林亞蘭，張愛華

（1.常州大學石油化工學院，江蘇常州213164；2.常州大學城鄉(xiāng)礦山研究院，江蘇常州 213164）

我國火龍果酒的生產(chǎn)過程多采用商用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進行單菌發(fā)酵，釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中耐高酒精、高溫，有良好的發(fā)酵活性，可以確保果酒品質(zhì)的穩(wěn)定，但由于釀酒酵母代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性香味物質(zhì)種類少且含量低，缺乏酯類香味物質(zhì)，不能很好地體現(xiàn)果酒的復雜性和典型性[1-2]，難以滿足消費者需求。大量研究表明，非釀酒酵母在葡萄酒釀制過程中，通過與釀酒酵母的共同發(fā)酵來控制酒體不理想的風味或者降低乙醇含量來賦予葡萄酒復雜的香氣，從而增加葡萄酒感官質(zhì)量特征的復雜性。這類酵母與釀酒酵母不同，它們可以產(chǎn)生大量的風味物質(zhì)，對果酒品質(zhì)有著積極的影響[3-5]。檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力[6]，揮發(fā)性香氣形成主要依靠β-葡萄糖苷酶水解香氣糖苷[7]，β-葡萄糖苷酶具有獨特的水解活性，可以從香氣前體物質(zhì)的末端非還原性β-D-糖苷鍵中釋放出非還原性糖基，賦予葡萄酒更好的花香、果香味[8]。葡萄汁由孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）與釀酒酵母的混種發(fā)酵可有效改善果酒的品質(zhì)和風味[9-10]。在麥芽汁中接種德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）增加了乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量[11]，在果酒釀造過程中添加Torulaspora delbrueckii可以提高生物風味并減少乙醇含量[12]。對于既不含有機酸，也不含酯類芳香因子的毫無風味的火龍果而言，在釀造火龍果酒時可以引用非釀酒酵母來提升果酒風味，以此提高火龍果酒的品質(zhì)。

我國火龍果釀造產(chǎn)業(yè)剛剛起步，非釀酒酵母在火龍果酒釀制過程中的作用尚未見報道，因此本研究選用非釀酒酵母德爾布有孢圓酵母與釀酒酵母混合，通過對火龍果酒發(fā)酵特性、香氣成分進行研究，探討德爾布有孢圓酵母相關(guān)代謝物對火龍果酒風味及感官特性的影響，以期為生產(chǎn)高質(zhì)量火龍果酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮火龍果：貴州羅甸紅心火龍果；德爾布有孢圓酵母PRELUDE（非釀酒酵母）：CHR HANSEN公司；德爾布有孢圓酵母NS-D（非釀酒酵母）：安琪酵母公司，購入為活性干酵母；釀酒酵母RB2、X16、焦亞硫酸鉀（potassium metabisulfite，PMS）、酒石酸、果膠酶（3 280 U/g，以半乳糖醛酸計）、碳酸氫鉀、酵母營養(yǎng)助劑（均為食品級）：法國Laffort公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1手持糖度計：日本ATAGO公司；DMA35手持酒精測試儀：奧地利安帕公司；GC-MS-QP2010PLUS氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火龍果酒加工工藝流程

火龍果酒發(fā)酵工藝流程見圖1。

圖1 火龍果酒發(fā)酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of pitaya wine

選擇成熟度高、無霉爛變質(zhì)及無病蟲害的新鮮火龍果，用1%H2O2沖洗、去皮，將果肉打漿。根據(jù)果漿的質(zhì)量添加果膠酶（3 g/100 kg），14℃～16℃條件下酶解24 h，紗布過濾除去果渣，根據(jù)所得的果汁體積添加蔗糖調(diào)整火龍果汁的糖度。接種前添加25 mg/L的SO2（以PMS的形式添加）。將4種酵母RB2、X16、PRELUDE、NS-D按3 g/L于30℃條件下用去離子水活化30 min，水體積為酵母體積20倍，當酵母產(chǎn)生豐富氣泡時加入幾滴火龍果汁進行酵母訓化，將活化好的酵母接種在火龍果汁中，在16℃條件下進行恒溫發(fā)酵，每天測定糖度、pH值等變化直至主發(fā)酵結(jié)束（當火龍果酒酒體表面無氣泡產(chǎn)生，酵母生長量、殘?zhí)呛颗c酒精度等趨于穩(wěn)定說明主發(fā)酵結(jié)束）。主發(fā)酵結(jié)束后，將火龍果酒經(jīng)濾網(wǎng)過濾澄清，移入新的發(fā)酵容器于4℃進行低溫陳釀，陳釀結(jié)束后移入容器儲存。

