黃 瑤， 張秀玲， 王 艷， 孔桂美， 徐 勤

（1.揚州市疾病預(yù)防控制中心檢驗科，江蘇 揚州 225002；2.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

發(fā)熱呼吸道病毒感染是全球范圍內(nèi)引起人類發(fā)病和死亡的主要原因之一[1-4]，了解病原體對疾病診治和預(yù)防具有十分重要的作用。鑒于呼吸道病毒疫情防控的復(fù)雜性[5-10]，本研究在揚州市住院肺炎患者中主動開展了呼吸道病毒病原學(xué)監(jiān)測，對住院肺炎患者進行流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人腸道病毒及人副流感病毒Ⅲ型這5種常見呼吸道病毒的檢測，最大程度對呼吸道傳染疫情進行預(yù)測，以及時采取應(yīng)對措施，減少疫情對社會和經(jīng)濟發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集江蘇省蘇北人民醫(yī)院、揚州大學(xué)附屬醫(yī)院、揚州市第二人民醫(yī)院、高郵市人民醫(yī)院4家哨點醫(yī)院符合“采樣對象”定義的住院肺炎患者呼吸道咽拭子樣本，每家哨點醫(yī)院每周采集5人份樣本，每周采集1～2次。樣本采集后48 h內(nèi)送至揚州市疾病預(yù)防控制中心病毒實驗室，2～8 ℃保存；未能及時送達的樣本，-70 ℃或以下保存，并于1周內(nèi)送達；樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.2 診斷標準

納入符合以下3種情況之一的住院治療的肺炎患者作為“采樣對象”：（1）發(fā)熱（腋下體溫≥38 ℃），并具有肺炎的影像學(xué)特征，發(fā)病早期白細胞總數(shù)降低或正常（或淋巴細胞分類計數(shù)減少）；（2）符合呼吸道病毒感染臨床表現(xiàn)（咽部不適、咽干或咽痛，鼻塞、流涕，鼻、咽、喉明顯充血或水腫，咳嗽，咳痰，氣短，聽診呼吸音異常，胸痛）中任意1項；（3）經(jīng)規(guī)范抗菌藥物治療3 d，病情無明顯改善，或呈進行性加重，或常見病原體感染不能解釋的肺炎病例。

1.3 儀器和試劑

Kingfisher96全自動核酸提取儀、ZTLJB-Y64核酸提取試劑盒（西安天隆科技有限公司）、ABI ViiA7實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；磁珠法病毒（NA）提取試劑盒（RD0164D，上海醫(yī)脈賽生物科技有限公司）；甲型/乙型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Victoria/Yamagata、副流感病毒Ⅲ型、腺病毒、呼吸道合胞病毒試劑盒和腸道病毒（通用型）核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）（江蘇碩世生物公司）。

1.4 方法

將樣本震蕩處理后，采用Kingfisher96全自動核酸提取儀提取、純化核酸，采用ABI ViiA7實時熒光定量PCR儀進行分型檢測。對流感病毒陽性樣本進一步行亞型分型檢測。逆轉(zhuǎn)錄熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、55 ℃延伸1 min，45個循環(huán)。熒光PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、55 ℃延伸40 s，45個循環(huán)。結(jié)果判定：循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）≤35，且曲線呈S型為陽性；Ct>38或未檢出為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件及Excel 2019軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 監(jiān)測采樣情況

2017—2020年，共收到住院肺炎患者咽拭子樣本1 479例，患者男887例，女592例，年齡為<1個月～94歲。各哨點醫(yī)院各年樣本上送情況見表1。

2.2 5種呼吸道病毒檢出率

1 479例咽拭子樣本中，檢出病毒陽性195例，陽性檢出率為13.18%，其中2種病毒混合感染7例（0.47%）。195例病毒陽性樣本中，流感病毒檢出率最高（5.54%），以下依次為呼吸道合胞病毒（2.63%）、人腸道病毒（1.89%）、人副流感病毒Ⅲ型（1.62%）、人腺病毒（1.01%）。7例混合感染病例中，人腺病毒合并人腸道病毒感染2例，人副流感病毒Ⅲ型合并人腸道病毒感染1例，呼吸道合胞病毒合并人腸道病毒感染2例，呼吸道合胞病毒合并人副流感病毒Ⅲ型感染2例。見表2。

