董文豪，宮曉煒，鄭福英，劉永生，張磊，張小麗，陳啟偉，馬小軍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

抗生素是由微生物或高等動植物在生長代謝過程中所產(chǎn)生，或由人工合成的一類具有抗病原微生物能力的物質(zhì)[1].抗生素自其發(fā)現(xiàn)以來，在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了很大的作用.但隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，近年來抗生素的濫用問題越來越嚴(yán)重，細(xì)菌的耐藥性也在逐步升級，因此出現(xiàn)了許多多重耐藥菌和超級耐藥菌[2].由于耐藥菌對大部分抗生素均不敏感，在動物機(jī)體內(nèi)可大肆繁殖，嚴(yán)重影響人類及動物的健康.因此急需尋找一種抗生素的替代品，用于臨床及生產(chǎn).微生態(tài)制劑作為一種新的飼料添加劑來替代抗生素必將成為一種新趨勢[3].

我國對畜產(chǎn)品的安全要求不斷提高，2013年12月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了飼料添加劑目錄(2013)，其中允許作為飼料添加劑使用的微生物種類達(dá)到34種，相比飼料添加劑目錄(2008)增加了18種，表明將微生物作為飼料添加劑已逐漸被認(rèn)可，其應(yīng)用在我國也將進(jìn)一步普遍和廣泛[4].近年來，國內(nèi)外研制出多種益生菌活菌制劑，其基本指導(dǎo)思想是用人或動物正常腸道菌群中的菌株，經(jīng)過篩選和人工繁殖，通過不同方法制成活菌制劑，然后再以口服投喂方式返回原環(huán)境發(fā)揮其生理作用[5].健康豬腸道內(nèi)的微生物比較復(fù)雜，益生菌以及條件性致病菌共存.益生菌隨著食物進(jìn)入動物消化道后先到達(dá)胃部，通過一個(gè)含有胃蛋白酶的酸性環(huán)境后到達(dá)小腸，經(jīng)胰蛋白酶、胰脂肪酶等各種消化酶和膽鹽的消化作用，最后能在胃腸道中存活下來并達(dá)到一定數(shù)量才有可能發(fā)揮作用[6].因此，益生菌需要能夠耐受胃腸道環(huán)境，如芽孢桿菌在其生長發(fā)育后期可形成一個(gè)抗逆性強(qiáng)的芽孢休眠體[7].

動物體內(nèi)的益生菌主要有芽孢桿菌和乳酸菌兩大類，而芽孢桿菌因營養(yǎng)要求低、易培養(yǎng)且具有較高抗逆性而被廣泛應(yīng)用[8].芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然界，易從動物腸道、糞便、土壤及水體中分離得到[9].芽孢桿菌是好氧菌，在動物腸道中可生物奪氧，為乳酸菌提供賴以生存的厭氧環(huán)境，維持腸道微生態(tài)平衡[10].芽孢桿菌在生長過程中可產(chǎn)生各種酸類及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制腸道致病菌的生長，在生長代謝過程中可產(chǎn)生多種水解酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶等，從而補(bǔ)充腸道內(nèi)源酶的不足，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高飼料利用率及生產(chǎn)性能[11].此外芽孢桿菌還能生成各種氧化酶類，促進(jìn)各類腐敗物質(zhì)的氧化分解，改善宿主健康和畜舍環(huán)境[12].可見，芽孢桿菌微生態(tài)制劑在醫(yī)藥和動物養(yǎng)殖生產(chǎn)上有很高的應(yīng)用價(jià)值[13].但由于制備技術(shù)不規(guī)范、菌株選取不優(yōu)良、作用效果不明確等問題，其嚴(yán)重影響著微生態(tài)制劑的應(yīng)用和推廣發(fā)展.另外，益生菌是否具有耐藥性，是否存在可轉(zhuǎn)移的抗性基因是一個(gè)重要的安全問題[14].歐洲食品安全局要求，在生產(chǎn)一種供人類使用的菌株時(shí)，不能存在任何可能對人類造成潛在風(fēng)險(xiǎn)的耐藥性獲得基因[15].盡管耐藥性細(xì)菌在食品生態(tài)系統(tǒng)中的傳播已成為全球關(guān)注的問題，但只涉及了部分致病菌和乳酸菌，而有關(guān)芽孢桿菌屬的耐藥性研究較少，信息有限[16].