1.3.2 發(fā)酵性能試驗

將火龍果汁進行成分調(diào)整，最終白利糖度（Brix）為22°Bx，pH值為3.8，將果汁均分為8份，在20 L的不銹鋼發(fā)酵桶中進行酒精發(fā)酵。酵母接種活菌數(shù)量為1×106CFU/mL，發(fā)酵溫度為16℃。分別進行釀酒酵母（RB2、X16）和非釀酒酵母（PRELUDE、NS-D）的簡單發(fā)酵與混合發(fā)酵，混合發(fā)酵編號為CF1（RB2+PRELUDE）、CF2（RB2+NS-D）、CF3（X16+PRELUDE）、CF4（X16+NS-D）。

混合酵母發(fā)酵試驗與單菌酵母發(fā)酵試驗同時進行，混合酵母按體積比1∶1接種。每24 h收集一次樣品，測定pH值、酒精度、糖度。

1.3.3 香氣成分分析

火龍果酒香氣成分萃?。簻蚀_量取50 mL酒樣，倒入分液漏斗中，用20 mL二氯甲烷分別萃取3次，每次搖動5 min，待靜置分層后分離出下層二氯甲烷相，將3次萃取后的二氯甲烷合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至 1 mL，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析。氣相色譜條件：毛細管柱VF-WaX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度230℃；載氣為氦氣；流速 1 mL/min；進樣量 2 μL；不分流；柱溫程序：60℃保持2 min，以10℃/min升至150℃保持2 min，再以8℃/min升至210℃保持20 min。質(zhì)譜條件：電子碰撞源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；掃描范圍m/z 40～450。

采用Xcalibur2.0版本軟件及NST2008譜圖庫進行火龍果酒香氣成分的檢索鑒定，兼顧保留時間進行鑒定，采用內(nèi)標法（2-辛醇）進行各組分定量。

1.3.4 感官評價

參考劉文麗等[13]的方法，挑選6名訓練有素的食品專業(yè)人員作為評定人員，其中3女3男，年齡在20歲～30歲之間，試驗在常州大學中澳果酒實驗室的標準品酒室完成，試驗重復3次。所有感官評價采用定量描述分析法（quantitative descriptive analysis，QDA），選取 10點制標度：0～9（香氣：0=沒氣味，9=氣味最強；顏色：0=無顏色，9=顏色最深；味道：0=沒味道，9=味道最強）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Origin 2018作圖，SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法差異分析，P＜0.05，差異顯著；對8種火龍果酒香氣成分的含量進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中糖度、酒精度和pH值變化

不同發(fā)酵體系中火龍果酒理化指標見圖2。

圖2 不同菌種發(fā)酵體系中糖度、酒精度、pH值的變化Fig.2 Changes in total sugar content，ethanol content，and pH in different fermentation systems

從圖2可以看出，不同菌種及其混合發(fā)酵方式下發(fā)酵液的糖度變化趨勢相同，發(fā)酵前期糖度下降速率快，后期下降平緩，直至發(fā)酵結(jié)束糖度基本不變。非釀酒酵母PRELUDE和NS-D對糖的利用率低于釀酒酵母，在發(fā)酵結(jié)束時糖度仍保持較高的水平，混合發(fā)酵對糖的利用率接近單菌釀酒酵母發(fā)酵。

糖是酒精發(fā)酵的基質(zhì)，酵母通過呼吸作用將糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖己推渌碑a(chǎn)物，不同發(fā)酵體系的酒精變化與其糖度變化是相應(yīng)的。由圖2可知，釀酒酵母發(fā)酵的酒精度高達11.7%vol，而德爾布有孢圓酵母由于只能利用發(fā)酵液中的葡萄糖、果糖和蔗糖，不能分解麥芽糖、麥芽三糖，因而產(chǎn)酒精能力較弱[14]，PRELUDE和NS-D酒精度分別為9.8%vol和8.3%vol?；旌习l(fā)酵中的酒精度相較于非釀酒酵母得到明顯提升，這與對糖的利用結(jié)果一致。將非釀酒酵母對酒品質(zhì)的提升能力與釀酒酵母的高效發(fā)酵結(jié)合起來，有利于釀造出高酒精度的高品質(zhì)果酒。

