李明源,王繼蓮,周 茜,張 甜,美合熱阿依·木臺(tái)力甫

1 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院,喀什 844006 2 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,喀什 844006 3 新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,喀什 844006

鹽生植物是一類能在鹽濃度200 mmol/L NaCl或更高的環(huán)境中生長(zhǎng)并完成生活史的植物,其對(duì)鹽分脅迫的適應(yīng)性具有復(fù)雜的生化和遺傳機(jī)制[1]。多數(shù)鹽生植物是鹽堿地中唯一能夠正常生存的植物種類,它們?cè)邴}堿地植被建植、水土保持及生態(tài)平衡的維系等方面起著至關(guān)重要的作用[2- 4]。在過(guò)去的幾十年,有關(guān)鹽生植物耐鹽堿脅迫的生理機(jī)制和基因表達(dá)變化等方面取得了很大進(jìn)展[5-6],但單純利用傳統(tǒng)育種方法或基因工程改造技術(shù)來(lái)培育抗鹽堿植物,提升作物抗鹽堿能力的成效有限。研究發(fā)現(xiàn),采用生物接種方法,即將鹽生植物根際的少數(shù)有益微生物如叢枝菌根真菌(AMF)接種于植物,能有效緩解鹽堿脅迫對(duì)非鹽生植物生長(zhǎng)的抑制作用[7- 9],對(duì)非鹽生植物在鹽堿環(huán)境中的生長(zhǎng)、養(yǎng)分吸收及改善土壤質(zhì)量有積極影響[8, 10-11]。挖掘鹽生植物根際的有益微生物作為促進(jìn)非鹽生植物生產(chǎn)的有效生物接種劑,被認(rèn)為是可持續(xù)提高非鹽生植物耐鹽堿性的有效策略[12-13]。

根際微生物與植物關(guān)系最為密切,它們以植物根系分泌物為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖, 通過(guò)分泌各種胞外酶分解、礦化土壤中的有機(jī)物質(zhì)等增加土壤有效養(yǎng)分含量, 提高植物對(duì)養(yǎng)分的吸收[14-15]。而植物在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)根系主動(dòng)向根際土壤分泌生物活性物質(zhì), 吸引大量有益微生物在根際聚居并促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育, 進(jìn)而對(duì)根際微生物種類和數(shù)量產(chǎn)生影響[16-17]。研究顯示,鹽堿化問(wèn)題的加劇不僅會(huì)對(duì)土壤微生物活性和群落組成產(chǎn)生直接影響,還能通過(guò)影響植物根系和土壤動(dòng)物活動(dòng)等對(duì)其產(chǎn)生間接作用[18-19]。在鹽堿土壤種植鹽生植物后,既能有效降低根際土壤鹽度,使土壤微生物數(shù)量增加,同時(shí)還會(huì)促使根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,通過(guò)介導(dǎo)土壤環(huán)境反過(guò)來(lái)影響鹽生植物生長(zhǎng)[13, 20- 21]。諸多學(xué)者相繼開(kāi)展了荒漠區(qū)、高寒草地等生境土壤真菌群落研究[22-23],分析了其與環(huán)境因子的互作效應(yīng),但有關(guān)鹽生植物根際土壤真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

