楊敏，滾雙寶,2，閆尊強(qiáng)，王鵬飛，楊巧麗，黃曉宇，唐于然，石海霞，馬艷萍，趙進(jìn)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬技術(shù)工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書(shū)館，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅省靈臺(tái)縣什字鎮(zhèn)畜牧開(kāi)發(fā)服務(wù)站，甘肅 平?jīng)?744404)

microRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA分子，主要通過(guò)與靶mRNA的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合降解靶基因mRNA或抑制其正常翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平以序列特異性的方式調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]，能夠在眾多生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要功能[2].

諸多學(xué)者對(duì)miRNA在豬病毒性、細(xì)菌性腸道疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用開(kāi)展了大量研究.吳俊靜等[3]研究報(bào)道，miR-27b-3p能顯著抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)在宿主細(xì)胞中的增殖；Yao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143和miR-26在沙門(mén)氏菌感染豬的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用；訾臣[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-192和miR-7136-5p能通過(guò)調(diào)控其相應(yīng)的靶基因在斷奶仔豬對(duì)大腸桿菌侵襲、維持腸道穩(wěn)定、免疫調(diào)控等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用.以上研究表明，miRNA在豬病毒性和細(xì)菌性腸疾病發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用.產(chǎn)氣莢膜梭菌，又稱(chēng)魏氏桿菌，能夠引起動(dòng)物腹瀉、腸毒血癥等腸道疾病[6-7].Dinh等[8]和Hong等[9]研究證明，肉仔雞在感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后，其小腸中miRNA表達(dá)發(fā)生了明顯變化.Hong等[10]研究報(bào)道，被灌服產(chǎn)氣莢膜梭菌后的羅斯雞出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象；郭宇[11]和王玉建等[12]研究發(fā)現(xiàn)，羔羊在感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后出現(xiàn)腹瀉并呈現(xiàn)出典型的小腸潰瘍現(xiàn)象.這些研究表明，miRNA在雞、羊等動(dòng)物感染產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腹瀉等疾病中起著重要作用.根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生致病性毒素的不同，將其分為A、B、C、D和E 5種類(lèi)型[13]，其中，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起仔豬腹瀉的重要病原菌之一[14].Petit等[15]研究發(fā)現(xiàn)，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌侵入機(jī)體后，粘附到小腸上皮細(xì)胞的絨毛頂端，并能夠在絨毛基底膜處大量繁殖，其產(chǎn)生的毒素直接或間接作用于腸絨毛和內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷和壞死，引起絨毛粘膜或組織出血、壞死，進(jìn)而導(dǎo)致仔豬腹瀉.

目前，有關(guān)miR-96-5p的研究多集中在癌癥和腫瘤方面，已有研究表明，miR-96-5p可以通過(guò)靶向作用于轉(zhuǎn)移抑制蛋白1(metastasis suppressor 1，MTSS1)、窩蛋白-l(caveolae-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteinyl aspartate-specific protease-9，caspase-9)等基因參與結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌、甲狀腺癌、膀胱癌、腎上腺皮質(zhì)和腎上腺髓質(zhì)腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[16-20].本課題組前期對(duì)感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌仔豬的回腸組織進(jìn)行了Illumina Solexa高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNA共有53個(gè)，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miR-96-5p很可能在仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染過(guò)程中起重要調(diào)控作用[21]，但是miR-96-5p在仔豬各組織中的表達(dá)情況以及其通過(guò)哪些靶基因及通路發(fā)揮功能尚不清楚，還有待開(kāi)展相關(guān)研究.本研究擬采用RT-qPCR檢測(cè)miR-96-5p在仔豬不同組織中的表達(dá)量，從而構(gòu)建組織表達(dá)譜，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶基因并進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，篩選和鑒定miR-96-5p靶向調(diào)控C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的關(guān)鍵靶基因，以期進(jìn)一步加深miR-96-5p在調(diào)控仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染過(guò)程中的具體分子機(jī)制研究，為培育抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉豬品系提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物選用體質(zhì)量和初生重基本相同且大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌抗體均為陰性的健康仔豬30頭，從中隨機(jī)挑選5頭作對(duì)照組(IC)，其余25頭攻毒，攻毒組仔豬每頭每天灌服C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液1 mL，而對(duì)照組仔豬則灌服等量不含菌液的培養(yǎng)液，試驗(yàn)期5 d[22].參考腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各仔豬腹瀉進(jìn)行評(píng)分[23]，根據(jù)腹瀉總評(píng)分將攻毒組仔豬由高到低進(jìn)行排序，前五名及后五名分別分為易感組(IS)和耐受組(IR).試驗(yàn)期滿(mǎn)后屠宰仔豬，采集心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、空腸、回腸等組織，液氮速凍保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后-80 ℃超低溫冰箱保存.

