張文，代紫苑，鮑思雯，茅慶慶

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

自然界中存在著數(shù)量龐大的未知新型病毒種類，而人類認(rèn)知的病毒只占所有潛在病毒類型的0.1%[1]，這些潛在的未知新型病毒極易造成新發(fā)病毒感染性疾病。研究人員經(jīng)過實(shí)地調(diào)查研究結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法，認(rèn)為哺乳動物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)的未知病毒有近百萬種[1-2]。傳染病專家預(yù)計在未來相當(dāng)長一段時間內(nèi)，人類新發(fā)傳染病的病原體將主要來自動物體攜帶的未知新型病毒[3]。隨著科學(xué)技術(shù)、工農(nóng)業(yè)和交通工具的快速發(fā)展，人類和資源的流通及人類接觸自然領(lǐng)域的速度和頻率迅速提高，這導(dǎo)致新發(fā)傳染病的發(fā)生案例逐年增多。近30年來全球出現(xiàn)的新發(fā)傳染病達(dá)100多種，并以每年新發(fā)2～3種的態(tài)勢發(fā)展，對人類健康危害巨大，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。從近年來新發(fā)或再發(fā)的傳染病案例來看，其病原體多為病毒，如2020年全球爆發(fā)感染的SARS-CoV-2[5-6]，頻繁爆發(fā)的新型禽流感病毒(avain influenza virus)[7]、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)[8]、寨卡病毒(Zika virus)[9]等。此外，臨床上尚有一些不明病因急性或慢性感染性疾病，給特異性診療帶來巨大困難。如臨床急性或慢性胃腸道疾病中有近40%的病例無法查出病因[10-11]，有10%～20%的急性肝炎及30%的隱發(fā)性慢性肝病的病原體尚不明確[12-14]；其中有些臨床不明病因的感染性疾病已經(jīng)被證實(shí)與新發(fā)病毒的感染有關(guān)[15-17]。新發(fā)病毒的感染具有不可預(yù)知性且不易被傳統(tǒng)方法檢出，對此人類還沒有有效的早期防治措施。因此，新發(fā)病毒性病原體的快速確認(rèn)技術(shù)對于臨床治療及疫情防控至關(guān)重要[8]。

目前，臨床上傳統(tǒng)的病毒檢測方法主要包括基于病毒基因的各類(RT-)PCR和基于病毒抗原抗體的血清學(xué)檢測。但這些方法的局限性是要提前預(yù)知病毒的基因序列或蛋白質(zhì)序列信息，因此只能用于檢測已知病毒或變異幅度較小的毒株，而對于變異度較大或未知新型病毒則不能有效檢出。對于未知新型病毒，科研工作者可以用傳統(tǒng)的組織細(xì)胞培養(yǎng)法或電鏡觀察法確認(rèn)其病原學(xué)特征，但這些方法也有其不可克服的局限性，其中細(xì)胞培養(yǎng)法只能針對部分病毒，且新型病毒的容納細(xì)胞在短時間內(nèi)難以確定。而電鏡法則耗時耗力、靈敏度較低且不易定性鑒定病毒。近年來，隨著病毒分子生物學(xué)和下一代測序(next generation sequencing，NGS)等技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新的病毒高通量檢測方法被應(yīng)用到未知新型病毒的挖掘中，其中病毒宏基因組學(xué)技術(shù)越來越成為人類獵取未知病毒的高效工具[18-20]。

1 病毒宏基因組學(xué)原理

宏基因組也稱微生物環(huán)境基因組，由Handelsman等于1998年提出，其定義為環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和[21]，包括可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因，目前主要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和。與細(xì)菌和真菌相比，病毒的顆粒及基因組均遠(yuǎn)小于它們。在傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)研究中，病毒基因序列由于占比太小或被淹沒在海量的真菌及細(xì)菌基因序列中，難以被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行分析。因此傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)分析方法無法用來進(jìn)行病毒群落分析[22]。病毒宏基因組學(xué)在宏基因組學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，主要用來解析特定環(huán)境或生物樣品中的病毒組，其概念由Edwards等[23]在2005年首次提出。隨后，美國加州大學(xué)的Delwart教授及美國哥倫比亞大學(xué)Lipkin教授對該方法進(jìn)行了改進(jìn)和發(fā)展，使該技術(shù)更加適用于大多數(shù)已知病毒和未知新型病毒的快速鑒定[2,22]。利用該技術(shù)，科研人員已經(jīng)能夠檢測出可以感染人類及其他脊椎動物的病毒類型如圖1所示。除了人類及其他脊椎動物的病毒群落，該技術(shù)在大氣、土壤、植物病毒群落及噬菌體群落解析方面也有了大量的應(yīng)用[20,22,24-25]。

