王昱，秦序，何九軍，王逸璇

(1.隴南師范高等專科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500;2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

白肉靈芝是我國靈芝屬中一個重要種類，菌肉潔白，多糖和三萜等活性成分含量較高，被視為高品質(zhì)的靈芝種類[1].現(xiàn)代藥理研究表明白肉靈芝中的生物活性成分穩(wěn)定性高且易通過機(jī)體血腦屏障，能促進(jìn)新生神經(jīng)元的發(fā)生[2-3]，因此在防治神經(jīng)退行性疾病中備受關(guān)注.本課題組前期研究表明白肉靈芝水提物(Ganodermaleucocontextumaqueous extracts,GLAE)在增加皮膚彈性和減少皮膚皺紋形成方面有重要作用[4].而基于炎癥反應(yīng)、神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)特異蛋白分子在神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用的重要地位，已被學(xué)者們認(rèn)為是診斷神經(jīng)功能退行性疾病的重要指標(biāo)與有效治療靶點(diǎn).研究發(fā)現(xiàn)在炎癥損傷中，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1(interleukin-1β,IL-1β)是引起神經(jīng)元炎癥的重要因子，也是反映腦組織損傷的重要指標(biāo)[5-6].腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、β-神經(jīng)生長因子(β-nerve growth factor,β-NGF) 、原肌球蛋白受體激酶 B(tropomyosin receptor kinase B,TrkB)和原肌球蛋白受體激酶 A(tropomyosin receptor kinase A,TrkA)是重要的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白及受體，對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、維持和損傷修復(fù)具有重要作用[7-10].為了進(jìn)一步探討GLAE的生物學(xué)作用，本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷模型，運(yùn)用ELISA法、免疫組化化學(xué)法、Western-blot和PCR等技術(shù)對GLAE的抗炎作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期為GLAE的臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

白肉靈芝水提物為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)制備，上海生物工程有限公司測序鑒定為白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum).根據(jù)文獻(xiàn)[2]，取白肉靈芝子實(shí)體干品粉碎機(jī)粉碎，60目過篩，96 ℃水浴提取6 h，離心，收集上清，過濾，濾液凍干，得到GLAE.

脂多糖(LPS)來源Escherichia coli 055：B5，Sigma 公司；白細(xì)胞介素1(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)放射免疫試劑盒均購自武漢博士德生物工程研究所，批號分別為EK0393、EK0526；ELISA檢測試劑盒(BDNF和β-NGF)，北京百奧萊博科技有限公司，批號分別為ZN2813-TXC、ZN2820-LPN；兔單抗TrkB、TrkA、BDNF、NGF購自Cell signaling 公司，批號為4603、4602、ab222060、ab52918；β-actin，Cell signaling 公司，批號4970L；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Servicebio 公司，批號 GB23303；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時熒光定量PCR試劑購自Taka Ra公司；引物由Invitrogen(上海) 公司設(shè)計(jì)合成.

主要儀器設(shè)備：DYCPZ 型電泳槽、DYY-IB 型電泳儀(北京市六一儀器廠)；DKZ系列恒溫水浴箱(上海一恒科技有限公司)；Image Lab 凝膠分析系統(tǒng)(美國 Bio-Rad 公司)；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)(美國Beckman-coulter公司)；Nikon FX-35WA顯微鏡(日本Nikon公司)；7900 HT Sequence Detection System定量PCR儀(美國ABI公司).

1.2 試驗(yàn)動物與給藥

10周齡健康SD大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(甘) 2005-0007.在恒溫(21～23 ℃)、恒濕(45%～65% )、12 h明暗周期的飼養(yǎng)室，全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水.正常飼養(yǎng)7 d 后用隨機(jī)區(qū)組法分為5組，每組10只：對照組、模型組、GLAE低、中、高劑量組[50、100、200 mg/kg)].按照試驗(yàn)動物福利倫理規(guī)章分別給模型組和GLAE組大鼠連續(xù)2周每日腹腔注射LPS溶液(以體質(zhì)量計(jì))0.25 mg/kg[11-12]，對照組腹腔注射等體積生理鹽水.同時GLAE組均按10 mL/kg進(jìn)行灌胃給藥[4]，1 次/d，對照組灌胃等體積的生理鹽水.