不同鹽生植物的耐鹽堿能力不同,導(dǎo)致鹽生植被的空間格局受鹽堿化程度影響呈現(xiàn)一定地域性差異。新疆作為我國(guó)最大的鹽土區(qū),土壤鹽分高,堿性重,嚴(yán)重限制了植物的分布和生存。而南疆又是全疆鹽堿化趨勢(shì)最嚴(yán)重的區(qū)域[24],在這樣的生境中卻生長(zhǎng)著豐富的鹽生植物,其中一些種群還在鹽堿荒漠植被形成過(guò)程中起著主要建群作用,被認(rèn)為是適合土壤修復(fù)的類群。這些土著鹽生植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征如何？同一鹽堿環(huán)境中不同種類的鹽生植物根際微生物群落有何共性特征和個(gè)性差異？對(duì)這類環(huán)境中不同鹽生植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,有助于發(fā)現(xiàn)對(duì)鹽生植物耐鹽堿脅迫有貢獻(xiàn)的有益微生物類群,對(duì)其開(kāi)發(fā)利用在增強(qiáng)非鹽生植物抗逆性方面有巨大潛力。本研究以新疆南疆伽師縣同一鹽堿地中的四種鹽生植物為材料,采用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)其根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析,并研究真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子間的相關(guān)性,旨在探究對(duì)鹽生植物耐受鹽堿脅迫有顯著影響的關(guān)鍵微生物群落,為鹽堿地合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及根際土壤樣品采集

伽師縣堪稱新疆南疆水苦低產(chǎn)的鹽堿窩,位于天山南麓,塔里木盆地西緣,是塔克拉瑪干沙漠西緣的一塊綠洲。該區(qū)域地理坐標(biāo)76°20′—78°00′E,39°16′—40°00′N,屬溫帶干旱荒漠氣候,多年平均降水量56 mm,年蒸發(fā)量是年降水量的40倍。20世紀(jì)80年代全國(guó)第二次土壤普查結(jié)果表明,伽師縣非鹽堿化農(nóng)耕土地面積僅占全縣耕地面積的1.9%,輕度鹽堿化土地占14.2%,中度鹽堿化土地占21.0%,重度鹽堿化土地達(dá)63.0%[25]。土壤鹽堿化已成為限制該地區(qū)植物生存和演替的主要因子,導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)改變和肥力下降,加速了土地退化進(jìn)程。研究區(qū)內(nèi)植被主要包括檉柳(Tamarixchinensis)、鹽穗木(Halostachyscaspica)、黑果枸杞(Lyciumruthenicum)、花花柴(Kareliniacaspia)、鹽爪爪(Kalidiumfoliatum)、旱生蘆葦(Phragmitesaustralis)、駱駝刺(Alhagisparsifolia)和堿蓬(Suaedaglauca),交錯(cuò)分布。

2019年8月,依據(jù)典型性和代表性原則,采集伽師縣夏普吐勒鄉(xiāng)境內(nèi)非開(kāi)墾干旱鹽堿荒地(76°55′E,39°49′N)鹽爪爪、黑果枸杞、花花柴和旱生蘆葦四種優(yōu)勢(shì)土著鹽生植物根際土壤。采樣方法為多點(diǎn)混合采樣法,即在樣區(qū)內(nèi)采取“S”型路線隨機(jī)布點(diǎn)12處,樣點(diǎn)之間距離不少于20 m。每種植物在每個(gè)采樣點(diǎn)均選取生長(zhǎng)旺盛且冠幅大小一致的健康個(gè)體采集1—2株。先去除0—5 cm的表土,深挖取出整株根系(約20—40 cm),輕輕抖去根系上附著較松散的土壤,保留與根系緊密結(jié)合的土壤(約1—3 mm),小心剪下根系裝入50 mL無(wú)菌離心管中,每3個(gè)相鄰樣點(diǎn)采集的相同植物根系再混合為一個(gè)樣品,最終得到每種植物4個(gè)重復(fù)樣品,4種植物共16個(gè)樣品,于低溫下帶回實(shí)驗(yàn)室,迅速進(jìn)行根際土壤基因組提取。