該研究技術(shù)利用了病毒顆粒的兩個典型特征，即病毒顆粒小且核酸有致密的蛋白質(zhì)衣殼保護(hù)?；诖颂攸c(diǎn)，可以利用微孔濾膜過濾的方法將樣品中真核及原核細(xì)胞與病毒顆粒分離開來，進(jìn)而利用核酸消化酶(包括RNA酶和DNA酶)去除濾液中游離的非病毒衣殼保護(hù)的核酸，使樣品內(nèi)病毒核酸占比顯著提高，從而可以利用下一代測序技術(shù)充分獲得樣品內(nèi)的病毒核酸信息。因此，病毒宏基因組學(xué)摒棄了傳統(tǒng)宏基因組學(xué)對病毒組學(xué)研究的缺陷，可直接鑒定病毒群落的遺傳物質(zhì)，不需要預(yù)先進(jìn)行病毒基因序列特異性擴(kuò)增。其測序技術(shù)早期通過一代測序技術(shù)(Sanger法)獲得病毒基因序列，隨后迅速發(fā)展到通過下一代測序來分析包括人類和動物糞便、血液、組織和呼吸道分泌物等樣本內(nèi)的所有病毒序列組成。病毒宏基因組學(xué)中所謂“深度測序”主要集中在發(fā)現(xiàn)病毒及識別未知新型病毒或?qū)σ阎《镜淖儺愵愋瓦M(jìn)行研究，以更好地了解它們的遺傳及進(jìn)化規(guī)律，從而達(dá)到對病毒群落進(jìn)行無偏好性識別，且消除了在細(xì)胞培養(yǎng)中預(yù)先擴(kuò)增后病毒多樣性降低的影響。例如，本次新冠病毒肺炎暴發(fā)感染之初，世界首個SARS-CoV-2全基因組序列便是通過病毒宏基因組學(xué)方法獲得[5]。

2 病毒宏基因組學(xué)技術(shù)流程

病毒宏基因組學(xué)分析流程主要包括樣品內(nèi)病毒核酸富集、文庫構(gòu)建、下一代測序、生物信息學(xué)分析幾個主要步驟，加上后期新發(fā)病毒與特定疾病關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證，其詳細(xì)分析技術(shù)路線如圖2所示。

2.1 病毒核酸富集

由于絕大多數(shù)病毒的基因組遠(yuǎn)小于真核及原核生物基因組，如果事先不進(jìn)行病毒核酸富集而直接對臨床樣本進(jìn)行核酸測序，將導(dǎo)致真核及原核遺傳物質(zhì)(包括游離基因組序列和核糖體RNA序列)的背景較高[26]。為了減少這類背景噪音，可以使用微孔濾膜(包括0.45 μm)過濾方法來純化病毒，以排除較大的其他大型顆粒。過濾后的濾液通過核酸酶(包括RNA酶和DNA酶)消化大量存在于臨床樣本中的裸露細(xì)胞核酸，病毒核酸因被病毒衣殼保護(hù)而不被核酸酶消化。當(dāng)樣本體積較大時，例如在環(huán)境研究中，也可以使用超速離心方法從預(yù)期密度帶中濃縮和提純病毒顆粒[27]。

2.2 文庫構(gòu)建及下一代測序

經(jīng)過上述處理步驟之后，盡管樣品內(nèi)病毒核酸的相對占比大幅度提高，整個樣品內(nèi)核酸的絕對濃度卻會顯著降低。因此，在病毒宏基因組學(xué)研究中，不管使用基于哪種測序方法進(jìn)行基因文庫的構(gòu)建，病毒核酸都需要進(jìn)行擴(kuò)增，才能產(chǎn)生下一代測序平臺所需的大量DNA。對于RNA病毒，則首先需要將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。各種不依賴已知序列的DNA擴(kuò)增方法已經(jīng)被成功地使用，其中隨機(jī)引物法目前占據(jù)主導(dǎo)地位。該方法將隨機(jī)引物(通常為6堿基隨機(jī)引物)放置在特定標(biāo)簽序列的3′端，隨機(jī)引物的簡并性允許引物在病毒RNA或DNA基因組的整個長度內(nèi)退火[24]。將這樣的引物放置在病毒序列的兩端進(jìn)行兩輪延伸之后，再用其攜帶標(biāo)簽序列作為引物進(jìn)行多輪PCR擴(kuò)增，即可獲得大量病毒DNA，然后再通過特定方式加上適用于下一代測序的接頭序列進(jìn)行深度測序。近年來，單引物等溫擴(kuò)增(single primer isothermal amplification,SPIA)和多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification,MDA)兩種等溫擴(kuò)增技術(shù)也在病毒宏基因組學(xué)研究中大量使用，特別是針對特定目的病毒(如呼吸道樣品內(nèi)的SARS-CoV-2)的核酸檢測方面取得了良好的效果[28]。