1.3 ELISA 法檢測大腦額葉皮層IL-1β、TNF-α、BDNF和 β-NGF含量檢測

末次給藥后，迅速取大腦額葉皮層，洗凈、冰浴勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，參考試劑盒說明書測定腦組織L-1β、TNF-α、BDNF和β-NGF含量.

1.4 免疫組織化學(xué)法觀察大腦額葉皮層NGF蛋白的表達(dá)

采用免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶連結(jié)法)：末次給藥后，取大鼠大腦額葉皮層數(shù)塊置于4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后冠狀位切片，厚6 μm，脫蠟、抗 原修復(fù)后，用3% H2O2室溫孵育10 min，正常兔血清室溫封閉30 min，然后用NGF抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；次日取出切片以PBS沖洗后，再依次滴加生物素化羊抗兔IgG 孵育30 min，SABC工作液孵育30 min，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，空白對照以PBS代替一抗.常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照.

用美國Image-pro plus 5.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析.從NGF陽性反應(yīng)的切片中各選3張，檢測活性物質(zhì)在大腦皮層中表達(dá)的強(qiáng)度.測量時保證光源的穩(wěn)定，并且取圖之前預(yù)熱20 min以上，采圖時各項(xiàng)設(shè)置包括光源、光圈大小、白平衡、曝光強(qiáng)度、敏感度、對比度等均改為手動調(diào)節(jié)且固定，以保證每次取圖系統(tǒng)的設(shè)置值一樣.取平均光密度和積分光密度2個指標(biāo)，測量值的平均值為最終灰度值.

1.5 Western blot 各組大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白的表達(dá)

按照常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白質(zhì)試劑盒分別測定各試驗(yàn)組蛋白量.依次加樣、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和室溫封閉.按抗體說明書加入兔抗鼠一抗TrkB、TrkA、BDNF、NGF(均為1∶1 000)，4 ℃冰箱過夜，充分洗滌，加偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的二抗IgG(1∶2 000)，ECL顯色，以β-actin(1∶2 000)作為內(nèi)參照，運(yùn)用Image Lab 軟件進(jìn)行曝光成像，采用Quantity one 軟件分析條帶灰度值，試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.6 PCR檢測各組大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA的表達(dá)

取大鼠大腦額葉皮層，加入Trizol后在冰浴中勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心 15 min，取上清液通過酚-氯仿抽提RNA，將抽提的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增.PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)完畢采用 ABI 7500 軟件分析，用公式 2-△△Ct方法進(jìn)行相對定量.

表1 目的基因引物序列

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 各試驗(yàn)組大鼠大腦額葉皮層炎癥細(xì)胞因子的變化

由圖1可知，模型組大鼠大腦額葉皮層TNF-α和IL-1β含量均較對照組顯著增高，有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).與模型組比較，GLAE低、中、高劑量組大鼠大腦額葉皮層TNF-α和IL-1β含量均較模型組不同程度降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01).

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05).

2.2 各試驗(yàn)組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF含量的變化

由表2可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF含量均極顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF 含量顯著升高(P<0.05，P<0.01).

表2 各試驗(yàn)組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF 含量比較

2.3 各試驗(yàn)組大鼠大腦額葉皮層NGF蛋白的表達(dá)

由圖2可知，NGF蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，部分細(xì)胞核著色，呈棕黃色，陰性對照組細(xì)胞無NGF陽性表達(dá).由表3可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層NGF蛋白表達(dá)的平均光密度和積分光密度極顯著降低(P<0.01)，表明NGF蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)極顯著減少(P<0.01).與模型組相比，GLAE低、中、高劑量組大鼠大腦額葉皮層NGF蛋白表達(dá)的平均光密度和積分光密度顯著增加(P<0.05，P<0.01)，表明NGF蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05，P<0.01).

表3 各試驗(yàn)組大腦額葉皮層NGF蛋白表達(dá)的比較

A：對照組；B：模型組；C：GLAE低劑量組；D：GLAE中劑量組；E：GLAE高劑量組；F：陰性對照組； “→”表示陽性細(xì)胞.

