張葉，李嫻靜，楊勇

(1.中國藥科大學(xué)新藥安全評價研究中心，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211198)

對鈉鉀三磷酸腺苷酶(Na+/K+-ATPase)的研究始于1957年，Skou 教授發(fā)現(xiàn) Na+/K+-ATPase是調(diào)節(jié)離子進出細胞的一種方式，且該酶需要在鈉離子和鉀離子存在下發(fā)揮活性[1]?；谶@一發(fā)現(xiàn)，Skou 教授榮獲了1997年的諾貝爾化學(xué)獎。作為一種重要的離子泵，Na+/K+-ATPase最重要的作用就是介導(dǎo)跨膜活性離子的轉(zhuǎn)運[2]。作為 P 型 ATPase家族(也被稱為E1-E2 ATPase)的一員，Na+/K+-ATPase能利用 ATP 水解產(chǎn)生的磷酸基團進行 α 基團上天冬氨酸殘基的磷酸化和去磷酸化反應(yīng)，從而將特定離子轉(zhuǎn)運進出細胞[3]。P型 ATPase按照保守序列可分為5個亞家族(PI～V)，其中PII ATP 酶亞家族包括Na+/K+-ATPase，肌漿網(wǎng) Ca2+泵，胃內(nèi)H+/K+-ATPase[4]。其中 Na+/K+-ATPase和H+/K+-ATPase是唯一以逆向轉(zhuǎn)運方式起作用的P型ATPase。Na+/K+-ATPase作為主要的膜整合蛋白之一，能同時將3個 Na+泵出細胞并將兩個 K+泵入細胞，維持細胞膜內(nèi)外的鈉鉀離子濃度差，可調(diào)節(jié)跨膜電化學(xué)梯度，促進膜靜息電位的形成，對質(zhì)膜上其他反應(yīng)的發(fā)生至關(guān)重要[5]。

除了廣為人知的離子泵的作用外，Na+/K+-ATPase與其他膜蛋白及胞質(zhì)蛋白的動態(tài)相互作用的報道越來越多，這種相互作用在細胞生物活動中至少發(fā)揮兩種重要作用：①早期研究重點關(guān)注的 Na+/K+-ATPase對胞內(nèi)外離子濃度動態(tài)調(diào)節(jié)，包括 Na+、K+、Ca2+；②通過與信號蛋白的直接相互作用，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，或作為信號整合劑將特定膜組織區(qū)域內(nèi)的影響因子和效應(yīng)器僑聯(lián)在一起。過去二十年的研究表明，Na+/K+-ATPase的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的改變參與了許多臨床疾病如肥胖、高血壓、腫瘤等的進展[6]。 Na+/K+-ATPase還被證明作為治療尿毒癥心肌病和組織纖維化的治療靶標[7-8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Na+/K+-ATPase在腫瘤中異常表達，且能通過調(diào)節(jié)各種與細胞存活和死亡相關(guān)途徑在腫瘤的發(fā)生，增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[9-13]。強心苷是動植物來源的天然化合物，如洋地黃毒苷、地高辛、毒毛旋花子苷K。強心苷類藥物作為 Na+/K+-ATPase的天然抑制劑能抑制 Na+/K+-ATPase的活性。該類藥物臨床一直用于心力衰竭和心律不齊等心血管類疾病的治療。但最近研究發(fā)現(xiàn)，強心苷通過抑制 Na+/K+-ATPase活性和其他機制發(fā)揮抗腫瘤活性，本文對 Na+/K+-ATPase的抗腫瘤作用的研究進展，Na+/K+-ATPase抑制劑(強心苷類藥物等)作為腫瘤潛在治療策略進行了報道。

1 Na+/K+-ATPase的結(jié)構(gòu)和功能特征

Na+/K+-ATPase是由α和β亞基以及屬于FXYD(苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸,簡寫F-X-Y-D)蛋白家族的調(diào)節(jié)亞基組成的異源寡聚體。通過分解 ATP 獲得能量，進行 Na+、K+逆濃度梯度的主動轉(zhuǎn)運，即能把Na+從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞外，把K+從細胞外轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，維持細胞膜內(nèi)外的K+、Na+濃度差以及細胞內(nèi)外液的滲透壓穩(wěn)定。