1.2 研究方法

1.2.1土壤理化性質(zhì)分析

相同植物根際土壤樣品以四分法混勻,過(guò)篩去除雜草、礫石等雜質(zhì),參照《土壤農(nóng)化分析》方法測(cè)定土壤理化指標(biāo)[26]。采用電位法測(cè)定土壤pH；水土比5∶1混合測(cè)定土壤電導(dǎo)率(EC)；105℃烘干稱重法測(cè)定土壤含水量(SWC)；重鉻酸鉀容重法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)；重鉻酸鉀-硫酸消煮法測(cè)定土壤全氮(TN)；硫酸-高氯酸消煮、鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷(TP)；NaOH熔融-火焰光度法測(cè)定土壤全鉀(TK)；堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤速效氮(AN)；NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤速效磷(AP)；NH4OAc浸提-火焰光度法測(cè)定土壤速效鉀(AK)。

1.2.2土壤基因組DNA提取

采用土壤基因組DNA提取試劑盒(OMEGA E.Z.N.A. Soil DNA Kit, USA)提取總DNA。向裝有植物根系的50 mL離心管中加入生理鹽水(0.85% NaCl)30 mL,約30顆無(wú)菌玻璃珠(φ3 mm),渦旋振蕩10 min后棄根系,所得根際土壤溶液經(jīng)4℃、16000 g離心10 min棄上清,參照土壤基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),利用微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)檢驗(yàn)基因組純度和濃度后于-20℃保存。

1.2.3真菌ITS基因擴(kuò)增與測(cè)序

以土壤總DNA為模板,采用引物ITS1- 1F-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3′)和ITS1- 1F-R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3′)擴(kuò)增真菌ITS1基因片段,每個(gè)DNA模板做三個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)條件參照Miao等[27]方法：95℃,2 min；95℃,30 s;55℃,30 s;72℃,45 s;30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送測(cè)序公司(北京諾禾致源生物信息科技有限公司),采用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

依據(jù)PCR擴(kuò)增引物和Barcode序列對(duì)Illumina NovaSeq下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步拆分,得到各樣品的原始數(shù)據(jù)。去除Barcode序列和低質(zhì)量堿基后,使用FLASH(V1.2.7)軟件拼接各樣品的原始序列,得到Clean Tags,再進(jìn)行嵌合體過(guò)濾,得到最終有效數(shù)據(jù)[28]。利用Uparse軟件(Uparse V7.0.1)對(duì)各樣品有效數(shù)據(jù)在97%相似性水平上進(jìn)行操作分類單元(OTU)截?cái)嗑垲?同時(shí)篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列。利用Qiime軟件(V1.9.1)中的blast方法與Unit(V7.2)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋,并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE(3.8.31)軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)建樹(shù),獲取全部OTUs代表序列的系統(tǒng)分類地位。各樣品最終數(shù)據(jù)經(jīng)均一化處理后使用Qiime軟件計(jì)算豐富度和多樣性指數(shù)；利用R軟件繪制Rank Abundance曲線、稀釋曲線以及PCA圖等；通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)研究土壤真菌群落和理化因子之間的相關(guān)性。利用SPSS 21.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

四種鹽生植物根際土壤理化特征不盡相同(表1)。土壤pH均超過(guò)8.0,但鹽爪爪與旱生蘆葦顯著高于黑果枸杞和花花柴。EC由高到低為旱生蘆葦>鹽爪爪>花花柴>黑果枸杞,說(shuō)明旱生蘆葦與鹽爪爪根際土壤中混合鹽含量明顯高于花花柴和黑果枸杞,能聚集鹽離子或更偏好高鹽堿環(huán)境。黑果枸杞根際土壤的SOM、TN、TP、TK、AN和AP值均最高,旱生蘆葦根際土壤的SOM、TN、TP、TK和AN值均最低,但SWC和EC值最高。

