李明月，戴曉紅，匡炳霖，于學(xué)平，滕偉，于薇薇，馬慧慧，陳秋欣，曹洪濤，溫鑫，鄒偉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

雖然自發(fā)性腦出血病例在腦卒中占比不超過20%，但其仍然與各種類型腦卒中的高病死率和發(fā)病率關(guān)系密切[1]。因此早期識(shí)別腦出血，積極發(fā)現(xiàn)腦出血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的病理機(jī)制和干預(yù)方法對(duì)于改善腦出血疾病的現(xiàn)狀至關(guān)重要。鐵死亡于2012年首次被提出，是一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化的損傷過程，近幾年研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡是腦出血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要方式[2]。腦出血后血腫溶解,血紅蛋白釋放大量游離鐵，進(jìn)而引起大量活性氧生成，并誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成質(zhì)膜破壞，鐵死亡發(fā)生[3]。另外鐵死亡另一重要特征是有典型的線粒體形態(tài)改變，即線粒體體積縮小，雙層膜密度增強(qiáng)，線粒體嵴減少或缺失，線體體外膜增厚，甚至破裂[4]。針刺在改善出血大鼠肢體功能缺損方面效果顯著[5],同時(shí)針灸在抑制腦出血后大鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡方面也起到至關(guān)重要的作用[6]。然而針刺能否通過抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡改善出血后大鼠的神經(jīng)功能是本研究的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供健康清潔級(jí)SD雄性大鼠96只，體質(zhì)量為(280±10)g。大鼠在溫度(22±2)℃范圍內(nèi)，相對(duì)恒定濕度(50±5)%條件下自由飲水、進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后方可入組。將所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、抑制劑組(DFX)。每組大鼠再按1 d、3 d、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分成3個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只。造模前12 h禁食，6 h禁水。

1.2 主要儀器與試劑

立體定位儀(成都儀器廠，STW-1)；牙鉆(上海齒科機(jī)械廠，307-6)；針灸針(華佗牌，0.35 mm×40 mm)；丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(WLA048a，萬類生物，中國(guó))；透射電子顯微鏡(HITACHI H-7650日立，日本)。

1.3 腦出血模型制備

大鼠稱重后，按照60 mg/kg比例腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。大鼠被成功麻醉后，頭部備皮，在備皮處用碘伏常規(guī)消毒，后以俯臥位固定于立體定位儀上。取兩耳尖連線中點(diǎn)切口，鈍性分離皮下骨膜，充分暴露前囟點(diǎn)及冠狀縫，以立體定位儀定位坐標(biāo)點(diǎn)，以前囟點(diǎn)為中心，向右側(cè)3.5 mm，向后側(cè)0.2 mm，用1.0 mm直徑牙鉆鉆孔至硬腦膜表面。同時(shí)剪斷距尾端3 cm處的鼠尾，取血50 μL后將微量注射器固定于立體定位儀上，并沿鉆孔處垂直緩慢進(jìn)針至基底節(jié)處注血，速度為20 μL/min，留針5 min后緩慢出針。斷尾處消毒包扎，局部噴灑慶大霉素并用牙科水泥密封，眼科針縫合。造模后采用Berderson評(píng)分法[7]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分在1～3分大鼠納入本實(shí)驗(yàn)。

1.4 干預(yù)方法

模型組采用自體血注入法制備腦出血大鼠模型，造模后不做任何處理。假手術(shù)組接受與模型組相同的各項(xiàng)操作，微量注射器于相同位置進(jìn)針，注入等量生理鹽水，但不注血。針刺組造模后給予針刺治療，選穴部位參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》，取大鼠百會(huì)穴、患側(cè)曲鬢穴，由百會(huì)向曲鬢穴透刺，以0.35 mm×40 mm針灸針快速刺入，進(jìn)針深度15 mm，施以快速捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉手法，捻轉(zhuǎn)速度為200 r/min，持續(xù)捻轉(zhuǎn)5 min，后間隔5 min，反復(fù)操作共3次。抑制劑組按照100 mg/kg劑量給予肌肉注射去鐵胺每日1次。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)估

