胡 毅,王 微,蘭吉玉,鄢人雨,劉文鋒*

(1.貴州大學(xué),貴陽(yáng) 550025; 2.黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心,凱里 556000)

中國(guó)是最早種植茶葉的國(guó)家,距今有6 000多年的歷史[1]。綠茶是中國(guó)的主要茶類之一,通過采取茶樹的新葉或芽,經(jīng)殺青、整形、烘干等工藝制作而成。綠茶中含有茶多酚、咖啡堿、氨基酸、多糖等生物活性物質(zhì)[2],這些成分對(duì)防衰老、殺菌、消炎等具有特殊效果[3]。準(zhǔn)確測(cè)定茶葉茶湯中的有效成分對(duì)茶葉品質(zhì)評(píng)價(jià)、茶葉加工、茶樹選育等方面具有重要意義。

目前,測(cè)定茶葉中活性成分的常用方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、高效液相色譜法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]和分光光度法[7]等。其中高效液相色譜法因分離效果好、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用,但該方法存在分析時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)分離度不高等問題。與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比,超高效液相色譜法(UHPLC)具有分析快速、分離效果好、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)[8]。

本工作建立了UHPLC同時(shí)測(cè)定綠茶茶湯中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子酸(GA)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素、沒食子兒茶素、茶氨酸、咖啡因、可可堿等12種有效成分含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters型超高效液相色譜儀;SG 3200 HD型數(shù)控超聲清洗機(jī);ULTRA-TURRAX型分散機(jī);TG-16-WS型離心機(jī);JY5002型電子天平;DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解,配制成質(zhì)量濃度為2.00 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4～8℃保存5 d。使用時(shí),分別移取上述單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水稀釋,配制成所需質(zhì)量濃度的單標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中,用水定容,搖勻,配制成EC質(zhì)量濃度為0.1,0.2,0.5,1.0,2.0 mg·L－1,GA、沒食子兒茶素、可可堿、GCG、兒茶素、CG質(zhì)量濃度為0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 mg·L－1,EGC質(zhì)量濃度為2.5,5.0,10.0,25.0,50.0 mg·L－1,茶氨酸、咖啡因、EGCG、ECG 質(zhì)量濃度為5.0,10.0,20.0,50.0,100.0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

EGCG標(biāo)準(zhǔn)品,純度98.96%;GCG標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.35%;ECG 標(biāo)準(zhǔn)品,純度98.58%;GA 標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.42%;CG 標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.51%;EC標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.63%;EGC標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.90%;兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品,純度98.33%;沒食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品,純度98.82%;茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,純度98.61%;咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.99%;可可堿標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.90%。

乙腈、甲醇均為色譜純;其他試劑為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量2μL;流量0.3 mL·min－1;二極管陣列檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;流動(dòng)相A為0.01%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.0 min時(shí),A 為100%;1.0～10.0 min時(shí),A 由100%降至85%,保持4.7 min;14.7～15.0 min時(shí),A由85%升至100%。

1.3 試驗(yàn)方法

將1.00 g粉碎茶葉過40目(孔徑0.425 mm)篩網(wǎng)后,用100 mL 90℃的水溶解,立即于90℃水浴中超聲提取20 min。冷卻至室溫,再用水定容至100 mL,靜置5 min。取上述樣品溶液1 mL,用水定容至10 mL,以轉(zhuǎn)速4 500 r·min－1離心5 min,取上清液,用0.22μm濾膜過濾,濾液按儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)考察了不同組合的水相(甲酸溶液、乙酸溶液和0.01%磷酸溶液)-有機(jī)相(甲醇、乙腈)為流動(dòng)相時(shí)對(duì)12種目標(biāo)物分離度的影響。結(jié)果表明:以甲醇為流動(dòng)相時(shí),兒茶素峰和咖啡因峰出現(xiàn)部分重疊,即使優(yōu)化洗脫條件仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)兩峰的有效分離;以甲酸溶液-乙腈的混合液、乙酸溶液-乙腈的混合液為流動(dòng)相時(shí),ECG和CG較難分離;而采用0.01%磷酸溶液-乙腈的混合液為流動(dòng)相時(shí),ECG和CG的分離度有明顯改善。因此,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相為0.01%磷酸溶液-乙腈的混合液。

2.2 洗脫條件的選擇

由于茶葉中多酚類成分性質(zhì)相似,同時(shí)兒茶素與咖啡因出峰時(shí)間易重合,流動(dòng)相確定后,洗脫條件的選擇十分重要。結(jié)果表明:提高流動(dòng)相中0.01%磷酸溶液的初始比例,有利于茶氨酸的分離,當(dāng)0.01%磷酸溶液的初始比例小于95%時(shí),茶氨酸不能與溶劑峰(水)分離;當(dāng)0.01%磷酸溶液的初始比例提高至100%時(shí),茶氨酸與溶劑峰能夠有效分離。因此,試驗(yàn)選擇洗脫條件為梯度洗脫,梯度洗脫程序見1.2節(jié)。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)190～500 nm內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明:當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí),各目標(biāo)物均有較好的紫外吸收,儀器基線平穩(wěn),雜峰較少,可滿足檢測(cè)的要求,因此試驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2.4 色譜行為

按上述優(yōu)化條件對(duì)各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中12種有效成分進(jìn)行測(cè)定,其色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatogram

由圖1可知,12種有效成分在16 min內(nèi)均全部出峰,且分離度較好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗(yàn)方法對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以12種有效成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。12種有效成分的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,連續(xù)測(cè)定6次,記錄12種目標(biāo)物的保留時(shí)間和峰面積,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),考查方法的精密度,結(jié)果見表2。

按照試驗(yàn)方法對(duì)同一樣品溶液于0,4,8,16,24 h進(jìn)行測(cè)定,記錄12種目標(biāo)物的峰面積,并計(jì)算RSD,考查方法的穩(wěn)定性,結(jié)果見表2。

表2 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of tests for precision and stability %

2.7 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)1 mL茶湯樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)量為1 mL茶湯中各待測(cè)組分含量的0.5～2.0倍,每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次,計(jì)算各目標(biāo)物的回收率,結(jié)果見表3。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

表3(續(xù))

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)市售的茶葉樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,12種有效成分均被檢出,各成分檢出量見表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of sample

綠茶中含有氨基酸類、生物堿、兒茶素類等多種活性成分,兒茶素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似度高,分離難度大,并且茶氨酸與兒茶素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的差異大,同時(shí)測(cè)定茶氨酸、生物堿、兒茶素類成分存在一定難度。本工作建立了UHPLC同時(shí)測(cè)定綠茶茶湯中12種有效成分的方法,該方法在16 min內(nèi)可將各目標(biāo)物較好地分離,精密度、穩(wěn)定性、回收試驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、可靠。