表1 四種鹽生植物根際土壤理化特征

2.2 真菌群落豐度及多樣性分析

測(cè)序結(jié)果表明,各樣本測(cè)得有效數(shù)據(jù)長(zhǎng)度在238—241 bp之間,平均長(zhǎng)度239左右。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控后共得到981983條有效序列(表2),以97%的一致性將序列聚類成564個(gè)OTUs。由各樣本稀釋曲線可見(jiàn)(圖1),隨測(cè)序深度增加,曲線趨向平坦,說(shuō)明樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,能夠準(zhǔn)確反映四種鹽生植物根際土壤真菌群落特征。四種鹽生植物根際土壤真菌群落豐富度(ACE、Chao 1指數(shù))依次為鹽爪爪>旱生蘆葦>黑果枸杞>花花柴,黑果枸杞與花花柴根際真菌豐富度指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)依次為鹽爪爪>黑果枸杞>旱生蘆葦>花花柴,旱生蘆葦與黑果枸杞之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明四種鹽生植物根際真菌群落多樣性和豐富度各不相同。

表2 四種鹽生植物根際土壤真菌ITS測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及alpha多樣性分析

圖1 樣本稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for samplesA. 鹽爪爪; B. 黑果枸杞; C. 花花柴; D. 旱生蘆葦

根據(jù)聚類結(jié)果分析它們共有和特有的OTUs(圖2)。鹽爪爪和黑果枸杞共有的OTUs數(shù)量為250個(gè),鹽爪爪和花花柴共有的OTUs數(shù)量為216個(gè),鹽爪爪和旱生蘆葦共有的OTUs數(shù)量為332個(gè),黑果枸杞和花花柴共有的OTUs數(shù)量為192個(gè),花花柴和旱生蘆葦共有的OTUs數(shù)量為171個(gè),四種鹽生植物之間共有OTUs數(shù)量為153個(gè)。鹽爪爪、黑果枸杞、花花柴和旱生蘆葦特有的OTUs數(shù)量分別為51、19、11和53個(gè),占各自根際土壤真菌OTUs總數(shù)的9.04%、3.37%、1.95%和9.40%。

2.3 四種鹽生植物根際土壤真菌群落分布特征

2.3.1門水平群落組成與結(jié)構(gòu)

四種鹽生植物根際土壤樣品中共檢測(cè)出真菌8門、21綱、44目、89科、124屬。如圖3所示,子囊菌門 (Ascomycota)是四種鹽生植物根際土壤真菌的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群,其相對(duì)豐度在花花柴根際占比最高(94.8%),在旱生蘆葦根際占比最低(74.6%)。擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為亞優(yōu)勢(shì)菌門,在四種植物根際的相對(duì)豐度在0.3%—1%之間。排列第三的是壺菌門(Chytridiomycota),但該門僅分布在鹽爪爪和旱生蘆葦根際土壤中,相對(duì)豐度分別為0.93%和0.74%。被孢霉門(Mortierellomycota)在黑果枸杞根際土壤的相對(duì)豐度達(dá)1.1%,但在其它三種植物中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到?；赨nweighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹(shù)也可以發(fā)現(xiàn)(圖4),四種鹽生植物根際土壤真菌群落在門水平上相對(duì)豐度不一,鹽爪爪和旱生蘆葦根際土壤真菌群落組成更相似。

2.3.2屬水平群落組成與結(jié)構(gòu)

