肖婉露，馬培芳,2，張 偉,2，王繼蕓,2，張國(guó)娜,2，蔣欽群，李紀(jì)軍,2

(1.平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南 平頂山 467001；2.河南省韭菜工程技術(shù)研究中心 河南 平頂山 467001)

農(nóng)作物及果樹(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展都依賴于高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種，而常規(guī)的雜交育種法往往需要親本雜交之后再通過(guò)6～8代的回交和定向篩選才能實(shí)現(xiàn)優(yōu)良性狀的遺傳改良。利用孤雌生殖、孤雄生殖或者無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體再經(jīng)過(guò)染色體加倍恢復(fù)育性的單倍體育種技術(shù)則可以直接獲得優(yōu)良純合個(gè)體，可以大大縮短育種進(jìn)程[1]。然而，單倍體的自然發(fā)生率只有0.05%～0.1%[2]，所以通過(guò)人工干預(yù)獲得單倍體是實(shí)際育種中常用的方法。自從Guha和Maheshwari[3]首次發(fā)現(xiàn)花粉?？梢悦撾x正常配子體途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑并在體外誘導(dǎo)胚狀體后產(chǎn)生單倍體植株后，小孢子培養(yǎng)技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)。目前該技術(shù)已經(jīng)在小麥、玉米、辣椒、白菜、茄子等作物中廣泛應(yīng)用，在果樹(shù)中應(yīng)用還比較少，僅在油橄欖[4]、柑橘[5]等少量物種中有相關(guān)報(bào)道。這一技術(shù)的推廣很大程度上受到育種材料基因型和技術(shù)體系成熟度的限制。本文結(jié)合目前植物小孢子的研究現(xiàn)狀，綜述了影響小孢子培養(yǎng)的主要因素進(jìn)行以及小孢子培養(yǎng)技術(shù)面臨的問(wèn)題和對(duì)未來(lái)的展望。

1 小孢子培養(yǎng)技術(shù)原理及應(yīng)用

植物小孢子培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)都是常用的單倍體育種方法。小孢子培養(yǎng)是通過(guò)直接從花蕾或者花藥中分離新鮮的小孢子，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，采用適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體從而獲得單倍體植株，再通過(guò)技術(shù)手段使染色體加倍，獲得純合可育的雙單倍體(DH)的過(guò)程。與花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)可以排除花藥壁和絨氈層細(xì)胞的干擾，保證所獲得的植株是小孢子發(fā)育所得。小孢子培養(yǎng)所得良后代性狀不分離，且表現(xiàn)整齊一致，明顯縮短了育種年限。作為遺傳工程中的一個(gè)工具，小孢子培養(yǎng)技術(shù)還可用于與遠(yuǎn)緣雜交相結(jié)合創(chuàng)制育種新材料、進(jìn)行抗病、抗逆種質(zhì)的篩選、與誘變技術(shù)相結(jié)合創(chuàng)制突變體、用于遺傳作圖等方面[6～8]。

2 小孢子胚狀體誘導(dǎo)的主要影響因素

2.1 供體植株的基因型

基因型是影響小孢子出胚率的最重要因素之一，這不僅體現(xiàn)在物種間，物種內(nèi)也有所體現(xiàn)[9]。姚悅海對(duì)12個(gè)羽衣甘藍(lán)品種進(jìn)行小孢子培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中有1個(gè)品種不能誘導(dǎo)出胚狀體，其它11個(gè)品種的出胚數(shù)最小值和最大值則分別為0.94和11.84[10]。趙艷艷在對(duì)10個(gè)菜心品種進(jìn)行小孢子培養(yǎng)優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)只有3個(gè)品種獲得了胚狀體[11]。Pawel Nowaczyk[12]還發(fā)現(xiàn)，胚狀體誘導(dǎo)率差異較大的兩種基因型的母本雜交后產(chǎn)生的F1代，誘導(dǎo)率處于二者之間，吳藝飛進(jìn)行紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究時(shí)，也得出同樣的結(jié)論[13]。這一發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)優(yōu)化小孢子培養(yǎng)條件，嘗試用小孢子產(chǎn)胚率高的品種與產(chǎn)胚率低的品種雜交來(lái)突破基因型對(duì)小孢子培養(yǎng)的限制。