2.4 各試驗(yàn)組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白的表達(dá)

由圖3可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量上調(diào)了大鼠額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白的表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01).

圖3 大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白印跡分析

2.5 各試驗(yàn)組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA的表達(dá)

由圖4可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量上調(diào)了大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01).

圖4 各試驗(yàn)組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA表達(dá)比較

3 討論

神經(jīng)炎癥反應(yīng)與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，減少炎癥因子和相關(guān)分子的表達(dá)，可降低阿爾茨海默病(AD)、抑郁癥、享廷頓病、帕金森病等疾病的發(fā)生率或延遲發(fā)病、改善癥狀[11-14]，說明神經(jīng)炎癥參與了AD、抑郁癥等的病理生理學(xué)過程.在發(fā)生神經(jīng)炎癥時，腦組織相關(guān)炎癥因子(如TNF-α、IL-1β、COX-2)含量明顯增高，通過激活自身信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生進(jìn)一步增加，形成正反饋，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡、與腦組織的損傷程度呈正相關(guān)性[7-8].LPS是一種誘導(dǎo)動物模型神經(jīng)炎癥的常用誘導(dǎo)劑[15].所以，本試驗(yàn)采用 LPS 誘導(dǎo)大鼠建立神經(jīng)元炎癥損傷模型，結(jié)果顯示模型組大鼠大腦額葉皮層TNF-α和IL-1β含量顯著增加，經(jīng)GLAE干預(yù)后，額葉皮層TNF-α和IL-1β含量顯著降低，這提示GLAE能抑制炎癥因子的釋放，拮抗腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)腦的作用.

研究表明，神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類由神經(jīng)所支配的組織產(chǎn)生的且為神經(jīng)元生長與功能維持所必需的蛋白質(zhì)分子，但神經(jīng)營養(yǎng)因子的失常、缺失或不足，往往導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)某些疾病的發(fā)生和神經(jīng)再生的失敗[16].這提示用這類因子治療神經(jīng)退行性疾病或促進(jìn)神經(jīng)再生具有可能性，也是目前研究或診斷治療神經(jīng)潰變性疾病的重要靶點(diǎn).NGF 是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，能促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、成熟，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)[7].BDNF是含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元存活、分化及突觸可塑性調(diào)節(jié)中起重要作用[17-18].BDNF和NGF轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白分子可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)、存活及再生，從而減輕細(xì)胞損傷[19-20].在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷動物模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腦組織中BDNF表達(dá)減少，神經(jīng)元凋亡增加，再生能力降低，而將BDNF注入腦組織時可明顯改善損傷癥狀[21-22].TrkB、TrkA 是神經(jīng)營養(yǎng)因子最主要催化受體，其中mNGF是TrkA的首選配體，mBDNF是TrkB的首選配體.BDNF和NGF蛋白與受體TrkB、TrkA的結(jié)合可調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生長、存活、分化和可塑性[9-10].本試驗(yàn)研究顯示，模型組大鼠大腦額葉皮層呈現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其相關(guān)因子表達(dá)水平顯著下調(diào)，經(jīng)GLAE干預(yù)后，大腦額葉皮層的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF 及其受體TrkA、TrkB蛋白和mRNA表達(dá)都顯著上調(diào).Keefe 和Ola等[23-24]研究表明BDNF /TrkB、NGF /TrkA 信號通路異常可介導(dǎo)神經(jīng)元死亡、功能缺失或紊亂繼而導(dǎo)致認(rèn)知功能的障礙，而激活 BDNF /TrkB、NGF /TrkA 信號通路能明顯改善學(xué)習(xí)記憶能力和促進(jìn)神經(jīng)元的再生.因此推測GLAE可通過BDNF /TrkB、NGF /TrkA 信號通路發(fā)揮對抗炎癥反應(yīng)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用.

4 結(jié)論

綜上所述，GLAE對LPS所致的神經(jīng)元損傷有一定的保護(hù)作用，這種作用可能與GLAE抑制炎癥因子水平，激活BDNF /TrkB、NGF /TrkA信號通路，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，促進(jìn)大腦皮層神經(jīng)元生長有關(guān).