α 亞基作為催化亞基由10個跨膜螺旋(M1～M10)組成，這些螺旋上有 Na+和 K+和其他配體的結(jié)合位點，包括3個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域：催化功能域 (A)，核苷酸結(jié)合域 (N) 和參與 ATP 水解磷酸化結(jié)構(gòu)域 (P)[14-16]。其中 ATP 分子能與 α 亞基的 N 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，ATP 發(fā)生水解產(chǎn)生的磷酸基團能與 P 結(jié)構(gòu)上的天冬氨酸殘基結(jié)合[17]。在人類中，Na+/K+-ATPase的 α 亞基有四種不同的亞型：α1、α2、α3 和 α4，分別由α1多肽 (ATP1A1)、α2 多肽(ATP1A2)、α3多肽(ATP1A3)和α4多肽(ATP1A4)的4種不同的基因編碼而成[18]。ATP1A1 幾乎在所有細胞中均等表達，而 ATP1A2 主要在骨骼、心臟、平滑肌、腦(主要在星形膠質(zhì)細胞)、肺和脂肪組織中表達。ATP1A3 主要在神經(jīng)元和心臟中表達。ATP1A4 僅在精子細胞中檢測到，對于精子的活動性和男性生育能力至關(guān)重要[19]。

β 亞基是一種小型糖蛋白，最初被認為作為分子伴侶發(fā)揮作用。Na+/K+-ATPase的 β 亞基不參與任何催化反應(yīng)，它能與 α 亞基的 M7 和 M10 螺旋相互作用，調(diào)節(jié)α亞基中的離子運輸。β 亞基還可以幫助維持上皮細胞的極化和細胞的運動。抑制 β 亞基功能會導(dǎo)致促進細胞運動的緊密連接喪失，最終導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移[16]。β 亞基包含3種不同的亞型，分別由β1多肽 (ATP1B1)、β2多肽(ATP1B2)和 β3多肽(ATP1B3)編碼得到。ATP1B1 存在于大多數(shù)組織中，與α 亞基一起形成組織內(nèi)最廣泛表達的 Na+/K+-ATPase亞型-α1β1復(fù)合體。β2存在于神經(jīng)元，松果體，骨骼肌中，介導(dǎo)神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞的相互作用，促進神經(jīng)突觸生長。β3 在睪丸，肝臟，肺臟，腎臟中表達[20]。

γ亞基又被稱為FXYD2，是由66～68個氨基酸組成的小分子多肽。FXYD2 是 FXYD 蛋白家族一員，該家族蛋白被證明可以調(diào)節(jié)催化亞基的活性。其中 FXYD2 被證明與離子通道的開放有關(guān)[21]。此外，還有文獻報道 FXYD2 能調(diào)節(jié) α 亞基配體的親和力[22]。盡管 FXYD2 具有某些調(diào)節(jié)作用，但已發(fā)現(xiàn) Na+/K+-ATPase在沒有γ亞基存在下也能正常工作[17]。

如上文所說，Na+/K+-ATPase除了進行 Na+、K+的運輸，參與和維持細胞膜內(nèi)外的電化學(xué)梯度外，還能與鄰近的膜蛋白相互作用形成信號復(fù)合體，進行細胞內(nèi)的級聯(lián)信號反應(yīng)，傳遞信息。其中NKA/Src/ROS信號通路的激活導(dǎo)致氧化應(yīng)激失衡，加劇腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎病等疾病發(fā)展[23-25]。此外越來越多的證據(jù)表明作為一種多功能蛋白，Na+/K+-ATPase在細胞黏附復(fù)合物形成和維持中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。 Na+/K+-ATPase能與許多信號分子和肌動蛋白細胞骨架結(jié)合，形成多蛋白復(fù)合物，促進細胞間緊密連接和獨立連接的形成[26]。有學(xué)者解釋稱在細胞膜上存在兩種 Na+/K+-ATPase：一種是作為能量轉(zhuǎn)換離子泵的經(jīng)典酶池，另一種是局限于小窩的發(fā)揮信號傳導(dǎo)功能的酶池[27]。在不同的細胞和組織中，這種信號體的組成以及結(jié)合的蛋白質(zhì)可能是不同的，這就導(dǎo)致該信號體在不同組織中尤其是在正常和病理狀態(tài)下，如癌癥中發(fā)揮不同功能。