1.2 試驗(yàn)試劑

Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司(北京，中國(guó))；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime SeriptTMreagent Kit with gDNA Eraser、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒miRNA First Strand Synthesis Kit試劑盒、熒光定量試劑盒TB Greenser with gDNTaqTMaqGr(Tli RNaseH Plus)均購(gòu)自寶生物工程有限公司(大連，中國(guó)).

1.3 總RNA提取及cDNA合成

參照Trizol使用說(shuō)明書(shū)，用Trizol法提取仔豬各組織總RNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，再用凝膠電泳檢測(cè)其完整性，合格后的總RNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中選取試驗(yàn)驗(yàn)證所需的基因及內(nèi)參基因GAPDH的mRNA序列，采用Primer Premier 5.0和Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)引物.在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)上查找豬miR-96-5p的成熟體序列(UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU)，設(shè)計(jì)上游引物(GGCACTAGCACATTTTTGCT)，下游使用試劑盒自帶通用引物，以U6為內(nèi)參.引物由金唯智生物科技有限公司(蘇州)合成，引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1.

表1 引物信息

1.5 miR-96-5p在不同物種中的保守性分析

在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中下載人(Homosapiens)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)、豬(Susscrofa)、大西洋鱈(Gadusmorhua)、鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)、安大略鮭(Salmosalar)、錦龜(Chrysemyspicta)、家兔(Oryctolaguscuniculus)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)、九帶犰狳(Dasypusnovemcinctus)、原鴿(Columbalivia)、中央狐蝠(Pteropusalecto)、豚鼠(Caviaporcellus)等14個(gè)物種miR-96-5p的成熟序列，采用MEGA 5.0軟件分析其保守性.

1.6 miR-96-5p靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

由于目前關(guān)于miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無(wú)豬這一種屬，因此將miR-96-5p按照序列比對(duì)至人的miRNA，再通過(guò)TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)3種數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-96-5p靶基因，利用Venny在線軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取3種數(shù)據(jù)庫(kù)的交集；然后結(jié)合miRTarBase(http://miRtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/browse.php)數(shù)據(jù)庫(kù)中已驗(yàn)證的miR-96-5p靶基因，共同組成miR-96-5p的靶基因集合.利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7中的Functional Annotation Tool對(duì)miR-96-5p的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)和KEGG-Pathway通路富集分析.

1.7 RT-qPCR檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-96-5p的保守性分析

在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出人、大鼠、小鼠、豬、大西洋鱈、鴨嘴獸、安大略鮭、錦龜、家兔、斑馬魚(yú)、九帶犰狳、原鴿、中央狐蝠、豚鼠14個(gè)物種miR-96-5p的成熟序列，進(jìn)行對(duì)比分析(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96-5p的成熟體序列為：UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU，在各個(gè)物種(如人、大鼠、家兔)之間具有高度的保守性.

表2 多個(gè)物種(miR-96-5p)成熟體序列

2.2 miR-96-5p的組織表達(dá)譜構(gòu)建

本研究對(duì)對(duì)照組仔豬各組織中的miR-96-5p進(jìn)行了定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-96-5p在空腸中的表達(dá)量最高，其次為肺、回腸組織，在肝、腎、十二指腸和胃中度表達(dá)，心臟和脾臟中表達(dá)量較低(圖1).

不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01).

2.3 miR-96-5p靶基因預(yù)測(cè)

選擇TargetScan、miRWalk和miRDB 3款生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-96-5p的靶基因，分別得到418、1 101和10 189個(gè)靶基因，3款軟件交集的共有179個(gè)基因(圖2)，合并miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的21個(gè)靶基因，去掉7個(gè)重復(fù)，將最終獲得的193個(gè)靶基因作為后續(xù)GO功能和KEGG通路富集分析的靶基因集合.