羅氏公司454測序系統(tǒng)是最早用于未知新型病毒挖掘的高通量測序工具。該測序方法可產(chǎn)生較長的讀長，其單個讀長可達(dá)到500 bp，這便于識別高度變異的病毒序列[29]。隨后，Illumina公司下一代測序分析平臺由于兼具讀長(單個讀長可達(dá)300 bp)和測序深度兩大特點(diǎn)而成為病毒宏基因組學(xué)研究的主要測序方法。近來Pacific Biosciences及Oxford Nanopore推出的三代測序技術(shù)，可以在數(shù)小時而不是幾天內(nèi)提供大量更長讀長的測序數(shù)據(jù)，使得病毒宏基因組學(xué)研究更加快速、結(jié)果更加可靠[30]。然而，測序高錯誤率是這些高通量技術(shù)固有的缺點(diǎn)。在病毒宏基因組學(xué)分析中，通常使用BLASTx搜索分析樣品內(nèi)的病毒序列，下一代測序中的移碼突變會改變病毒基因組內(nèi)的開放閱讀框(open reading frame,ORF)，從而干擾蛋白質(zhì)相似性搜索，繼而影響高變異型病毒的鑒別。使用基于核苷酸序列相似性搜索(如BLASTn)時，移碼突變對鑒別已知病毒病原體的影響則較小。當(dāng)然，如果樣品內(nèi)病毒滴度比較高或下一代測序的深度較深，那么測序過程中產(chǎn)生的突變則可以被序列拼接過程中的高覆蓋率所糾正。盡管下一代測序也可以用來檢測罕見的病毒變異(如HIV抗藥性突變體)，但在野生型病毒準(zhǔn)種鑒定方面卻需謹(jǐn)慎使用[31]。

2.3 病毒宏基因組學(xué)研究中的生物信息學(xué)分析

為了便于識別未知新型或高度變異型的病毒，下一代測序所產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)需要經(jīng)過從頭拼接，以將文庫內(nèi)所有DNA短序列組裝成更長的重疊群。完成這一分析的軟件眾多，包括適用于Windows系統(tǒng)的CLC genomic workbench和Linux系統(tǒng)的ENSEMBLE assembler等[32]。序列拼接完成后，使用NCBI開發(fā)的BLAST工具，在核酸或蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫中搜索重疊群和未組裝的單體序列。核苷酸相似性搜索(BLASTn)可以快速識別與已知病毒物種序列密切相關(guān)的序列。而與公共數(shù)據(jù)庫中的已知病毒核酸具有高度分歧度的病毒序列則無法使用核苷酸相似性搜索來識別，需要將它們的潛在翻譯產(chǎn)物與所有已知病毒蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行更嚴(yán)格的計算比較(BLASTx)，以檢測較弱的匹配?；谥丿B群或者單體序列的BLASTx搜索結(jié)果可以直接導(dǎo)入其他軟件，獲得某個樣品內(nèi)病毒群落的組成。實(shí)現(xiàn)此類分析的一個常用軟件為MEGAN 6.0，它不但可以顯示某個文庫內(nèi)的病毒群落組成，還可以根據(jù)序列數(shù)的多少給出樣品內(nèi)各類病毒的相對含量信息，有利于判斷樣品病毒群落內(nèi)的優(yōu)勢病毒[33-35]。此外，該軟件還可以根據(jù)不同樣品的BLASTx搜索結(jié)果進(jìn)行橫向比較，從而分析一組樣品不同樣品間病毒群落及特定病毒的異同，確定一個研究群落內(nèi)的優(yōu)勢病毒類型，有利于確定特定疾病與某種病毒感染的相關(guān)性。一般來說，一旦潛在的新的病毒科、屬及種的全基因組序列被獲得，它的遺傳分類地位及其與已知病毒科屬種之間的遺傳關(guān)系可以很快通過系統(tǒng)發(fā)育分析來確定[36]。在此過程中，需要檢索與待分析病毒相關(guān)的已知科屬種病毒的代表毒株的基因組或保守蛋白序列，經(jīng)過序列多重比對(multiple sequence alignment，MSA)，使用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件(如Mega 7.0及MrBayes等)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而直觀表示新型病毒的遺傳分類地位[37]。對來自任何特定宿主群體(如脊椎動物、節(jié)肢動物、原生動物、植物和原核生物)的新病毒科的鑒定將有助于在其他宿主中檢測它們的同源病毒。