地衣芽孢桿菌作為益生菌已在世界范圍內(nèi)被廣泛開發(fā)和應(yīng)用多年，是益生菌中公認(rèn)的安全菌株，具有開發(fā)潛力的菌種之一.地衣芽孢桿菌作為一種益生菌，在植物病害防治、飼料添加劑、醫(yī)藥開發(fā)、微生態(tài)制劑、環(huán)境污染治理等方面具有廣泛的應(yīng)用.另外，地衣芽孢桿菌還可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，對一些致病菌具有抑制能力，其微生態(tài)制劑在醫(yī)藥和動物養(yǎng)殖生產(chǎn)上有很高的應(yīng)用價(jià)值[17].而近年來對地衣芽孢桿菌的研究多在產(chǎn)品開發(fā)上，對其抑菌機(jī)理及抑菌成分的研究較少.因此本研究計(jì)劃從豬胃腸道及豬糞便中分離地衣芽孢桿菌，篩選出耐酸、耐膽鹽、抗逆性好，且具有產(chǎn)各種酶類功能的優(yōu)勢菌株，進(jìn)行生物學(xué)功能及其體外益生性能的研究，并檢測其是否具有抗藥性及耐藥基因，探究該菌對病原菌的抑制能力，為后期微生態(tài)制劑的研發(fā)提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 2020年8～12月分別在蘭州、劉家峽、甘南三地屠宰場采集豬糞便，豬小腸及豬胃內(nèi)容物，無菌塑封袋包裝后低溫運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室.

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 牛膽鹽、剛果紅染液、碘液均購于北京Solarbio公司、革蘭氏染色試劑盒購于Sigma公司、TaqDNA聚合酶、DNA Marker購于諾唯贊公司；葡萄糖胰蛋白胨培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等均購買于環(huán)凱微生物；淀粉培養(yǎng)基，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na)、干酪素培養(yǎng)基均購于北京Solarbio公司；鮮血瓊脂平板購于環(huán)凱微生物；藥敏紙片購于杭州濱和微生物公司.

1.1.3 菌株 標(biāo)準(zhǔn)致病菌株主要用于檢測分離菌的抑菌能力，金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸桿菌ATCC25922、腸炎沙門氏菌(CVCC3374)均由蘭州獸醫(yī)研究所草食動物細(xì)菌病實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 本試驗(yàn)所用引物均由西安擎科生物公司合成，引物序列見表1.

表1 引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察 取樣品80 ℃水浴加熱15 min，殺滅其他非芽孢菌.待樣品冷卻劃線接種于葡萄糖胰蛋白胨瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h.挑單個(gè)菌落劃線接種于新的平板，純化培養(yǎng)，觀察菌落的生長情況，包括菌落形狀、大小、顏色、光澤、隆起情況、透明度、邊緣整齊度等.并在鮮血瓊脂平板上劃線，觀察菌株是否有溶血性.并挑單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌類型及細(xì)菌形態(tài).

1.2.2 芽孢桿菌的鑒定 在平板上選擇形態(tài)不同的單個(gè)菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基.用特異性引物對菌液初步進(jìn)行PCR鑒定，引物見表1.PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，檢測目的條帶.以菌液為模板，用TaqDNA聚合酶，細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1.對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的條帶的樣送至擎科生物進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析.

1.2.3 耐酸和耐膽鹽試驗(yàn) 對分離鑒定出的地衣芽孢桿菌進(jìn)行耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)的篩選.