圖2 miR-96-5p靶基因交集預(yù)測(cè)

2.4 miR-96-5p靶基因GO功能和KEGG通路富集分析

2.4.1 miR-96-5p靶基因GO功能分析 對(duì)獲得的193個(gè)靶基因集合進(jìn)行GO功能條目注釋分類(lèi)和富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)，在生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)層面，miR-96-5p靶基因主要顯著富集在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織、大腦皮層發(fā)育、經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控、平滑肌組織發(fā)育、通路受限的SMAD蛋白磷酸化的負(fù)調(diào)控、神經(jīng)元干細(xì)胞群維持、蛋白酶體泛素依賴(lài)蛋白分解代謝過(guò)程的正調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過(guò)程的正調(diào)控GO功能條目中(P<0.01)；在細(xì)胞組分(cellular component，CC)層面，靶基因顯著富集于樹(shù)突、神經(jīng)元胞體GO條目中(P<0.01)；在分子功能(molecular function，MF)層面，靶基因顯著富集于金屬離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合GO條目中(P<0.01).

2.4.2 miR-96-5p靶基因KEGG通路富集分析 對(duì)預(yù)測(cè)所得靶基因集合中的193個(gè)基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3)，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，miR-96-5p預(yù)測(cè)的靶基因集合顯著富于ErbB、MAPK、FoxO、PI3K-Akt、癌癥中的通路等12個(gè)信號(hào)通路和前列腺癌、膠質(zhì)瘤、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、子宮內(nèi)膜癌等8個(gè)與疾病相關(guān)的通路.其中與免疫炎癥反應(yīng)和感染性疾病相關(guān)的ErbB、MAPK信號(hào)通路也發(fā)生了顯著富集(P<0.05).

圖3 miR-96-5p靶基因KEGG通路富集分析

表3 miR-96-5p的靶基因統(tǒng)計(jì)

表4 miR-96-5p靶基因GO富集分析

2.5 RT-qPCR分析結(jié)果

miR-96-5p的RT-qPCR結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致(圖4-A～B).對(duì)miR-96-5p的2個(gè)關(guān)鍵的靶基因(FOXO1、MAP2K1)的表達(dá)量進(jìn)行了RT-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)靶基因FOXO1和MAP2K1的表達(dá)量與miR-96-5p成相反趨勢(shì)，并且兩個(gè)靶基因的表達(dá)趨勢(shì)均表現(xiàn)為，IR和IS組極顯著低于IC組(P<0.01)，IS組極顯著低于IR組(P<0.01，圖4-C～D).

IC：對(duì)照組；IR：耐受組；IS：易感組；**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05).

3 討論

miRNA在生物體內(nèi)具有重要的調(diào)控功能，涉及到生物體生命活動(dòng)的各個(gè)方面，包括生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、細(xì)胞分化及凋亡和多種疾病(如腹瀉)的發(fā)生發(fā)展[24].Zheng等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221-5p在預(yù)防和治療豬流行性腹瀉病毒的感染的過(guò)程中起重要作用.Yao等[26]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221、miR-125b和miR-27b在豬抵抗沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致腹瀉過(guò)程中起重要作用.孫倩[27]研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以起刺激MAPK和PIK3-Akt等信號(hào)通路的作用，進(jìn)而影響腸道免疫因子，影響仔豬腸道的健康.腹瀉在養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在，是導(dǎo)致仔豬死亡的主要原因[28]，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益.仔豬腹瀉與飼養(yǎng)管理、病原菌感染、遺傳等因素密切相關(guān)[29]，病原菌感染引起仔豬腹瀉在生產(chǎn)中常見(jiàn)，其中C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起仔豬腹瀉的病原菌之一[14,30]，其主要寄生并侵襲仔豬腸道，從而引起腹瀉[31].本課題組前期對(duì)感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌仔豬回腸組織進(jìn)行了高通量測(cè)序，篩選出差異表達(dá)miR-96-5p，推測(cè)其可能在仔豬感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[21].