發(fā)酵液的酸堿度是影響酵母發(fā)酵活力的重要因素之一，發(fā)酵液的pH值變化對酵母活動有一定的影響。由圖2可知，不同菌種發(fā)酵體系中pH值的變化趨勢相同，但分解酸的能力不同。由于乙醛脫氫酶的轉(zhuǎn)錄在釀酒酵母中高表達、在德爾布有孢圓酵母中低表達，且乙酰輔酶a合成酶與乙酰輔酶a水解酶的轉(zhuǎn)錄在德爾布有孢圓酵母中高表達、在釀酒酵母中低表達，因而德爾布有孢圓酵母分解乙酸的能力高于釀酒酵母[15]，導致德爾布有孢圓酵母的發(fā)酵液pH值高于釀酒酵母。由圖2可知，混合發(fā)酵液pH值比單菌釀酒酵母發(fā)酵液高，說明混合發(fā)酵可以在生物維度上調(diào)節(jié)果酒酸度，對果酒風味的形成有積極的影響。

2.2 不同發(fā)酵體系中香味物質(zhì)比較

不同發(fā)酵體系中主要香氣成分見表1。

表1 不同發(fā)酵體系中主要香氣成分Table 1 Aroma compounds identified in pitaya wines from different fermentations

由表1可得，8種不同發(fā)酵體系酒樣中共檢測出24種主要香氣成分，其中酯類物質(zhì)9種，酸類物質(zhì)8種，醇類物質(zhì)6種，酮類物質(zhì)1種。

乙酸被認為是影響果酒風味的重要影響因素之一，超過0.7 g/L時會散發(fā)出刺鼻的酸味，給果酒帶來不良口感[16-17]。在單菌發(fā)酵中RB2和X16產(chǎn)生的酸類化合物較多，其中乙酸含量最高達到8.12 mg/L，在PRELUDE和NS-D的單菌發(fā)酵中乙酸含量明顯降低，在混合發(fā)酵中乙酸含量均低于RB2與X16的發(fā)酵液，說明德爾布有孢圓酵母可以降低乙酸的產(chǎn)生[18-19]。苯乙醇可以賦予果酒良好的花香與果香味，乳酸乙酯和葵酸乙酯具有果香和奶油香氣[20]，在PRELUDE和NSD的單菌發(fā)酵液均檢測到高濃度的苯乙醇、乳酸乙酯和葵酸乙酯，說明德爾布有孢圓酵母能夠調(diào)節(jié)果酒香氣[21]。異戊醇是在火龍果酒中產(chǎn)生的較多的高級醇[22]，可以提供酒香，增加火龍果酒香氣的復雜度。

在混合發(fā)酵體系中，酯類物質(zhì)種類與含量較釀酒酵母單菌發(fā)酵明顯增加，在CF1中乳酸乙酯、琥珀酸乙酯與月桂酸乙酯含量升高，在CF3中葵酸乙酯含量增加，酯類化合物具有良好的香味，有助于提高火龍果酒的感官特性。3-甲基-1-戊醇因其具有蘑菇和土壤的特殊氣味常被用于調(diào)味劑和芳香劑，在有PRELUDE和NS-D參與的酒樣中均檢測到相當含量的3-甲基-1-戊醇，表明德爾布有孢圓酵母具有很好地調(diào)節(jié)果酒香氣的潛力[23-24]。

2.3 火龍果酒風味成分主成分分析（principal component analysis，PCA）

主成分特征值及其貢獻率見表2。

表2 主成分特征值及其貢獻率Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

由表2可知，第一主成分貢獻率為71.388%，第二主成分貢獻率為10.468%，2個成分累計貢獻率超過80%，因此2個主成分可以有效解釋變量信息。

不同發(fā)酵體系中風味物質(zhì)主成分分析圖見圖3。

圖3 不同發(fā)酵體系中風味物質(zhì)主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis score and loading plots of the aroma compounds produced from different fermentations