在造模后的1 d、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用Ludmila Belayev評(píng)分法[8-9]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。該評(píng)分法由姿勢(shì)反射和放置試驗(yàn)兩部分組成。放置試驗(yàn)又分為視覺、觸覺、本體感覺試驗(yàn)。其中每項(xiàng)按照神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分0～2分，各項(xiàng)分值相加最高12分，此時(shí)神經(jīng)功能缺損程度最重。

1.5.2 透射電鏡觀察線粒體形態(tài)

將保存在2.5%戊二醛中的待測(cè)樣本取出，經(jīng)0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗后，用1%鋨酸固定液固定3 h。將固定好的樣本依次經(jīng)過50%、70%、90%乙醇、90%乙醇和90%丙酮(1∶1)混合液、90%、100%丙酮脫水15～20 min，重復(fù)3次。經(jīng)包埋、固化后的樣本使用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，蒸餾水洗凈晾干后讀片。

1.5.3 神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)表達(dá)

將保存在固定液中的腦組織樣本取出，常規(guī)脫水、透明、透蠟、包埋制成5 μm厚度的切片。取出烤好的切片，依次放入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ，95%、85%、75%乙醇中浸泡脫蠟至水；抗原修復(fù)、過氧化氫孵育、山羊血清封閉后進(jìn)行一抗孵育，4 ℃過夜；然后在37 ℃條件下滴加二抗，孵育20 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記工作液，37 ℃環(huán)境下孵育30 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，切片經(jīng)過反藍(lán)后，再依次浸入濃度為75%、85%、95%的乙醇中脫水；封片；鏡檢；于400倍鏡下拍照。取其均值作為該組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5.4 丙二醛(MDA)含量檢測(cè)

根據(jù)MDA試劑盒說明進(jìn)行樣本和試劑滴加，經(jīng)過吸光度測(cè)定后進(jìn)行MDA含量測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用IBM SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果組間比較采用One-way ANOVA和Tukey’s檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響

在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組大鼠未見明顯神經(jīng)功能缺損。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠1 d即表現(xiàn)出明顯神經(jīng)功能缺損(P<0.05)，3 d神經(jīng)功能缺損最重(P<0.05)，7 d神經(jīng)功能缺損有所恢復(fù)(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損程度較模型組明顯減輕，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分在各時(shí)間點(diǎn)比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能Ludmila Belayev評(píng)分結(jié)果分)

2.2 針刺對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響

各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組神經(jīng)元胞體中線粒體形態(tài)未見明顯改變。模型組1 d神經(jīng)元胞體中可見散在線粒體體積變小，線粒體嵴減少，線粒體外膜破裂，神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器略減少，神經(jīng)元胞體內(nèi)可見類似脂質(zhì)樣物質(zhì)。模型組3 d神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器明顯減少，可見線粒體膜破裂，神經(jīng)元將近死亡。模型組7 d神經(jīng)元胞體中線粒體形態(tài)有所緩解，但仍可見線粒體體積縮小，線粒體嵴減少和線粒體破裂。針刺組1 d與抑制劑組1 d神經(jīng)元線粒體形態(tài)改變不明顯，以腫脹為主。針刺組3 d與抑制劑組3 d較模型組3 d線粒體形態(tài)改變均減輕，可見散在線粒體形態(tài)變小，伴有線粒體雙層膜密度增厚及線粒體嵴減少或線粒體膜破裂,同時(shí)可見不同程度腫脹的線粒體。針刺組7 d與抑制劑組7 d線粒體形態(tài)基本趨于正常，偶有散在腫脹線粒體，見圖1～3。

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態(tài)變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細(xì)胞核；c.細(xì)胞漿。 圖1 各組大鼠腦組織1 d時(shí)線粒體超微結(jié)構(gòu)

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態(tài)變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細(xì)胞核；c.細(xì)胞漿。圖2 各組大鼠腦組織3 d時(shí)線粒體超微結(jié)構(gòu)