2.2 小孢子發(fā)育時(shí)期

理論上講，小孢子各個(gè)發(fā)育階段都具有全能性。但是在實(shí)際離體培養(yǎng)的過(guò)程中，不同時(shí)期的小孢子誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體的能力是有很大差別的，這在不同的物種以及同一物種的不同基因型之間都有所體現(xiàn)。目前已報(bào)道可成功誘導(dǎo)胚狀體的植物中大多是處在小孢子單核靠邊期至雙核早期時(shí)誘導(dǎo)效果最佳[14～15]。小孢子的發(fā)育時(shí)期又和花蕾的外部形態(tài)、花藥的顏色等相關(guān)聯(lián)。湯泳萍在對(duì)蘆筍小孢子培養(yǎng)研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)花蕾縱徑在2.099～2.284 mm，花蕾橫徑1.749～1.891 mm，花藥長(zhǎng)度1.149～1.225 mm，是小孢子培養(yǎng)最佳發(fā)育時(shí)期，此時(shí)小孢子正處于單核靠邊期[16]。陳琛做了胡麻花蕾大小與小孢子發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)胡麻花蕾的不同長(zhǎng)度也對(duì)應(yīng)小孢子發(fā)育的不同時(shí)期[17]。據(jù)此，可以根據(jù)花蕾或者花藥的形態(tài)來(lái)挑選最佳發(fā)育時(shí)期的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 預(yù)處理

預(yù)處理是誘導(dǎo)小孢子由配子體發(fā)育轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育的重要因素之一。常用的方法包括熱激處理、低溫處理、鹽處理等。預(yù)處理的目的在于人為地改變小孢子的內(nèi)在狀態(tài)，從而誘導(dǎo)小孢子轉(zhuǎn)入孢子體發(fā)育[18]。4℃低溫預(yù)處理24～48 h及33～34℃高溫?zé)峒?4～48 h都能有效促進(jìn)葉用芥菜誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體[19]。32℃預(yù)處理2 d能夠提高水稻小孢子的愈傷產(chǎn)量和綠苗率，離體穗低溫處理21 d促進(jìn)大麥游離小孢子產(chǎn)生胚狀體效果最佳，同時(shí)10 mg·L-1秋水仙堿預(yù)處理也能明顯提高水稻小孢子的愈傷產(chǎn)量[20]。在大麥花萌發(fā)期和小孢子期分別用15 g·L-1和0.3 g·L-1的NaCl溶液進(jìn)行預(yù)處理后，能夠顯著提高小孢子愈傷產(chǎn)量[21]。范適還發(fā)現(xiàn)僅低溫預(yù)處理的茄子小孢子不能啟動(dòng)小孢子脫分化，但是在低溫處理一定時(shí)間后再進(jìn)行熱激處理則能極大提高小孢子胚狀體的誘導(dǎo)頻率[22]。因此不同的植物要通過(guò)試驗(yàn)來(lái)選擇其適宜的預(yù)處理方法來(lái)提高小孢子誘導(dǎo)頻率。