3 新發(fā)病毒與特定疾病的關(guān)聯(lián)分析

目前，部分常見病仍然沒有確切病原，包括部分急性胃腸炎、急性呼吸道感染、肝炎和腦炎等。此外，一些自身免疫性疾病和癌癥也可能是由仍未確定的病毒感染觸發(fā)。因此，病毒宏基因組學(xué)為識別此類疾病的候選病原體提供了一種簡單的工具。近年來，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)測定了大量人類和動物體內(nèi)的病毒群落[20]。雖然眾多未知新型病毒是在不明病因的患者臨床樣本中發(fā)現(xiàn)的，但它們在臨床樣本中的存在和發(fā)現(xiàn)可能是一種巧合，與這種特定疾病的發(fā)生沒有必然聯(lián)系，而只是反映了機(jī)體內(nèi)的無害感染[18,25]。一種鑒定出的新病毒可能真的是感染人類的病毒，也可能只是簡單地攝入或吸入，然后一過性地通過腸道或支氣管腔而并不感染人體。研究發(fā)現(xiàn)，在人類和動物糞便中普遍檢測到攝入的植物、動物和昆蟲病毒核酸[37-38]。檢測到這類核酸只是證明了它們在消化道中具有存活的能力。而人類血清中特異性抗體的檢測可以用來證明病毒在人體內(nèi)的復(fù)制。不同于人類腸道、呼吸道分泌物或皮膚樣品檢測到的病毒，血液、組織或腦脊液中檢測到的病毒更可能是病毒復(fù)制的證據(jù)。但病毒在人類體內(nèi)的復(fù)制不能被認(rèn)為是病毒致病的確鑿證據(jù)，因?yàn)椴《究梢栽谝赘屑?xì)胞培養(yǎng)過程中繞過宿主限制，而且許多病毒可以在體外非宿主物種的細(xì)胞系中生長。因此，研究新發(fā)病毒的感染與特定疾病的關(guān)聯(lián)分析就尤為重要，可以防止不必要的干預(yù)，如抗生素治療，并改進(jìn)治療措施和傳播預(yù)防。

對于新發(fā)病毒與特定疾病的關(guān)聯(lián)性研究，可以在病毒宏基因組學(xué)研究獲得病毒基因組序列的基礎(chǔ)上，使用(RT-)PCR法比較患者和健康對照樣本中的病毒攜帶率，也可以輔以定量PCR檢測方法比較疾病群體與健康對照群體體內(nèi)病毒載量。在病毒流行感染期間，病毒特異性抗體的檢測也是判斷特定疾病與該病毒感染相關(guān)性的重要依據(jù)。當(dāng)然，由于不同人群的病毒暴露和易感性可能有很大差異，因此疾病群體和對照樣本需要在流行病學(xué)上高度匹配，特別是年齡及地理來源。如不能將疾病群體與對照樣本正確匹配可能會導(dǎo)致錯誤結(jié)果。疾病關(guān)聯(lián)研究最好也涉及來自不同地區(qū)或國家的不同年齡組。這種關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果可以高度提示新發(fā)病毒的致病作用。最終，要確切證明疾病與新發(fā)病毒感染之間的關(guān)聯(lián)，需要不同的研究小組使用不同的患者和對照樣本進(jìn)行確認(rèn)。使用特定的抗病毒藥物或接種病毒后，感染者恢復(fù)期血清特異性抗體的降低、癥狀的減輕、疾病患病率的降低是證明新發(fā)病毒致病性的直接方法。但這些措施只針對高致病性和流行的病毒感染。新發(fā)病毒致病性的最終確認(rèn)首先取決于如上所述的疾病關(guān)聯(lián)性試驗(yàn)。

4 病毒宏基因組學(xué)技術(shù)用于臨床快速診斷的展望

誠然，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)目前還存在成本高、分析步驟煩瑣、分析周期長等不足之處。一旦這些重要的障礙被突破(當(dāng)然這些缺陷相信會很快解決)，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)將是一個很具潛力的快速診斷臨床病毒感染的方法。同時，在生物制品的開發(fā)和制造過程中，該技術(shù)也可以用來檢測病毒污染[39-40]。該方法要實(shí)現(xiàn)從科研到臨床快速診斷，縮短整體技術(shù)流程所需的時間是首先要解決的問題，從臨床樣本采集到序列數(shù)據(jù)生成和生物信息學(xué)分析的時間縮短到具有臨床意義的1天乃至數(shù)小時，有利于臨床的早診斷、早治療，這將提高人們利用測序方法進(jìn)行臨床診斷的吸引力。成本問題是另外一個急需解決的問題，當(dāng)單一病毒檢測的成本相當(dāng)?shù)蜁r，則可以把病毒檢測作為醫(yī)療單位常規(guī)檢查之一。當(dāng)然，持續(xù)存在的DNA污染問題和極低水平的病毒核酸檢測的醫(yī)學(xué)意義也需要解決。如果上述問題能夠成功解決，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)有望成為單一全覆蓋式的病毒快速檢測方法，從而取代臨床許多病毒特異性測試。此外，在科研領(lǐng)域，新病毒的發(fā)現(xiàn)、病毒基因組的重新測序及病毒基因突變等方面，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)仍然會廣受歡迎。