如圖5所示,四種鹽生植物根際土壤真菌群落在屬水平上相對(duì)豐度各不相同,優(yōu)勢(shì)菌屬和特有菌屬也不盡相同,鐮孢菌屬(Fusarium)、支頂孢屬(Acremonium)和曲霉屬(Aspergillus)是它們共有優(yōu)勢(shì)菌屬。從植物種類看,鹽爪爪根際土壤中相對(duì)豐度大于1%的屬分別為鐮孢菌屬(22.31%)、微囊菌屬(Microascus)(9.74%)、梨孢帚霉屬(Scopulariopsis)(7.37%)、青霉菌屬(Penicillium)(5.16%)、支頂孢屬(4.41%)、曲霉屬(2.97%)、瓶霉菌屬(Phialophora)(2.81%)、翅孢殼屬(Emericellopsis)(2.03%)、格孢腔菌屬(Pleospora)(2.03%)、單胞瓶霉屬(Phialemonium)(1.96%)和鏈格孢屬(Alternaria)(1.93%),其中鐮孢菌屬占主導(dǎo)地位。黑果枸杞根際土壤中相對(duì)豐度大于1%的屬分別為鐮孢菌屬(30.83%)、曲霉屬(15.26%)、鏈格孢屬(10.25%)、梨孢帚霉屬(9.85%)、青霉菌屬(4.21%)、支頂孢屬(3.25%)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)(2.77%)、翅孢殼屬(2.52%)和微囊菌屬(1.51%),其中鐮孢菌屬、曲霉屬和鏈格孢屬占主導(dǎo)地位。花花柴根際土壤中相對(duì)豐度大于1%的屬分別為支頂孢屬(43.65%)、鐮孢菌屬(14.28%)、梨孢帚霉屬(9.46%)、翅孢殼屬(8.73%)、閉小囊菌屬(Kernia)(6.80%)、青霉菌屬(3.23%)、曲霉屬(2.56%)和帚枝霉屬(Sarocladium)(1.01%),其中支頂孢屬和鐮孢菌屬占主導(dǎo)地位。旱生蘆葦根際土壤中相對(duì)豐度大于1%的屬分別為鐮孢菌屬(38.41%)、支頂孢屬(8.96%)、曲霉屬(7.98%)、鏈格孢屬(6.16%)、青霉菌屬(1.51%)和地絲霉屬(Geomyces)(1.04%),其中鐮孢菌屬占主導(dǎo)地位。

圖3 門水平上四種鹽生植物根際土壤真菌群落分布特征 Fig.3 Histogram of relative abundance of fungal species at phylum level

圖4 基于Unweighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹(shù)Fig.4 UPGMA cluster tree based on Unweighted Unifrac distance

圖5 屬水平上四種鹽生植物根際土壤真菌群落分布特征 Fig.5 Distribution characteristics of rhizosphere fungal communities of four halophytes at genus level

相比而言,四種鹽生植物根際優(yōu)勢(shì)真菌在群落組成上具有一定相似性,但相對(duì)豐度存在明顯差異。從屬水平物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和相對(duì)豐度聚類分析可以看出(圖6),鐮孢菌屬是四種鹽生植物根際的共同優(yōu)勢(shì)菌屬,但它在花花柴根際的相對(duì)豐度顯著低于其它三種植物。支頂孢屬在花花柴根際土壤中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度達(dá)43.65%,但在另外三種植物根際的相對(duì)豐度卻均低于10%。曲霉屬在黑果枸杞根際的豐度最高(15.26%),是黑果枸杞根際土壤中的次優(yōu)勢(shì)菌屬,但在其它三種植物根際卻不占主導(dǎo)地位。鏈格孢屬在黑果枸杞根際土壤中相對(duì)豐度排列第三,是旱生蘆葦根際土壤中的第四優(yōu)勢(shì)菌屬,但在鹽爪爪和花花柴根際土壤真菌群落中卻不占優(yōu)勢(shì)(相對(duì)豐度小于1%)。莖點(diǎn)霉屬在黑果枸杞根際土壤中的相對(duì)豐度達(dá)2.77%,而在其它植物根際的豐度均低于0.2%。梨孢帚霉屬在旱生蘆葦根際的豐度僅0.2%,而在其它植物根際的分布豐度卻均超過(guò)7%,屬于亞優(yōu)勢(shì)菌屬。微囊菌屬在鹽爪爪根際土壤中是僅次于鐮孢菌屬的亞優(yōu)勢(shì)菌屬,而在另外三種植物根際土壤中的相對(duì)豐度卻較低。閉小囊菌屬在花花柴根際的相對(duì)豐度達(dá)6.79%,而在其它植物根際分布極少。格孢腔菌屬在鹽爪爪根際的相對(duì)豐度達(dá)2.03%,而在其它植物根際幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