2 Na+/K+-ATPase作為腫瘤治療的潛在靶點

與相應(yīng)正常組織相比，在人類癌癥中 Na+/K+-ATPase各亞型表達水平發(fā)生改變[26]，許多有關(guān) Na+/K+-ATPase促癌作用的報道已證明與 Na+/K+-ATPase的 α 和 β 亞基的差異表達相關(guān)，但與 γ 亞基沒有關(guān)系。如α1亞基在包括非小細胞肺癌[28]、腎細胞癌[29]、膠質(zhì)細胞瘤[30]和黑色素瘤[31]中表達上調(diào)，而 α3 亞基在結(jié)腸癌中表達上調(diào)[32]。相反的是，α1 亞基據(jù)報道在前列腺癌中表達下調(diào)[33]，因此，Na+/K+-ATPase的α亞基代表了一些與不良預(yù)后相關(guān)的癌癥類型的潛在新靶點。人 A549 非小細胞肺癌細胞中α1亞基的特異性敲除顯著降低了它們的遷移和增殖，進一步表明α1亞基作為這種腫瘤的治療靶標的潛在用途[28]。此外，β 亞基不僅在 Na+/K+-ATPase本身的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而且在抑制癌癥轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生的抗腫瘤作用中扮演重要角色，這一點現(xiàn)在被越來越多的人所了解。β 亞基的表達量在腫瘤中也發(fā)生了變化，已經(jīng)有許多報道證實 Na+/K+-ATPase的β1 亞基在人上皮癌細胞中表達下調(diào)。Espineda等[34]指出，當腫瘤細胞下調(diào)β1 表達時，會顯著減少鈣粘蛋白表達，這促使腫瘤細胞彼此相互分離，有利于它們的遷移和轉(zhuǎn)移。因此，β1 亞基的下調(diào)似乎是許多上皮癌細胞變得獨立侵襲的必要條件。此外，有研究報道 β 亞基的表觀遺傳調(diào)控，即 ATP1B1 甲基化下調(diào) β 亞基的表達能促進腎癌細胞的生長，強心苷類藥物由于能抑制 Na+/K+-ATPase活性而被證明對癌細胞具有抗增殖作用。

除了已發(fā)表文章外，也有許多專利強調(diào)了 Na+/K+-ATPase作為未來抗腫瘤靶點的可能性，Rajasekaran報告發(fā)現(xiàn)，膀胱癌早期階段 Na+/K+-ATPase蛋白的總體表達水平較低，隨著腫瘤的進展，表達水平會增加。α 亞基高表達和 β 亞基低表達的患者有早期復(fù)發(fā)的高風險；而具有低表達 α 亞基和高表達 β 亞基的患者具有較長的無復(fù)發(fā)時間，這表明 Na+/K+-ATPase的 α 和 β 亞基表達水平是膀胱癌患者復(fù)發(fā)時間的有效預(yù)測因子[35]。類似的，研究人員報道，在腎透明細胞癌中β亞基表達降低可能與腎透明細胞癌的侵襲性有關(guān)[36]。相比之下，Venta Na Medical Systems發(fā)現(xiàn)宮頸組織中 Na+/K+-ATPase β1 亞基表達的增加與宮頸從低度到高度發(fā)育不良直到宮頸癌的發(fā)病進展相關(guān)，可作為宮頸癌發(fā)病的生物標志物[37]?？傊琋a+/K+-ATPase的表達在大多數(shù)癌組織中發(fā)生改變似乎是非常明顯的，因此可以作為一種有用的新的生物標志物和治療靶點。

3 Na+/K+-ATPase對腫瘤的促進作用

由于存在結(jié)構(gòu)上的突變以及酶活性的波動，Na+/K+-ATPase參與一些疾病如糖尿病，阿爾茨海默病的發(fā)病機制[17]，最近，逐漸有報道發(fā)現(xiàn) Na+/K+-ATPase也參與促進腫瘤生長的部分機制，影響包括上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化 (EMT)、絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 級聯(lián)過程、磷酸肌醇3激酶 (PI3K) /蛋白激酶B (Akt) /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 信號通路、膽固醇穩(wěn)態(tài)等細胞過程和途徑。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)展和侵襲的關(guān)鍵過程，Na+/K+-ATPase的 β 亞基已被證明有助于調(diào)節(jié)特定細胞上皮極化的完整性，相鄰的 β 亞基之間形成二聚體，通過 β - β 橋增強細胞間的黏附。當β亞基的表達增高時，鈣黏蛋白(E-cadherin)的活性降低，從而導(dǎo)致 EMT 和癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[38]。