諸多研究表明，miRNA的表達(dá)具有組織特異性[27]，這種特異性表達(dá)與其發(fā)揮的特異性功能密切相關(guān)[31]，Liang等[33]和Chan等[34]研究發(fā)現(xiàn)，miR-183、miR-135和miR-150等能夠在豬脂肪組織中特異性表達(dá)，具有促進(jìn)脂肪沉積的作用；吳正常等[35]研究發(fā)現(xiàn)，miR-215和miR-192可以在豬腸道部分特異性表達(dá)，能夠參與維持?jǐn)嗄套胸i腸道正常功能，并在心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺和淋巴等組織器官中呈中低表達(dá).王偉等[31]研究發(fā)現(xiàn)，miR-204在豬與免疫炎癥相關(guān)的組織器官中特異性表達(dá)，發(fā)揮著與免疫相關(guān)的作用，miR-204還在腎臟組織及小腸各段組織中呈中高度表達(dá).本研究通過(guò)構(gòu)建miR-96-5p的組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-96-5p在豬空腸、回腸等腸道組織高表達(dá)，十二指腸部分中度表達(dá)(圖1)，這說(shuō)明miR-96-5p在腸道部分具有組織表達(dá)特異性，推測(cè)其在維持仔豬腸道正常功能方面具有重要作用.

本課題組前期對(duì)感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌仔豬回腸組織進(jìn)行了高通量測(cè)序，篩選出了差異表達(dá)miR-96-5p[21]，推測(cè)其可能是仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重要miRNA分子.本研究預(yù)測(cè)了miR-96-5p的靶基因集合并對(duì)其進(jìn)行了KEGG富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96-5p的靶基因顯著富集于一些與腹瀉、腸道炎癥等疾病相關(guān)的信號(hào)通路，如ErbB信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路.Yan等[36]和Yang等[37]的研究也發(fā)現(xiàn)，MAPK通路在小鼠腸道炎癥的治療、改善腸道疾病以及維護(hù)腸粘膜屏障的完整性方面起著重要的作用；Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌源真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌醇通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子；Duan等[39]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腸上皮中的鉀通道和氯通道激活ErbB通路可抑制腹瀉.由此我們推測(cè)，顯著富集的ErbB和MAPK信號(hào)通路上的基因在仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉中有重要調(diào)控作用.經(jīng)初步篩選，得到2個(gè)顯著富集的ErbB和MAPK信號(hào)通路上miR-96-5p的靶基因FOXO1和MAP2K1，已有報(bào)道指出FOXO1基因是一種著名的腫瘤抑制基因，可以調(diào)控DNA的修復(fù)和細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變[40]，馬莉莉[41]在研究牛病毒性腹瀉病毒過(guò)程中，將牛病毒性腹瀉病毒感染的胎牛腎細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)FOXO1基因差異表達(dá)，說(shuō)明FOXO1在病毒性腹瀉病毒感染的疾病中起作用；Yang等[42]在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-425靶向調(diào)控FOXO1促進(jìn)淋巴細(xì)胞生成大量的炎性因子Th17，說(shuō)明FOXO1的下調(diào)表達(dá)會(huì)促進(jìn)炎性因子的生成，這與本試驗(yàn)中仔豬在感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌后，相比較于IC組仔豬，IR組與IS組仔豬回腸的表達(dá)量明顯下調(diào)結(jié)果一致.MAP2K1基因，又稱(chēng)Mek1，是蛋白激酶家族的成員之一[43].曹燕飛[44]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)上調(diào)實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸粘膜組織MAP2K1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起到了治療作用，說(shuō)明MAP2K1基因起到了抑制炎癥作用；宋金楊[45]在研究中發(fā)現(xiàn)，MAP2K1是miR-181a的靶基因，miR-181靶向調(diào)控MAP2K1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)下游NLRP3炎癥通路激活，說(shuō)明MAP2K1基因下調(diào)表達(dá)可起到促進(jìn)炎癥作用，而上調(diào)表達(dá)時(shí)則會(huì)抑制炎癥，這與本試驗(yàn)中仔豬在感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌后，MAP2K1基因在IC組、IR組和IS組表達(dá)量依次降低的結(jié)果相符合.因此，推測(cè)這些關(guān)鍵靶基因(FOXO1和MAP2K1)可能在仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉的過(guò)程中起著重要的作用.

4 結(jié)論

仔豬回腸組織中高表達(dá)的miR-96-5p可能通過(guò)調(diào)控ErbB、MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶基因MAP2K1和FOXO1來(lái)參與仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腹瀉過(guò)程，起抑制仔豬腸道組織中的炎癥反應(yīng)的作用，該研究結(jié)果可為深入研究C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致仔豬腹瀉的分子機(jī)理提供參考.