2.3 呼吸道病毒檢出時間分布

2017—2020年，各家哨點醫(yī)院樣本上送數(shù)量穩(wěn)定。2017年陽性檢出率最高，達19.83%（68/343），以下依次為2018年（13.40%，43/321）、2019年（17.44%，60/344）、2020年（5.10%，24/471），不同年份病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=45.60，P<0.01）。

2017年呼吸道病毒檢出高峰時間集中在3～5月和11～12月，2018年集中在7月和9月，2019年集中在1～3月和12月，2020年僅有9月1個小高峰。2017年3～5月檢出病毒以B型Victoria流感病毒為主，11～12月則以新甲型H1N1流感病毒及人腸道病毒為主；2018年7月的高峰以呼吸道合胞病毒（12.50%）、人副流感病毒Ⅲ型（12.5%）、人腸道病毒（4.17%）和人腸道病毒與人副流感病毒Ⅲ型混合感染（4.17%）為主，陽性檢出率達到33.34%，9月的高峰則以人腸道病毒為主（37.5%），人腺病毒、人副流感病毒Ⅲ型、人腺病毒+人腸道病毒混合感染及呼吸道合胞病毒+人腸道病毒混合感染檢出率僅為4.17%，病毒陽性檢出率高達54.18%；2019年1～3月主要為新甲型H1N1流感病毒感染，12月的高峰由H1N1流感病毒，B型Victoria流感病毒及呼吸道合胞病毒構(gòu)成；2020年9月小高峰主要由呼吸道合胞病毒和人副流感病毒Ⅲ型構(gòu)成。

2.4 不同性別、年齡住院肺炎患者呼吸道病原檢出情況

887例男性患者中，101例病原檢測陽性，陽性檢出率為11.39%；592例女性患者中，94例病原檢出陽性，陽性檢出率為15.88%。男性、女性陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.4.26，P<0.05）。

根據(jù)患者年齡進行分組，不同年齡患者呼吸道病毒陽性檢出率分別為：0～6歲組16.57%（90/543），7～18歲組18.00%（18/100），19～59歲組12.72%（44/346），≥60歲組8.78%（43/490）。不同年齡組陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.87，P<0.01）。

2.5 住院肺炎患者呼吸道病毒病原譜

2017、2018、2019 、2020年住院肺炎患者病毒病原譜有所不同（χ2=72.63，P<0.01）。2017年以流感病毒、人腸道病毒、人呼吸道合胞病毒為主，分別占所有檢出病原體的54.41%、16.18%、16.18%；其中流感病毒共檢出4個亞型，以B型Victoria為優(yōu)勢毒株，H1N1亞型同期共存，H7N9與H3N2亞型交替檢出。2018年病毒病原譜則以人腸道病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒Ⅲ型為主，分別占所有檢出病原體的32.56%、25.58%、13.95%，流感病毒檢出率則大大降低，僅為13.95%，甲型流感病毒僅有新甲型H1N1檢出，乙型流感病毒僅有B型Yamagata檢出，分別占4.65%與9.30%。2019年病原譜以流感病毒為主（67.60%），除H7N9亞型之外，其余4種亞型均有檢出，以新甲型H1N1與B型Victoria為主。2020年以呼吸道合胞病毒和人副流感Ⅲ型病毒為主（各占37.5%），流感病毒僅占8.34%。見表3。

2.6 不同性別患者病毒病原譜

住院肺炎患者中，男性、女性病毒病原譜差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.68，P>0.05），主要病原均為流感病毒和呼吸道合胞病毒。