注：Scale bars:(i)2 μm；(ii)500 nm；黃色箭頭代表正常線粒體；紅色箭頭代表線粒體形態(tài)變小，外膜增厚或破裂；m.線粒體；n.細(xì)胞核；c.細(xì)胞漿。 圖3 各組大鼠腦組織7 d時(shí)線粒體超微結(jié)構(gòu)

2.3 針刺對(duì)出血腦組織NeuN表達(dá)的影響

假手術(shù)組NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較高，各時(shí)間點(diǎn)未見顯著差別(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在模型組各時(shí)間點(diǎn)均顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在針刺組及抑制劑組各時(shí)間點(diǎn)均顯著增多(P<0.05)，見圖4,表2。

注：Scale bars:100 μm；藍(lán)色箭頭為NeuN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。圖4 各組大鼠腦組織不同時(shí)間點(diǎn)NeuN表達(dá)比較

表2 各組大鼠腦組織NeuN相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

2.4 針刺對(duì)出血腦組織MDA含量影響

與假手術(shù)組比較，模型組在出血后1 d、3 d、7 d MDA含量均顯著升高(P<0.05)。其中模型組1 d與3 d MDA含量，模型組3 d與模型組7 d MDA含量比較差異顯著(P<0.05)，說明腦出血后MDA含量在3 d達(dá)到高峰。針刺組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MDA含量較同時(shí)間點(diǎn)模型組明顯減少，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針刺組與抑制劑組大鼠MDA含量在各時(shí)間點(diǎn)比較，無顯著性差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織MDA測(cè)定結(jié)果

3 討論

鐵死亡是由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的一種程序性細(xì)胞死亡過程。細(xì)胞內(nèi)的很多代謝途徑，如鐵代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝以及細(xì)胞呼吸等(即線粒體三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈)都是可以通過產(chǎn)生脂質(zhì)活性氧[10]而與鐵死亡發(fā)生關(guān)聯(lián)。文獻(xiàn)表明鐵死亡的發(fā)生一定會(huì)伴有不同程度的線粒體形態(tài)和功能的改變[11]，包括線粒體嵴的減少，線粒體體積的減小甚至線粒體的破裂等[12-13]。在一定程度上鐵死亡的發(fā)生也與線粒體形態(tài)改變程度，能量供應(yīng)和新陳代謝的損害嚴(yán)重程度有關(guān)。GAO等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位超極化和脂質(zhì)過氧化物積累，而抑制線粒體三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈可減輕線粒體膜電位過極化，減輕脂質(zhì)過氧化物積累使細(xì)胞免于鐵死亡。目前線粒體功能失調(diào)已經(jīng)被認(rèn)為是與鐵死亡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要的生化特征[15]。而在腦出血后血腫溶解釋放大量游離鐵，可以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，線粒體作為氧化磷酸化的主要調(diào)節(jié)因子，是細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的主要來源。而線粒體活性氧(mitochondrial ROS,mitoROS)產(chǎn)生的主要來源是細(xì)胞內(nèi)自由的具有氧化還原性的鐵池。研究表明一旦mitoROS聚積，便可與線粒體膜中的多聚不飽和脂肪酸(PUFA)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、線粒體DNA(mitochondrial DNA ,mtDNA)損傷，以及電子傳遞鏈復(fù)合物mtDNA編碼亞基的缺陷[16]。鐵死亡誘導(dǎo)劑愛拉斯汀(Erastin)已經(jīng)被證實(shí)會(huì)使mitoROS積累，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體膜電位改變以及線粒體ATP耗竭、線粒體碎裂[17]。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)模型組1 d開始神經(jīng)元胞體中即可見散在線粒體雙層膜密度增加，線粒體體積變小，線粒體嵴減少。模型組3 d神經(jīng)元死亡明顯，神經(jīng)元胞體中可見線粒體嵴消失，線粒體破裂，以及神經(jīng)元死亡。模型組7 d神經(jīng)元胞體中線粒體形態(tài)有所緩解。而在不同時(shí)間點(diǎn)針刺組與抑制劑組較模型組線粒體形態(tài)改變均較輕，可見散在線粒體形態(tài)變小，線粒體嵴減少，偶有線粒體外膜增厚及破裂,多數(shù)以腫脹線粒體為主。可見針刺在一定程度上減輕了神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡相關(guān)的線粒體形態(tài)損傷。另外在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察了神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在腦出血后，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著減少(P<0.05)，3 d減少最顯著(P<0.01)，說明在腦出血后存活神經(jīng)元減少，3 d時(shí)存活的神經(jīng)元最少。與模型組比較，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在針刺組及抑制劑組各時(shí)間點(diǎn)均顯著增多(P<0.05)，可見針刺與鐵死亡抑制劑均可在一定程度上，減輕神經(jīng)元鐵死亡發(fā)生。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步觀察了MDA水平。發(fā)現(xiàn)腦出血后各時(shí)間點(diǎn)MDA水平均顯著升高(P<0.05)，3 d最高。而針刺組與抑制劑組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MDA含量較同時(shí)間點(diǎn)模型組明顯減少。由此我們推測(cè)針刺可能在影響神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡脂質(zhì)過氧化方面起到積極作用。