1.2.3.1 耐酸試驗(yàn) 取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，分別加入到9 mL pH為2.0、3.0、4.0的LB培養(yǎng)基中，以未經(jīng)過酸處理的菌液作為對照，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 h，梯度稀釋后涂平板， 37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率，篩選耐酸能力強(qiáng)的菌株

存活率=經(jīng)酸處理平板菌落計(jì)數(shù)÷未經(jīng)酸處理菌液平板菌落計(jì)數(shù)

1.2.3.2 耐膽鹽試驗(yàn) 選1.2.3.1中耐酸能力強(qiáng)的菌株， 取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液分別加入到9 mL的膽鹽濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，梯度稀釋后平板涂布，培養(yǎng)24 h進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，同上試驗(yàn)方法計(jì)算菌株存活率.

1.2.4 生化試驗(yàn) 復(fù)蘇菌株，平板劃線于鮮血瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后挑單個(gè)菌落稀釋于麥?zhǔn)媳葷峁苤?，插入芽孢桿菌生化卡，用VITEK 2微生物鑒定系統(tǒng)鑒定.

1.2.5 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測 復(fù)蘇菌株，同1.2.4處理菌液，插入藥敏卡，用VITEK2微生物鑒定系統(tǒng)鑒定.分析結(jié)果，用藥敏紙片法進(jìn)一步對耐藥的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.用特異性引物鑒定菌株是否攜帶耐藥基因，引物見表1.

1.2.6 產(chǎn)水解酶試驗(yàn)

1.2.6.1 產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn) 挑單個(gè)菌落點(diǎn)種于淀粉培養(yǎng)基，每個(gè)平板點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，一個(gè)用水做對照，37 ℃培養(yǎng)24 h，用碘液染5 min，測量菌落及透明圈直徑.

1.2.6.2 產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn) 挑單個(gè)菌落點(diǎn)種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板， 37 ℃培養(yǎng)24 h，用0.2%剛果紅染液染30 min，用0.1 mol NaCl洗5 min，測量菌落及透明圈直徑.

1.2.6.3 產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn) 同上挑單個(gè)菌落點(diǎn)種干酪素培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量菌落及透明圈直徑[18].

1.2.7 體外抑菌試驗(yàn) 以金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，沙門氏菌作為指示菌，用牛津杯法篩選6株地衣芽孢桿菌中對常見致病菌有抑制能力的菌株.配制LB瓊脂，待培養(yǎng)基冷卻，加入100 μL指示菌，搖勻后倒平板，在牛津杯中加入地衣芽孢桿菌400 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，篩選有抑菌能力的菌株[19].

1.2.8 耐高溫試驗(yàn) 分別取5 mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于70、75、80、85、90、95、100 ℃水浴中處理10 min，處理完畢待樣品冷卻后，取100 μL進(jìn)行平板涂布，將未進(jìn)行高溫水浴處理的菌液作為對照，培養(yǎng)24 h后平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株存活率.

1.2.9 對小鼠影響試驗(yàn) 選擇30～40 g(6～8周齡)昆明小鼠進(jìn)行試驗(yàn).將14只小鼠隨機(jī)分成2組，為對照組和試驗(yàn)組，每組7只.每組每只小鼠分別灌服200 μL無菌LB液體培養(yǎng)基和200 μL的OD為0.8的地衣芽孢桿菌WBL009菌液.連續(xù)灌胃21 d，觀察并記錄小鼠活動量、增質(zhì)量、有無腹瀉等.飼喂結(jié)束后，將各組小鼠摘眼球采血法采血并處死，解剖小鼠取脾臟和胸腺，稱質(zhì)量并記錄，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù).解剖觀察各組小鼠內(nèi)臟器官是否有肉眼可見的病理變化[20].