2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分和激素

目前用于小孢子誘導(dǎo)的培養(yǎng)基有NLN、B5、MS、N6等，其中MS培養(yǎng)基含有較高濃度的無(wú)機(jī)鹽，B5的銨濃度較低，N6多用于禾谷類。對(duì)于不同的物種需要調(diào)節(jié)碳源、氮源、pH值等條件來(lái)找出最適宜的配方。有研究表明把NLN培養(yǎng)基的蔗糖濃度調(diào)節(jié)至13%，在多種十字花科植物小孢子培養(yǎng)中能達(dá)到最佳效果[23～24]。大部分的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還需要添加一定的激素作為誘導(dǎo)劑來(lái)促進(jìn)小孢子發(fā)育為胚狀體，激素的配比及濃度是提高胚狀體誘導(dǎo)成功率主要因素之一，常用的激素有NAA、6-BA、ZT等。不同的物種適宜的基本培養(yǎng)基及激素不同。蕪菁小孢子有最佳誘導(dǎo)效果的是基本培養(yǎng)基中添加0.05 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA對(duì)有最佳的誘導(dǎo)效果[23]。誘導(dǎo)菜心小孢子時(shí)，在蔗糖濃度100 g·L-1的NLN中添加0.1 mg·L-16-BA和NAA效果最佳[25]。在改良過(guò)的N6培養(yǎng)基中添加1.5～2.0 mg·L-1的2，4-D則能有效優(yōu)化大麥小孢子高頻再生體系[26]。此外，高素燕對(duì)32個(gè)不同基因型的辣椒進(jìn)行小孢子誘導(dǎo)胚狀體時(shí)，還發(fā)現(xiàn)同樣的物種中不同的基因型適宜添加的激素濃度也是有所差異的[27]。不過(guò)也有研究顯示，有些基因型不添加激素就可以成功誘導(dǎo)胚狀體，添加激素反而會(huì)降低出胚率甚至不出胚，而且可能會(huì)胚畸形[28]。所以在實(shí)際的育種試驗(yàn)中要先篩選出適合該基因型的基本培養(yǎng)基，然后再參考植株再生所用的激素進(jìn)行不同的配比試驗(yàn)，優(yōu)化小孢子培養(yǎng)體系。

2.5 外源添加物

培養(yǎng)基中的外源添加物在胚誘導(dǎo)中不是決定性因素，但是會(huì)影響小孢子胚誘導(dǎo)頻率。其中活性炭是常用的一種添加物。許多研究表明小孢子培養(yǎng)過(guò)程中添加會(huì)產(chǎn)生酚類等有害物質(zhì)，會(huì)降低胚狀體的發(fā)生頻率。天然吸附劑活性炭常被用于吸附這類有害物質(zhì)。王葆生的研究表明，添加活性炭有利于胡蘿卜小孢子胚的誘導(dǎo)，最佳濃度為0.2 g·L-1[29]。有些植物中，由于不同品種在培養(yǎng)過(guò)程中釋放有害物量不同，所以活性炭產(chǎn)生的效果有所差異[30]。也有研究表明活性炭在小孢子培養(yǎng)中是必須的，但是不同濃度的活性炭對(duì)總胚狀體的產(chǎn)量影響沒(méi)有顯著差異[31]。此外，也有研究低濃度的AgNO3[32]以及一定濃度的氨基酸類添加物[33]也有利于小孢子胚狀體誘導(dǎo)。

2.6 植株組織共培養(yǎng)

植物花藥壁、子房等組織與小孢子共培養(yǎng)也是影響小孢子胚狀體的誘導(dǎo)頻率的因素之一，在許植物中都已經(jīng)證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。小麥誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入未成熟的小麥子房與小孢子共培養(yǎng)，可以顯著提高胚狀體的質(zhì)量，增加胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生能力[34]?；ㄋ幈诮M織與小孢子共培養(yǎng)能顯著提高茄子小孢子胚狀體的誘導(dǎo)頻率[22]。Lantos等[35]利用小麥或辣椒子房共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)辣椒胚狀體，發(fā)現(xiàn)小麥子房共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生胚狀體，誘導(dǎo)效果甚至優(yōu)于辣椒子房共培養(yǎng)。子房和花藥壁組織促進(jìn)小孢子胚誘導(dǎo)的機(jī)理，目前還無(wú)定論，有學(xué)者猜測(cè)可能是因?yàn)樽臃吭谛℃咦诱T導(dǎo)過(guò)程中會(huì)釋放一些含有PAA或者類似物及某些氨基酸類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[36]。

