鐘 磊，許 猛（通訊作者）

（吉大二院關(guān)節(jié)外科 吉林 長(zhǎng)春 130000）

脊髓損傷是臨床常見(jiàn)的病癥，表現(xiàn)為患處以下肢體功能障礙，給患者造成身體、心理嚴(yán)重影響。目前，臨床治療方法主要有手術(shù)、細(xì)胞生物工程等方法，但均有一定局限性[1]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代組織工程技術(shù)發(fā)展，生物組織工程植入逐步成為脊髓損傷治療新方向。生物組織支架植入能夠發(fā)揮橋接損傷部位、抑制和阻斷膠質(zhì)疤痕生成，以及為損傷處到遠(yuǎn)端軸突的組織再生提供重要的引導(dǎo)作用。水凝膠是組織工程中常用的材料，有著良好生物學(xué)特性[2]。靜電紡絲是一種新型纖維制備技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)能制出定向性纖維，實(shí)現(xiàn)良好的仿生效用。通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)對(duì)基于靜電紡絲的天然水凝膠纖維束支架在脊髓損傷修復(fù)治療中的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

2020 年1 月—2021 年1 月開(kāi)展構(gòu)建脊髓損傷動(dòng)物模型研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40 只大鼠均為雄性，體重200 ～250 g，平均（210.5±16.8）g。由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。置于恒溫23 ～25 ℃，濕度45%～60%，光照12 h/d 的室內(nèi)飼養(yǎng)。日常飲食滅菌處理，方案一致。飼養(yǎng)2 周后隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，均為20 只。

實(shí)驗(yàn)器材：電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、手術(shù)刀片、線剪、血管鉗、縫合三角針、咬骨鉗等器械。

1.2 方法

（1）支架制作：試驗(yàn)組大鼠采用仿生靜電紡水凝膠纖維束支架：將500 mg 的GelMA 加入到5 mL HFIP 中制備成靜電紡絲溶液，避光下將0.5 g 的2-羥基-4'-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮溶解至10 mL 無(wú)水酒精成光交聯(lián)液，然后裝至5 mL 注射器內(nèi)，再通電處理，于距注射器嘴20 cm 處置平行電極，間距30 mm，于電極桿間產(chǎn)生平行的定向纖維膜，收集，疊加成纖維膜，再卷成圓柱纖維束，然后置于光交聯(lián)液內(nèi)用紫外線照射1 h 后交聯(lián)，用PBS 浸泡沖洗數(shù)次，去除多余光交聯(lián)液，備用。對(duì)照組大鼠采用常規(guī)明膠水凝膠纖維束支架：將500 mg的Gelatin 溶于5 mL 的HFIP 中形成Gelatin 溶液，裝于5 mL 注射器內(nèi)置于微量注射泵上，通電，在距注射器嘴20 cm 處置平行電極，間距30 mm，通電后形成平行定向纖維膜，收集，疊加成纖維膜，卷成圓柱纖維束，再置于2%戊二醛+乙醇溶液內(nèi)24 h 交聯(lián)，用PBS 浸泡沖洗數(shù)次，去除多余光交聯(lián)液，備用。（2）模型構(gòu)建及支架置入：對(duì)大鼠麻醉，以T9 為中心做一道3 cm 左右縱切口，分開(kāi)椎旁的肌肉，再開(kāi)椎管，使T8 ～10 脊髓暴露，對(duì)右側(cè)脊髓半切成3 mm 長(zhǎng)缺損，模型建立完成。然后用0.9%氯化鈉溶液沖洗，在缺損處分別置入修剪合適的纖維束支架，試驗(yàn)組和對(duì)照分別用制備好的纖維束支架，完成后逐層縫合。術(shù)后肌內(nèi)注射抗生素3 d。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估：在術(shù)后1、4、8、12 周應(yīng)用BBB 量表評(píng)測(cè)大鼠模型下肢運(yùn)動(dòng)功能，將模型大鼠放到相對(duì)空曠的區(qū)域讓其自由行動(dòng)5 min，每只均由2 名不知分組的研究人員一一評(píng)價(jià)，取平均值。（2）脊髓組織細(xì)胞學(xué)：兩組大鼠均在術(shù)后第12 周麻醉處死，取出術(shù)中脊髓包埋處理，進(jìn)行染色處理，應(yīng)用專(zhuān)業(yè)軟件定量測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的染色情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組模型大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)對(duì)比

在術(shù)后測(cè)定，術(shù)后1 周兩組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后4、8、12 周時(shí)試驗(yàn)組大鼠BBB 評(píng)分均顯著高于對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組模型大鼠術(shù)后不同節(jié)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較（ ± s，分）

表1 兩組模型大鼠術(shù)后不同節(jié)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較（ ± s，分）