器官指數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

2.1.1 芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)特征及鑒定結(jié)果 本試驗(yàn)共分離出64株芽孢桿菌，其中地衣芽孢桿菌26株，枯草芽孢桿菌9株，解淀粉芽孢桿菌8株、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌6株、貝萊斯芽孢桿菌5株、沙福芽孢桿菌4株、短小芽孢桿菌3株、高地芽孢桿菌2株、蘇云金芽孢桿菌1株等，具體結(jié)果見表2.

表2 芽孢桿菌形態(tài)特征及鑒定結(jié)果

2.1.2 培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)特征 地衣芽孢桿菌在葡萄糖胰蛋白胨培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)24 h形成2～3 mm大小的白色菌落，邊緣不整齊，表面不光滑，有褶皺.在LB液體培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)24 h在培養(yǎng)基表面形成一層白色薄膜.在鮮血瓊脂平板上生長良好，無溶血現(xiàn)象.

2.1.3 特異性引物PCR鑒定 用地衣芽孢桿菌特異性引物PCR鑒定結(jié)果顯示，有大小約 1 287 bp的目的條帶，初步判斷該菌株為地衣芽孢桿菌.

圖1 地衣芽孢桿菌菌落及革蘭氏染色鏡檢1000×

M：DL2000 Marker;1～6:WBL001、WBL002、WBL005、WBL009、WBL010、WBL014 ;-：陰性對照.

2.1.4 16s rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小均在1 500 bp左右，測序后在NCBI網(wǎng)站比對核苷酸序列，分析結(jié)果.比較并分析同源性較高的序列，構(gòu)建分離出的地衣芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹.

圖3 地衣芽孢桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)

2.2.1 耐酸試驗(yàn) 通過將26株地衣芽孢桿菌在pH 2.0、2.5、3.0處理2 h后，計(jì)算存活率，發(fā)現(xiàn)僅有6株仍能存活.此6株菌的耐酸能力差異較大.菌株WBL009在pH 2.0處理2 h后，仍能存活，存活率為35.8%，耐酸能力較強(qiáng).

2.2.2 耐膽鹽試驗(yàn) 計(jì)算6株耐酸能力強(qiáng)的菌株在不同濃度膽鹽處理后的存活率，6株菌株的耐膽鹽能力不同.其中菌株WBL009耐膽鹽能力最強(qiáng)，在0.3%膽鹽培養(yǎng)基中處理12 h的存活率為51.6%.

2.3 生化試驗(yàn)

根據(jù)VITEK2系統(tǒng)的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，93%的鑒定概率為地衣芽孢桿菌.

