D 培養(yǎng)的基質(zhì)（也稱為支架）在確保更好的生長、分化和細胞間信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。芯片技術(shù)已將基于凝膠和無凝膠的基質(zhì)用于生物學(xué)領(lǐng)域的各種應(yīng)用。

4.3.1 凝膠系統(tǒng)

結(jié)合水凝膠構(gòu)建的支架能支持氣體的運輸和必需的養(yǎng)分交換來促進細胞的正常發(fā)育，并且能適應(yīng)剪切應(yīng)力的變化［35］。目前，支持支架構(gòu)建的水凝膠有膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、纖連蛋白、瓊脂糖、聚（乙二醇）二丙烯酸酯或上述物質(zhì)的混合物等。透明質(zhì)酸和膠原蛋白等已被用于促進內(nèi)皮細胞的生長［36］，可用于研究VEGF 對內(nèi)皮細胞的增殖和遷移的影響。水凝膠能夠?qū)讖?、纖維厚度、濃度梯度進行調(diào)整［37］，利用微流體技術(shù)能夠生產(chǎn)不同形狀和尺寸的支架，進一步模擬體內(nèi)微環(huán)境和結(jié)構(gòu)的改變。

4.3.2 無凝膠系統(tǒng)

將細胞嵌入水凝膠操作復(fù)雜，而且水凝膠的組成和性質(zhì)通常會發(fā)生變化，從而限制營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣通過厚而致密的水凝膠進行傳輸，導(dǎo)致細胞活力降低。其次，基于凝膠的芯片系統(tǒng)不適合建立細胞密度大或無細胞外基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，因此可以通過無凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)來解決這些問題。例如，利用聚合物修飾細胞，促進胞間連接，從而導(dǎo)致細胞聚集而無需使用水凝膠基質(zhì)［38］。

4.3.3 生化刺激

將生化因子以可溶性因子的形式或作為細胞外基質(zhì)的一部分引入細胞培養(yǎng)中，可促進細胞分化。例如，使用BMP-4、Activin-4、bFGF、Activin-A、VGEF 和DKK-1 的混合物來誘導(dǎo)細胞分化成心肌細胞［39-40］。目前有研究將生化因子與微流控系統(tǒng)相結(jié)合，促進細胞的分化，如分化成肌細胞、成骨細胞等。腎上腺素能受體（AR）激動劑、三碘甲狀腺素（T3）、胰島素樣生長因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、miRNA 等也被用于促進心肌細胞的成熟。

5 展望

心臟芯片的發(fā)展需要克服許多挑戰(zhàn)。首先要解決的問題就是制造材料的選擇。大多數(shù)芯片都由PDMS 制成的，PDMS 有很多優(yōu)勢，但同樣存在缺陷。PDMS 會吸收小的有機化合物，包括許多藥物，且其高透氣性會阻礙某些應(yīng)用。最近，發(fā)現(xiàn)一些其他聚合物，如基于檸檬酸的可生物降解聚酯［41］，具有PDMS 的優(yōu)點，但不會吸收小的疏水性藥物。然而，需要更多的研究來確定可用于以低成本大量生產(chǎn)心臟芯片的合適材料。其次，PDMS 膜可能具有與天然基底膜不同的運輸、機械和結(jié)構(gòu)特性。另一個主要挑戰(zhàn)是技術(shù)穩(wěn)定性，必須協(xié)調(diào)各種因素，實現(xiàn)心臟芯片的最佳功能，包括細胞接種、ECM 涂層、流體控制、保持濃度梯度、去除芯片制作中產(chǎn)生的氣泡等。盡管最近有一些成果表明心臟芯片可以模仿特定的器官級功能，但該領(lǐng)域仍處于起步階段。如該技術(shù)可改進到能有效表現(xiàn)心臟對化學(xué)物質(zhì)、藥物和毒素的反應(yīng)程度，那么將為藥物發(fā)現(xiàn)、毒理學(xué)和個性化醫(yī)學(xué)開辟新的途徑。