組別 只數(shù) 術(shù)后1 周 術(shù)后4 周 術(shù)后8 周 術(shù)后12 周試驗(yàn)組 20 1.78±0.37 5.03±1.06 8.56±1.77 11.42±1.47對(duì)照組 20 1.83±0.45 4.45±1.13 6.07±1.14 8.31±1.22 t 0.922 4.584 5.092 10.283 P 0.076 0.001 0.000 0.000

2.2 兩組模型大鼠術(shù)后脊髓組織細(xì)胞學(xué)對(duì)比

在術(shù)后12 周測(cè)定，試驗(yàn)組模型大鼠的脊髓中神經(jīng)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的染色光密度均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組模型大鼠術(shù)后脊髓組織細(xì)胞學(xué)染色熒光強(qiáng)度比較（ ± s）

表2 兩組模型大鼠術(shù)后脊髓組織細(xì)胞學(xué)染色熒光強(qiáng)度比較（ ± s）

組別 只數(shù) 神經(jīng)元干細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞試驗(yàn)組 20 530±115 1 510±210對(duì)照組 20 285±16 635±177 t 15.404 17.182 P 0.000 0.001

3.討論

當(dāng)前，脊髓損傷修復(fù)治療仍是臨床很大挑戰(zhàn)，原因在于人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力弱，尤其是嚴(yán)重挫傷與橫向損傷時(shí)，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，也給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)很重負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，雖有諸多研究取得較好成果，但對(duì)急慢性脊髓損傷的針對(duì)有效的治療措施不多。一直以來(lái)，支架材料是生物組織工程一個(gè)科研焦點(diǎn)。諸多研究表明生物支架在中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)治療中具有遞送細(xì)胞和藥物功能，可實(shí)現(xiàn)良好修復(fù)效果。但從臨床研究和實(shí)踐看，當(dāng)前尚無(wú)強(qiáng)度佳、生物相容性良好的支架。盡管膠原蛋白已成為具有良好相容性有前景的生物材料，但其低機(jī)械性能限制其應(yīng)用。

靜電紡絲支架就是利用靜電紡絲技術(shù)將含有高分子聚合物溶液制成懸浮的小液滴，再通過(guò)高壓電場(chǎng)將由小液滴形成射流吸附在接收板上，接收板上射流經(jīng)自然冷卻至溶劑揮發(fā)后形成紡絲纖維束，將紡絲纖維束多層疊加后形成靜電紡絲支架。制得的紡絲相互交叉，同時(shí)在纖維間留有一定空隙，使其有較高的比表面積[3]。靜電紡絲支架所形成高比表面積和孔隙結(jié)構(gòu)與體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)有著相似的結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞在支架上黏附和生長(zhǎng)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以沿靜電紡絲纖維方向定向生長(zhǎng)，該特性在組織生物工程應(yīng)用中有著積極意義。基于此，提出應(yīng)用天然水凝膠通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制成生物支架，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組大鼠術(shù)后4 個(gè)月開(kāi)始BBB 評(píng)分高于對(duì)照組，表明仿生靜電紡水凝膠纖維束支架能更好促進(jìn)損傷脊髓功能恢復(fù)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，康復(fù)效果越好。同時(shí)，在術(shù)后12 周時(shí)，試驗(yàn)組的分?jǐn)?shù)為對(duì)照組1.5 倍左右。另外，在術(shù)后12 周進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)組模型大鼠脊髓中神經(jīng)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的染色光密度均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此說(shuō)明，在仿生靜電紡水凝膠纖維束支架中，神經(jīng)元相對(duì)更多，且星形膠質(zhì)細(xì)胞較多。

BBB 評(píng)分是用于評(píng)測(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的重要、敏感性工具。諸多研究已證實(shí)椎管附近的NSC 具有多項(xiàng)分化潛能[4-5]。該類(lèi)細(xì)胞可因損傷誘導(dǎo)增殖并分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等。因而，該類(lèi)干細(xì)胞可用于脊髓損傷內(nèi)源性修復(fù)細(xì)胞來(lái)源。仿生靜電紡水凝膠纖維束支架因其在促進(jìn)組織血管化方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。相比物理擴(kuò)散，血管能夠更好地為組織提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并能有效去除代謝性物質(zhì)。從術(shù)后標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞熒光強(qiáng)度看，試驗(yàn)組大鼠的血管再生整體更優(yōu)。

綜上所述，仿生靜電紡水凝膠纖維束構(gòu)建的生物支架在脊髓損傷修復(fù)治療中有顯著效果，優(yōu)于常規(guī)明膠生物支架，能夠更好促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞迀移，誘導(dǎo)分化神經(jīng)元，且促進(jìn)血管生成，有著重要價(jià)值。