表3 生化試驗(yàn)結(jié)果

縮寫與中文名稱Abbreviations and Chinese and English names：

AGAL：α-半乳糖苷酶 α-galactosidase ；AGLU：α-葡萄糖苷酶 α-glucosidase；AMAN：α-甘露糖苷酶 α-mannosidase；APPA：丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶 Alanine-phenylalanine-proline arylaminase；APS：過硫酸銨 Ammonium persulfate；AspA：L-天冬氨酸芳胺酶 L-aspartic acid arylaminase；BalaA：丙氨酸芳胺酶 Alanine arylamine enzyme；BGAL：β-半乳糖苷酶 β-galactosidase ；BGLU：β-葡萄糖苷酶 β-glucosidase；BMAN：β-甘露糖苷酶 β-mannosidase；BNAG：N-乙酰-β-D-葡萄糖氨酶 N-acetyl-β-D-glucosaminase；BXYL：β-木糖苷酶 β- xylosidase；CDEX：環(huán)糊精 cyclodextrin；Cleocin：氯林霉素 Clidamycin Hydrochloride；dGAL：D-半乳糖 D-galactose；dGLU：D-葡萄糖 D-glucose；dMAN：D-甘露醇 D-mannitol；dMLZ：D-松三糖 D-three sugar pine；dMNE：D-甘露糖 D-mannose；dRIB：D-核糖 D-ribose；dTAG：D-塔格糖 D-tager sugar；dTRE：D-海藻糖 D-trehalose；ESC：七葉靈水解 D-mannitol；GlyA：氨基酸芳胺酶 L-aspartic acid arylaminase；GLYG：糖元 Glycogen；INO：肌醇 Inositol；INU：菊粉 Inulin；IRHA：L-鼠李糖 L-rhamnose；KAN：卡那霉素耐受 Kanamycin tolerance；LeuA：亮氨酸芳胺酶 Leucine arylaminase；LysA：L-賴氨酸芳胺酶 L-lysine arylaminase；MdG：甲基葡萄糖甙酸化 Methylglucoside acidification；MdX：甲基-D-木糖苷 Methyl-D-xyloside；MTE：麥芽三糖 L-lysine arylaminase；NaCI 6.5%：6.5%氯化鈉生長 6.5% NaCl growth；NAG：N-乙酰-D-葡萄糖氨 N-acetyl-D-glucosamine；OLD：竹桃霉素耐受 Tolerance to dodomycin；PHC：磷?；S生素 Phosphoacyl vitamins；PheA：苯丙氨酸芳胺酶 Phenylalanine arylaminase；PLE：古老糖 Old sugar；POLYB_R：多粘菌素B耐受 D-three sugar pine；ProA：脯氨酸芳胺酶 Proline arylaminase；PSCNa：腐胺同化 Putrescine assimilation；PVATE：丙酮酸鹽 Pyruvic acid salt；PyrA：吡咯烷基芳胺酶 Pyrrolidylarylaminase；TTZ：多粘菌素B耐藥 D-mannose；TyrA：酪氨酸芳胺酶 Tyrosine arylaminase.

2.4 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，6株地衣芽孢桿菌對大多數(shù)抗生素均敏感，但均對氯林霉素耐藥.結(jié)果見表4.

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過特異性引物對地衣芽孢桿菌潛在耐藥基因進(jìn)行檢測，引物見表1.對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，其中ermC基因有目的條帶，speG和ereAB無條帶.說明介導(dǎo)6株地衣芽孢桿菌氯林霉素耐藥的原因是攜帶了ermC耐藥基因.

2.5 產(chǎn)水解酶試驗(yàn)

根據(jù)產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，6株地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶能力不同，其中菌株WBL009能產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶，產(chǎn)蛋白酶結(jié)果不明顯.

M：WBL2000 Marker;1～6:WBL001、WBL002、WBL005、WBL009、WBL010、WBL014 ;-：陰性對照.

2.6 體外抑菌試驗(yàn)

由地衣芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌及大腸桿菌的體外抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有菌株WBL009對金黃色葡萄球菌有抑制作用，抑菌環(huán)直徑為10.75 mm,其他菌株均無明顯抑菌效果.

2.7 耐高溫試驗(yàn)

將菌株WBL009培養(yǎng)12 h的菌液經(jīng)不同溫度處理10 min后，稀釋涂布計(jì)數(shù)，在不同溫度下的存活率見表5.

A:菌株WBL009產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn);B:菌株WBL009產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn).

圖6 菌株WBL009體外抑菌試驗(yàn)

表5 菌株WBL009的耐高溫存活率

圖7 耐高溫存活率曲線

2.8 對小鼠影響試驗(yàn)

通過用菌株WBL009連續(xù)21 d飼喂小鼠，對照組和試驗(yàn)組小鼠均無不良反應(yīng)，精神正常，無腹瀉情況和中毒癥狀.解剖后肉眼觀察小鼠內(nèi)臟器官正常，分析器官指數(shù)，發(fā)現(xiàn)該菌對小鼠胸腺(P<0.01)和脾臟(P<0.05)的發(fā)育有促進(jìn)作用，且對小鼠體質(zhì)量增長有顯著提高作用(P<0.01).