3 胚狀體再生

胚狀體分化成植株是小孢子培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)之一。該階段主要的影響因素是培養(yǎng)基組分。一般的做法是參考適宜于供試材料的分化培養(yǎng)基組分，通過(guò)對(duì)激素濃度、碳源成分、pH值等條件調(diào)節(jié)進(jìn)行改良。梁超凡研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)MS培養(yǎng)基+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA+活性炭1 mg·L-1+蔗糖濃度為3%+瓊脂濃度為1.2%)能夠簡(jiǎn)單有效地誘導(dǎo)不接球白菜小孢子胚狀體發(fā)育成植株[37]，不定芽成苗MS培養(yǎng)基中添加5μmol·L-1MT和0.1 mg·L-1NAA與對(duì)照相比能顯著性地促進(jìn)甘藍(lán)DH植株生根和快速健壯生長(zhǎng)[38]。培養(yǎng)基中的添加物也會(huì)對(duì)成苗率有較大的影響。有研究表明添加亞甲藍(lán)能將大白菜小孢子形成胚狀體的成苗率提高1.40～1.67倍[39]。王玉書(shū)在做羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)子葉形胚植株再生頻率顯著高于其它類型的胚，心形胚、球形胚和畸形胚只有很小一部分能發(fā)育形成植株[40]，一些研究也表明胚齡的長(zhǎng)短及轉(zhuǎn)分化的時(shí)間也是影響胚狀體成苗的一個(gè)主要原因[41]。此外，胚狀體發(fā)育的其它外部條件，如溫度、光照、通氣條件等也會(huì)對(duì)小孢子胚狀體再生植株產(chǎn)生一定的影響。

4 問(wèn)題與展望

目前小孢子培養(yǎng)技術(shù)在十字花科、禾本科植物中應(yīng)用較為成熟，在大白菜、甘藍(lán)、菜心、小麥等植物中都建立了完整的培養(yǎng)體系。但是其他的作物以及木本植物中誘導(dǎo)成功的相關(guān)報(bào)道還比較少，魏凌鶴對(duì)柑橘進(jìn)行花藥和小孢子培養(yǎng)創(chuàng)制單倍體時(shí)，花藥培養(yǎng)可以成功誘導(dǎo)胚狀體，而小孢子培養(yǎng)始終沒(méi)有成功[5]。一些植物小孢子可以成功誘導(dǎo)成胚胎發(fā)育，但是誘導(dǎo)出的胚狀體發(fā)育能力較差，再生植株成功率低[42]。雖然目前也有一些研究從胚胎發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、代謝水平、分子水平等方面探究了小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制，但是小孢子孢子體發(fā)育的誘導(dǎo)機(jī)制、啟動(dòng)機(jī)制尚不明確。今后應(yīng)著重以下幾方面的工作：

(1)參考已經(jīng)建立的技術(shù)體系，對(duì)其它植物進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化和嘗試，使小孢子培養(yǎng)技術(shù)更廣泛的應(yīng)用。

(2)基因型影響小孢子培養(yǎng)的最關(guān)鍵因素，但差異是由哪些基因控制,其細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)及基因表達(dá)是否有差異,培養(yǎng)技術(shù)改良是否要依據(jù)基因型差異而改變等方面需要進(jìn)一步研究。結(jié)合轉(zhuǎn)基因組進(jìn)一步揭示小孢子胚發(fā)生的分子機(jī)制。

(3)外界條件能夠誘導(dǎo)小孢子向孢子途徑發(fā)育，但是可誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的外界條件在不同的物種甚至同一物種的不同基因型之間都有很大的差異。小孢子改變配子體向孢子體發(fā)育的的途徑受到什么調(diào)控，轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育后生理生化會(huì)有什么變化，二者之間是否存在什么聯(lián)系，這些問(wèn)題都需要進(jìn)一步論證。