MAPK 家族與細胞周期，增殖凋亡相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，強心苷類藥物 G 毒毛旋花苷能通過抑制 v-src 禽肉瘤 Na+/K+-ATPase活性活化 p38 MAPK，從而上調(diào) p53 等轉(zhuǎn)錄因子的表達[39]，此外，MAPK 信號通路的激活還能促進核因子-κB(NF-κB)表達，從而激發(fā) Fas 介導(dǎo)的細胞凋亡[40]。

PI3K/Akt/mTOR通路參與調(diào)節(jié)細胞增殖，凋亡和自噬，Barwe等[41]發(fā)現(xiàn)PI3K的激活與Na+/K+-ATPase的α亞基的表達增加有關(guān)，即調(diào)節(jié)亞基 p85 結(jié)合到 α 亞基上富脯氨酸結(jié)構(gòu)域從而促進PI3K活性上調(diào)，從而調(diào)節(jié)細胞自噬，促進腫瘤細胞存活。

膽固醇也能與催化亞基 - α 亞基結(jié)合，兩者的相互作用已被證明可以調(diào)節(jié)膽固醇的運輸、合成和代謝。α亞基能與小窩蛋白-1的 N 端結(jié)構(gòu)域相互作用從而調(diào)節(jié)細胞膜上小窩蛋白-1和膽固醇的含量，鈉鉀泵表達降低破壞了對質(zhì)膜上膽固醇運輸和合成的調(diào)節(jié)，Na+/K+-ATPase作為膽固醇代謝調(diào)節(jié)劑的作用可能是腫瘤生長如乳腺癌的關(guān)鍵因素[42-43]。

此外，也有文獻報道抑制 Na+/K+-ATPase后影響細胞鈣穩(wěn)態(tài)，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞的程序性死亡[44]。在耐藥的膠質(zhì)母細胞瘤細胞中，當 G 毒毛旋花苷上調(diào) ATP1A2 和 ATP1A3 表達時，可使腫瘤細胞對化療藥物敏感，并誘導(dǎo)細胞壞死[45]。

4 Na+/K+-ATPase抑制劑作為新型抗腫瘤藥物的臨床前研究

4.1 強心苷類藥物結(jié)構(gòu)特征 強心苷類化合物包括強心甾和蟾蜍二烯內(nèi)酯，是一類17位有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的甾體核結(jié)構(gòu)。由于甾核骨架和17位內(nèi)酯結(jié)構(gòu)上取代基以及空間立體結(jié)構(gòu)具有多樣性，強心苷類藥物具有多種類型[46]，其中最廣為人知的有地高辛，洋地黃毒苷，G 毒毛旋花苷，夾竹桃苷等。自從1785年Sir William Withering出版《關(guān)于毛地黃的記述》開始，臨床醫(yī)生就使用洋地黃制劑來治療水腫、心律不齊和慢性心力衰竭。強心苷類藥物，尤其是洋地黃現(xiàn)在仍廣泛用于治療充血性心力衰竭和心律失常的正性肌力藥物[47]。目前人們普遍認為強心苷類藥物介導(dǎo)的效應(yīng)主要是由該類藥物與 Na+/K+-ATPase相互作用并抑制 Na+/K+-ATPase活性產(chǎn)生的[48]。

4.2 強心苷類藥物的抗腫瘤作用 近些年有關(guān)強心苷類藥物抗腫瘤作用的報道顯著增加，除了對腫瘤細胞有效的抗增殖作用之外，令人感興趣的是它們在對正常細胞和腫瘤細胞表現(xiàn)出不同的作用。對于正常細胞，強心苷類藥物是沒有活性的，甚至表現(xiàn)出促增殖作用，但卻能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[26]。Jiang等[49]發(fā)現(xiàn)強心苷蟾毒靈能通過抑制p38 MAPK信號通路在非小細胞肺癌細胞中展示出抗增殖活性。原海蔥苷A是另一種強心苷，已被證明可以抑制膠質(zhì)母細胞瘤增殖和誘導(dǎo)其凋亡，同時提高小鼠的存活率[50]。強心苷還能通過不同機制對乳腺癌的生長具有抑制作用，Kometiani等[51]發(fā)現(xiàn)G 毒毛旋花苷通過抑制 Na+/K+-ATPase介導(dǎo)的表皮生長因子受體(Src/EGFR)和 p42/44絲裂原活化蛋白激酶的激活，調(diào)節(jié) p21 Cip 介導(dǎo)的通路，導(dǎo)致雌激素受體陰性的人乳腺癌細胞系MDA-MB-435的細胞周期阻滯，抑制細胞生長。