由圖3a可知，1，3-丁二醇、乳酸、棕櫚酸乙酯等與PC1呈顯著正相關(guān)，琥珀酸乙酯、月桂酸乙酯等與PC1呈顯著負相關(guān)。PC2與3-甲基-1-戊醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯等呈顯著正相關(guān)，與乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸等呈顯著負相關(guān)。

由圖3b可知，8種發(fā)酵火龍果酒分別位于不同的4個象限，可以反映出8種發(fā)酵體系的火龍果酒的風味具有較大的差異。RB2與X16在PCA1上得分較高，說明1，3-丁二醇、乳酸、棕櫚酸乙酯在RB2與X16中含量較高，PRELUDE與CF1在PCA2上得分較高，說明3-甲基-1-戊醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯在其中含量較高。PRELUDE與CF1得分接近，兩者風味接近，NSD與CF4得分接近，說明NS-D對CF4的風味形成有調(diào)整作用，RB2與CF3得分接近，X16與CF2得分接近，說明其風味相近。PRELUDE與NS-D位于PC1的負極，RB2與X16位于PC1的正極，而混合發(fā)酵主要集中在PC1的中間位置，說明混合發(fā)酵對果酒的風味物質(zhì)有很大的調(diào)整作用[25-27]。

2.4 不同發(fā)酵體系中火龍果酒的感官評價

通過對不同發(fā)酵體系中火龍果酒的感官評價，得出火龍果酒的主要風味特征為果香、花香、甜香、生青味、發(fā)酵香、酸味、甜味、紅色、醇香，并對各描述特征強度取平均值，如表3所示，并形成風味剖面圖，見圖4。

表3 不同火龍果酒的各項感官屬性得分Table 3 Average scores of pitaya wines from sensory analyses

圖4 不同發(fā)酵體系中火龍果酒的感官評價雷達圖Fig.4 Radar plots depicting the favor profles of pitaya wines produced by different fermentation

就香氣屬性而言，花香、果香、醇香是火龍果酒的主要香氣特征，在果香和花香上PRELUD、NS-D與CF1得分較高，RB2與X16得分較低。RB2、X16與CF1醇香濃烈豐滿，CF3與CF4醇香寡淡單薄。生青味對火龍果酒香氣貢獻較小，發(fā)酵香在各火龍果酒中差異不大。就味道屬性而言，由于PRELUDE與NS-D對糖分利用不足且產(chǎn)酸低，造成它們在口味上偏甜，且酸味不足，酒體單薄，口感單調(diào)，在混合發(fā)酵CF1～CF4中，酒體圓潤、豐滿，酸甜適中，爽口。就色澤屬性而言，除CF4外，其他7種火龍果酒色澤紅艷，紅色調(diào)突出，外觀良好。綜上所述，CF1混合發(fā)酵火龍果酒香氣馥郁協(xié)調(diào)，酒體醇厚圓潤，口感酸爽，色澤紅艷，屬于高品質(zhì)火龍果酒。

3 結(jié)論

本試驗對兩種非釀酒酵母與釀酒酵母的單菌發(fā)酵及混合發(fā)酵的發(fā)酵特性與風味進行了分析。發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母PRELUDE與NS-D雖對糖源利用不足，酒精發(fā)酵能力低，但結(jié)合釀酒酵母RB2與X16后酒精度可接近釀酒酵母。PRELUDE與NS-D都有很好地降低乙酸的能力，產(chǎn)苯乙醇、乳酸乙酯和葵酸乙酯的能力高，且可以產(chǎn)出具有異域風味的3-甲基-1-戊醇，混合發(fā)酵可以在生物維度上調(diào)節(jié)火龍果酒的酸度，同時提高酒體中酯類物質(zhì)的種類與含量，能夠賦予火龍果酒良好的風味特征與香氣屬性。在感官評價中混合發(fā)酵CF1花香和果香濃郁，酸甜爽口，顏色紅艷明亮，表現(xiàn)出更佳的感官品質(zhì)。以上結(jié)果說明德爾布有孢圓酵母PRELUDE與RB2混合發(fā)酵有利于釀造出香氣豐富、口感醇厚的高品質(zhì)火龍果酒。