2.7 不同年齡患者病毒病原譜

4個年齡組中，所占比例最大的均為流感病毒和呼吸道合胞病毒，其次為人腸道病毒和副流感病毒Ⅲ型。4個年齡組病毒病原譜構(gòu)成差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=27.33，P<0.05）。見表4。

表4 不同年齡患者病毒病原譜 例（%）

3 討論

本研究通過對揚州市住院肺炎患者開展常見呼吸道病毒主動監(jiān)測，初步了解了揚州地區(qū)住院肺炎患者病毒病原構(gòu)成及流行情況。2017—2020年，揚州地區(qū)住院肺炎患者呼吸道病毒總檢出率為13.18%，低于相關(guān)文獻中發(fā)熱呼吸道人群監(jiān)測中的病毒總陽性率[11-12]，可能是住院肺炎患者病程已經(jīng)進展了一段時間，多數(shù)經(jīng)過了抗病毒藥物治療，導(dǎo)致病毒檢出率有所下降；除此之外，本研究病原學(xué)監(jiān)測只針對常見的5種呼吸道病毒，病毒檢測范圍小于相關(guān)文獻的8～9種，可能會使病毒檢出率有所下降。本研究病毒檢出時間分布結(jié)果顯示，2017年住院肺炎患者中呼吸道病毒陽性檢出高峰主要集中在3～5月和11～12月，2018年集中在7月和9月，2019年集中在1～3月和12月，2020年僅有9月1個小高峰，這和相應(yīng)病毒的流行高發(fā)季節(jié)基本能夠一一對應(yīng)。流感病毒的流行季節(jié)以冬春季為主，人腸道病毒的流行季節(jié)為夏秋季，人副流感病毒Ⅲ型則是全年都有流行。本研究中，呼吸道合胞病毒為秋冬季流行，與相關(guān)文獻報道的流行季節(jié)為冬春季[11-12]略有不同，可能與地域、樣本來源、樣本基數(shù)不同有關(guān)。本研究由于病毒總體陽性檢出率不高，各病毒流行趨勢無法根據(jù)數(shù)據(jù)描述發(fā)病與年齡、季節(jié)等相關(guān)的流行病學(xué)特征，有待于日后進一步監(jiān)測，擴充數(shù)據(jù)后進行描述。本研究結(jié)果顯示，揚州地區(qū)2020年呼吸道病毒陽性檢出率顯著下降，流感病毒在1～3月零星出現(xiàn)過后一直未有檢出，可能與2020年新型冠狀病毒肺炎疫情發(fā)生后采取的嚴格隔離防范措施密切相關(guān)。

本研究不同性別住院肺炎患者呼吸道病毒檢出結(jié)果顯示，男性患者病毒陽性檢出率低于女性，與相關(guān)文獻報道的男性更易感呼吸道病毒[13-15]的結(jié)論不一致，這可能是因為樣本來源不同導(dǎo)致的。但也有研究結(jié)果表明，女性感染呼吸道病毒，其臨床癥狀可能更為嚴重，住院肺炎患者一般處于呼吸道感染癥狀較為嚴重的階段，本研究結(jié)果是否可提示女性感染呼吸道病毒更易發(fā)展為肺炎，需要進一步的監(jiān)測結(jié)果加以驗證。

本研究不同年齡患者病毒檢出率差異極顯著，0～6歲兒童的陽性檢出率最高，表明學(xué)齡前兒童免疫力較低，在幼托機構(gòu)等場所容易交叉感染呼吸道病毒，與文獻報道[16-19]一致，且易進展為肺炎，而≥60歲老年患者病例數(shù)僅次于0～6歲兒童，但陽性檢出率最低，表明≥60歲老年人由于抵抗力下降，呼吸道感染容易進展為肺炎，但病毒性感染不是主要原因。

綜上所述，2017—2020年揚州地區(qū)住院肺炎患者呼吸道病毒流行季節(jié)及病原譜每年均有所不同，但主要病原為流感病毒和呼吸道合胞病毒，應(yīng)加強呼吸道病毒監(jiān)測，將流感病毒及呼吸道合胞病毒作為呼吸道感染防控重點。