圖6 屬水平上物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.6 Phylogenetic tree constructed with representative sequences of species at genus level分支和扇形的顏色表示其對(duì)應(yīng)的門,扇環(huán)外側(cè)的堆積柱形圖表示該菌屬在不同樣本中的豐度分布信息

2.4 根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子間的相互關(guān)系

通過(guò)CCA分析真菌群落與土壤理化因子間的相關(guān)性(圖7),第一、二排序軸累計(jì)解釋率分別為51.72%和29.6%,累計(jì)解釋率達(dá)到81.32%,說(shuō)明第一、二排序軸能較好地反映出真菌群落與土壤理化因子之間的相互關(guān)系。真菌群落的差異性分布主要約束在第一軸和第二軸。對(duì)于第一軸,較重要的環(huán)境因子分別是AK、AP和EC,因?yàn)檫@些因子與第一軸夾角很小(分別為46.5°、48.4°和12.0°),即投影較長(zhǎng)。約束在第二軸上的重要的環(huán)境因子為AK、AP和pH。鐮孢菌屬、曲霉屬和鏈格孢屬與AP、EC和SWC箭頭方向相同,說(shuō)明這3屬真菌的分布豐度與AP、EC和SWC之間呈正相關(guān)。青霉菌屬和梨孢帚霉屬與pH、TK箭頭方向相同,說(shuō)明其群落豐度與土壤TK和pH呈正相關(guān)。支頂孢屬、翅孢殼屬和閉小囊菌屬與AK呈正相關(guān),與pH、AP和EC呈負(fù)相關(guān)。

綜上,對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)具有重要影響因素的土壤指標(biāo)有：AK(r2=0.893,P<0.01),AP(r2=0.725,P<0.01),pH(r2=0.505,P<0.01)和EC(r2=0.334,P<0.05)(表3)。土壤速效鉀、速效磷、pH和電導(dǎo)率是影響四種鹽生植物根際土壤真菌群落分布的主要驅(qū)動(dòng)因子。

圖7 優(yōu)勢(shì)真菌類群與土壤環(huán)境因子的 CCA 分析Fig.7 Canonical correspondence analysis of dominant fungal groups and soil environmental factors

從屬水平上物種豐富度與環(huán)境因子Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖8),優(yōu)勢(shì)菌屬中鐮孢菌屬、曲霉屬和鏈格孢屬與AP呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與其它環(huán)境因子無(wú)顯著關(guān)系。支頂孢屬和帚枝霉屬與AK呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與TK呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。梨孢帚霉屬和翅孢殼屬與AN、SOM、TN和TP呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),但與pH、EC和SWC呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。微囊菌屬、青霉菌屬和莖點(diǎn)霉屬與TK呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),但與AK呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。非優(yōu)勢(shì)菌屬分布豐度與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系各有不同。

3 討論

植物對(duì)鹽堿、旱、寒等逆境的抗性或耐性并不純粹源于植物基因組本身,根際土壤微生物對(duì)宿主適應(yīng)逆境脅迫也有積極影響,是植物基因組的有效延伸[16, 29-30]。同時(shí),宿主植物能夠通過(guò)根際分泌物成分的復(fù)雜變化來(lái)塑造對(duì)自身生長(zhǎng)代謝有益的根際微生物群落[31-32]。接種健康土壤中的少量“供體”微生物有助于恢復(fù)退化的生態(tài)系統(tǒng),這或許是不同鹽堿化土壤深度開(kāi)發(fā)利用的新思路[33]。本研究發(fā)現(xiàn)南疆四種鹽生植物根際土壤真菌群落組成既具有相似性,也存在一定差異,表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)真菌菌群組成相似,但相對(duì)豐度各異,低豐度菌群組成也不同。四種植物雖然生長(zhǎng)在同一鹽堿地中,但根際土壤理化特性不同,根際微環(huán)境各異,形成了多樣的真菌群落結(jié)構(gòu)。這反映了根際真菌群落結(jié)構(gòu)的宿主特異性,印證了不同植物對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有主動(dòng)選擇性[34-35]。即使在同一鹽堿生境中,不同鹽生植物也具有不同的根際微環(huán)境和真菌群落。