4.3 新型 Na+/K+-ATPase抑制劑的研究進展 除了大量關(guān)于新的潛在抗腫瘤強心苷的分離和鑒定的科學(xué)文獻外，在強心苷結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，設(shè)計優(yōu)化新的 Na+/K+-ATPase抑制劑和配體作為潛在抗腫瘤藥物的報道也顯著增加。在分析了 Na+/K+-ATPase的結(jié)合口袋和具代表性的強心苷藥物的結(jié)構(gòu)特點后，有文獻確定了導(dǎo)致抗腫瘤活性的關(guān)鍵 Na+/K+-ATPase抑制劑結(jié)構(gòu)特征：需有10位的醛基(-COH)；14位的-羥基(氫鍵供體基團)，環(huán)C和環(huán)D的順式構(gòu)型；和位于17位的強心甾或蟾蜍二烯內(nèi)酯基團，這些是 Na+/K+-ATPase抑制劑對腫瘤生長具有高抑制作用所必需的[26，52]。如Lefranc等[53]發(fā)現(xiàn) UNBS1450(一種新型的強心苷類藥物)能顯著降低膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)ATP濃度，擾亂肌動蛋白細胞骨架，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細胞自噬死亡。PBI-05204作為一種夾竹桃苷的結(jié)構(gòu)改造物，在與吉西他濱聯(lián)合治療后，不僅降低了夾竹桃苷的細胞毒性作用，還提高了吉西他濱的抗腫瘤活性[54]。

5 討論與展望

Na+/K+-ATPase作為一種遍布全身的重要酶類，當結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變時，會引起腫瘤等疾病。 Na+/K+-ATPase最初被定義為細胞滲透壓調(diào)節(jié)器，但越來越多的研究證明它還能參與細胞內(nèi)各種信號傳導(dǎo)途徑并調(diào)節(jié)它們的功能。近些年來逐漸有報道將其作為治療癌癥的潛在藥物靶點。盡管 Na+/K+-ATPase的整體表達被認為是癌癥復(fù)發(fā)潛在風險預(yù)測因子，但預(yù)測方式具體還是表現(xiàn)在不同亞基的表達水平。如高表達α亞基低表達β亞基被認為是腫瘤復(fù)發(fā)的高風險因素，低α表達水平高β表達水平的患者腫瘤復(fù)發(fā)風險低。α亞基作為信號傳導(dǎo)元件，能調(diào)控影響腫瘤細胞生存和生長多種通路，越來越受到人們的關(guān)注。但有關(guān)β亞基在腫瘤調(diào)控中發(fā)揮的作用的研究較少，β 亞基在抑制腫瘤細胞黏附和腫瘤發(fā)展中的作用也尚未清楚，未來對β亞基與腫瘤的關(guān)系的研究可能會揭示其與不同腫瘤的相關(guān)性，進一步揭示 Na+/K+-ATPase在腫瘤進展中發(fā)揮的整體作用。

盡管作為天然存在的 Na+/K+-ATPase的抑制劑，強心苷類藥物已經(jīng)被用于治療心功能不全很長一段時間了，但是它們在腫瘤治療中的作用也是不可忽視的。了解強心苷在癌癥發(fā)展和生長過程中的作用可以幫助我們進一步了解如何治療癌癥。最新研究認為強心苷類藥物通過改變細胞內(nèi)外的離子濃度來抑制 Na+/K+-ATPase的功能，也許只是其眾多抑制腫瘤生長的機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，強心苷可通過內(nèi)源性和外源性途徑以及自噬途徑觸發(fā)癌細胞凋亡，可作為另一種抗腫瘤機制。有關(guān)強心苷類藥物的抗腫瘤活性機制還需進一步研究。迄今為止，關(guān)于使用強心苷作為抗癌藥物的所有公開臨床數(shù)據(jù)都限于實體瘤。這些臨床研究大多樣本量較小，并且沒有隨機對照，因此，數(shù)據(jù)需進一步證實。系統(tǒng)藥理學(xué)的方法能在分子和細胞水平上更好地理解強心苷如何殺死腫瘤細胞，這可能有助于確定強心苷干預(yù)的主要靶點和信號通路。