頭針針刺在改善腦出血后神經(jīng)功能方面已經(jīng)得到廣大醫(yī)學(xué)工作者的認(rèn)可[18]。其中“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法在減輕腦出血后繼發(fā)性病理?yè)p傷過程起到舉足輕重的作用，其中包括抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)[19]。百會(huì)向曲鬢穴透刺，可以激發(fā)督脈、手足陽(yáng)經(jīng)經(jīng)氣流注于足少陽(yáng)膽經(jīng)。陽(yáng)主動(dòng)，一身之陽(yáng)氣的激發(fā)可以有助于神經(jīng)細(xì)胞的激活，神經(jīng)功能的修復(fù)[20]。另外通過針刺對(duì)大鼠腦出血后不同時(shí)段腦內(nèi)血腫中心等區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞放電情況研究發(fā)現(xiàn)[21]，針刺能夠縮短出血后神經(jīng)元誘發(fā)放電潛伏期，增加放電頻率，改善細(xì)胞狀態(tài)，緩解神經(jīng)細(xì)胞的病理?yè)p害過程，并且針刺在清除血腫引起的神經(jīng)細(xì)胞抑制性泛化方面也起到積極作用。另外針刺也可以降低家兔腦出血組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物L(fēng)PO含量[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用Ludmila Belayev評(píng)分評(píng)價(jià)各組大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，發(fā)現(xiàn)模型組自出血后1 d開始即出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，在隨后的時(shí)間點(diǎn)缺損程度逐漸遞增，直至7 d有所緩解。而經(jīng)過針刺和抑制劑治療后的大鼠在各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損程度較模型組明顯減輕。由此推測(cè)針刺可能通過抑制出血后腦組織神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)。

本研究雖然初步證實(shí)了針刺對(duì)出血后腦組織神經(jīng)元鐵死亡的相關(guān)線粒體形態(tài)、NeuN表達(dá)和MDA水平的影響，但由于線粒體在鐵死亡中的具體作用還存在爭(zhēng)議[23]，針刺是否通過改善線粒體形態(tài)就能抑制鐵死亡的發(fā)生以及發(fā)生鐵死亡的神經(jīng)細(xì)胞是如何引起線粒體形態(tài)改變的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。另外本研究主要針對(duì)線粒體的形態(tài)進(jìn)行了觀察，還有一些線粒體代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)因子如線粒體脂代謝調(diào)節(jié)因子(ASCF2和CS)、谷氨酰胺代謝相關(guān)因子即(mitochondrial glutaminase 2，GLS2)[24]、TCA周期相關(guān)因子(即FH)等也會(huì)增強(qiáng)對(duì)鐵死亡的敏感性[14]。后續(xù)會(huì)深入基因水平進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確針刺對(duì)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡影響的作用機(jī)制。