表3 優(yōu)勢(shì)真菌類群與土壤環(huán)境因子envfit函數(shù)檢驗(yàn)

圖8 屬水平上物種豐富度與環(huán)境因子Spearman相關(guān)性分析Fig.8 Spearman correlation analysis of species richness and environmental factor at genus level“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(P<0.01)

四種鹽生植物根際土壤真菌在門水平上的多樣性并不豐富,僅注釋到8門,且優(yōu)勢(shì)門只有3門,這可能與干旱區(qū)荒漠鹽堿地貧瘠的土壤養(yǎng)分有關(guān)。子囊菌門在四種鹽生植物根際土壤中占絕對(duì)主導(dǎo)地位,與高寒草甸、荒漠等生境相似[22-23, 36]。這與子囊菌門的生活習(xí)性有關(guān),該門是目前真菌中數(shù)量最多的類群,主營(yíng)腐生生活,是土壤中最重要的有機(jī)質(zhì)分解者,在土壤養(yǎng)分循環(huán)方面起著重要作用[37]。就植物種類而言,子囊菌門在花花柴根際的相對(duì)豐度占比最高(94.8%),而在旱生蘆葦根際占比相對(duì)較低(74.6%),這一方面與這兩種植物的根際微環(huán)境有關(guān),花花柴植株冠幅大,根系粗壯；而旱生蘆葦根系呈匍匐狀生長(zhǎng),須根少且光滑,進(jìn)而導(dǎo)致兩種植物根際土壤微環(huán)境和真菌群落結(jié)構(gòu)差異。另一方面可能因?yàn)樽幽揖T作為植物木質(zhì)素最主要的分解者,偏好于木質(zhì)素含量高的環(huán)境,旱生蘆葦?shù)厣瞎诜^小,所能形成的莖、葉和根的木質(zhì)化殘屑較少,且難以堆積在根際；而鹽爪爪、黑果枸杞、花花柴植株相對(duì)冠幅大,形成的莖稈、碎葉等木質(zhì)化殘屑容易堆積的根部,進(jìn)而被分解進(jìn)入根際形成了一定的肥島效應(yīng)[38-39]。壺菌門主要分布在鹽爪爪和旱生蘆葦根際,在黑果枸杞和花花柴根際幾乎沒(méi)有分布,推測(cè)也與該門的生活習(xí)性有關(guān)。壺菌門是真菌界中唯一在生活史中可產(chǎn)生游動(dòng)孢子的成員,多為水生,大多腐生在動(dòng)植物殘?bào)w上或寄生于水生植物上。旱生蘆葦雖屬旱蘆,但根系十分發(fā)達(dá),喜水且能借助根系吸取更多水分,近而營(yíng)造出適宜該門真菌生長(zhǎng)繁殖的根際微生境。