3 討論

研究表明，在動物飼料中添加適當(dāng)比例的微生態(tài)制劑，可產(chǎn)生大量寡肽、谷氨酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，且能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶等多種水解酶，具有調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，提高動物生長性能，降低料肉比，提高動物機(jī)體免疫力，減少疾病的發(fā)生等功效[21].

A:小鼠胸腺指數(shù);B:小鼠肝臟指數(shù);C:小鼠脾臟指數(shù);D:小鼠腎臟指數(shù);E:小鼠灌胃21d體質(zhì)量增長.

因?yàn)橐紤]微生態(tài)制劑的工業(yè)生產(chǎn)加工及其在動物胃內(nèi)及腸道內(nèi)的耐受能力，需篩選出能耐受低pH，耐受膽鹽及高溫條件的菌株.本試驗(yàn)中篩選的地衣芽孢桿菌WBL009在pH值為2.5時(shí)的人工胃液中處理2 h 后存活率為35.8%，在膽鹽濃度為0.3%處理12 h后存活率為51.6%，說明其具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力.藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，地衣芽孢桿菌對克林霉素有一定的耐受性，而對于絕大多數(shù)的藥物是敏感的，耐藥基因篩查發(fā)現(xiàn)，ermC是導(dǎo)致地衣芽孢桿菌對克林霉素耐藥的主要原因.在使用益生菌時(shí)，應(yīng)避免與其敏感的抗生素同時(shí)使用，這也是保證益生菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵一步.根據(jù)Jeong等[16]的研究報(bào)道，證實(shí)ermC是地衣芽孢桿菌和副地衣芽孢桿菌對紅霉素和克林霉素交叉耐藥的主要原因，ereAB主要發(fā)揮對紅霉素的抗性作用，speG則主要發(fā)揮對克林霉素的抗性作用.表明芽孢桿菌對克林霉素的耐藥性是一種固有的特性，這種特性可以通過缺失耐藥基因的結(jié)構(gòu)基因或啟動子而喪失，因此在機(jī)體內(nèi)發(fā)生耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的概率較低，作為益生菌相對安全.

金黃色葡萄球菌作為引起機(jī)體各類感染的最常見病原菌之一，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)又是超級耐藥菌，在世界范圍內(nèi)引起巨大危害.益生菌在腸道內(nèi)通過減少病原菌的腸道定植、限制炎癥反應(yīng)和加強(qiáng)腸道屏障來預(yù)防性地抑制病原菌感染[23].近年來相關(guān)的報(bào)道主要為凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，本研究篩選的地衣芽孢桿菌WBL009對金黃色葡萄球菌有抑制作用，可作為益生菌控制耐藥菌，為后期試驗(yàn)提供研究基礎(chǔ).

通過用菌株WBL009連續(xù)21 d飼喂小鼠，分析體質(zhì)量和免疫器官變化發(fā)現(xiàn)，該菌對小鼠體質(zhì)量增長有顯著提高作用，且對免疫器官的發(fā)育有促進(jìn)作用.免疫器官的生長發(fā)育和成熟依賴于抗原的刺激；芽孢桿菌的菌體成分如胞壁糖、肽聚糖、多肽和蛋白質(zhì)等，可以作為抗原刺激腸道或以免疫佐劑的形式作用于動物免疫器官，直接促進(jìn)免疫器官的生長發(fā)育[22].

綜上所述，本研究中篩選出的1株具有較強(qiáng)抗逆性、有產(chǎn)水解酶能力，且對金黃色葡萄球菌有抑制作用的地衣芽孢桿菌WBL009具有良好的體外益生性能.后期將對該菌株的抗菌物質(zhì)成分、該菌在動物體內(nèi)的益生性能、對動物機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力等進(jìn)行下一步研究，為其作為益生菌的候選菌株應(yīng)用于微生態(tài)制劑的生產(chǎn)提供依據(jù)和材料.