從屬水平上看,鐮孢菌屬、支頂孢屬和曲霉屬是四種鹽生植物根際土壤的共同優(yōu)勢(shì)菌屬,但相對(duì)豐度上具有植物特異性。鐮孢菌屬在花花柴根際的相對(duì)豐度顯著低于其它三種植物,但花花柴根際的支頂孢屬和翅飽殼屬豐度卻顯著高于其它植物,且以支頂孢屬占絕對(duì)主導(dǎo)地位。菌群相對(duì)豐度表現(xiàn)出植物特異性,這可能與不同宿主植物的生長(zhǎng)特性和根際微環(huán)境有關(guān)。植物通過(guò)莖、葉、根的凋落物以及根系分泌物向地下輸送C物質(zhì),供根際微生物菌群分解利用,同時(shí)根際土壤微生物又通過(guò)感染根部形成共生關(guān)系(如菌根),或通過(guò)產(chǎn)生植物激素促進(jìn)植物生長(zhǎng),或減少植物脅迫信號(hào),從而與植物互作[40]。有研究顯示,鐮孢菌屬通過(guò)產(chǎn)生木質(zhì)纖維素酶對(duì)C的分解起作用,并與曲霉屬共同參與土壤中難溶性磷的溶解,在促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收方面意義重大[41],曲霉屬被大量報(bào)道屬于嗜鹽真菌,普遍分布于各類高鹽環(huán)境中[42]。支頂孢屬被認(rèn)為是一類生防菌,對(duì)多種致病真菌有抑制作用,它作為花花柴根際土壤中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌很可能與其根際病原真菌帚枝霉屬豐度的大幅增加有關(guān),而該屬病原菌在其它植物根際的豐度極低。

不同植物的遺傳背景和物質(zhì)代謝過(guò)程造就了不同的根際微環(huán)境,影響微生物群落結(jié)構(gòu)。從真菌群落與土壤理化因子的相關(guān)性看,土壤速效鉀、速效磷、pH和電導(dǎo)率是影響四種鹽生植物真菌群落分布的主要驅(qū)動(dòng)因子。鹽爪爪與旱生蘆葦根際土壤pH和EC值較高,真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)也相對(duì)較高,推測(cè)土壤pH和EC可能是決定鹽堿生境中植物根際真菌群落豐富度的關(guān)鍵因子。從四種鹽生植物根際土壤真菌群落聚類分析結(jié)果看,鹽爪爪和旱生蘆葦共有的OTUs數(shù)量最多,而且壺菌門是它們的次優(yōu)勢(shì)菌門,但該門真菌在另外兩種植物根際沒(méi)有發(fā)現(xiàn),表明土壤pH和EC不僅會(huì)影響鹽生植物根際真菌群落豐富度,還會(huì)影響其多樣性。鐮孢菌屬、曲霉屬和鏈格孢屬中很多具有解磷功能,能夠分解土壤中的難溶性磷供植物吸收[41-42],它們作為黑果枸杞根際的主要優(yōu)勢(shì)菌屬,與其根際土壤AP含量最高有直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明這些真菌有效溶解了黑果枸杞根際土壤中的難溶性磷,轉(zhuǎn)化為可溶態(tài),增加了其對(duì)磷的吸收利用。

ITS(Internal Transcribed Spacer)擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù),具有傳統(tǒng)真菌分類方法不可比擬的優(yōu)勢(shì),已成為當(dāng)前研究真菌群落多樣性的首選之策。但就擴(kuò)增子測(cè)序而言,對(duì)其結(jié)果準(zhǔn)確性影響最大的因素是樣品采集和基因組提取工作。本研究采取多點(diǎn)混合采樣法得到每種植物4個(gè)重復(fù)樣品,在一定程度上代表了樣本的真實(shí)情況,但無(wú)法絕對(duì)準(zhǔn)確代表樣本。增加樣品數(shù)量可以在一定意義上解決這一問(wèn)題,但隨之測(cè)序成本也會(huì)顯著提高,因此需要在最經(jīng)濟(jì)的成本下確定樣品數(shù)量。根際是植物根系-土壤界面數(shù)毫米區(qū)域內(nèi)受植物根系影響最大,呈現(xiàn)獨(dú)特的土壤理化和生物學(xué)特性且處于動(dòng)態(tài)變化的土壤微域。目前運(yùn)用較多的根際土壤獲取方法一是抖落與根系結(jié)合松散的土壤后用無(wú)菌毛刷刷取緊貼根系的土壤；二是用緩沖液混合玻璃珠振蕩以取得根際樣品。兩種方法各有利弊,須結(jié)合實(shí)際選用并不斷改進(jìn)。