燕文明，溫茂增，麻 林，聶小保，陳 翔，吳挺峰

(1.河海大學水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，江蘇 南京 210098；2.湖南省水利廳，湖南 長沙 410007；3.長沙理工大學水利工程學院，湖南 長沙 410007；4.中國科學院南京地理與湖泊研究所，江蘇 南京 210008)

氨氧化細菌(Ammonia-OxidizingBacteria，AOB)是氨氧化反應的主要承擔者之一，廣泛分布于土壤、湖泊及海洋等環(huán)境中[1]。研究發(fā)現(xiàn)的AOB大多屬于β-Proteobacteria亞綱和γ-Proteobacteria亞綱，β-Proteobacteria分為亞硝化螺菌群(Nitrosospira)和亞硝化單胞菌群(Nitrosomonas)，多存在于非海洋生境中，而γ-Proteobacteria亞綱多見于陸地、海洋生境中[2]。目前，學者們已經(jīng)開展了大量以AOB為主題的研究工作，Horz等[3]發(fā)現(xiàn)AOB會因溫度、降水量等環(huán)境因子的改變產(chǎn)生明顯的響應；Ruben等[4]發(fā)現(xiàn)城鎮(zhèn)河流岸邊與水體中AOB的群落組成相似；Garnier等[5]對塞納河水體中的AOB優(yōu)勢種群進行分析，并研究了AOB豐度對環(huán)境變化產(chǎn)生的響應?？梢姡瑖@某區(qū)域中AOB影響因素和群落特征的研究已較為深入，而不同來源污染物對AOB群落分布特征影響方面的研究相對較少。AOB在地球氮素循環(huán)中扮演著重要的角色[6]。本文選取淮河流域里下河地區(qū)淺水湖泊作為研究對象，識別不同污染類型的表層底泥中AOB群落的特征，解析AOB豐度和分布對硝酸鹽外源輸入的響應，研究成果可為沉積物氮素分布特征和遷移轉(zhuǎn)化研究提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 研究區(qū)概況和沉積物采集

淮河流域里下河地區(qū)湖蕩眾多，近年來受人類活動的影響，水體污染狀況加劇，自凈功能減弱[7]。樣品采集時間為初秋季節(jié)，采樣點分別為得勝湖中心(DS)、九龍口東北入湖口(JLK)、大縱湖北部(DZ1)以及大縱湖中心(DZ2)(圖1)，平均水深分別為3.5 m、1.5 m、2.1 m和1 m，各采樣點受人類活動影響的程度差別較大，污染物來源各不相同。得勝湖周邊有化肥廠與采砂場，湖區(qū)有圍網(wǎng)養(yǎng)殖；九龍口剛疏浚，上游存在漁畜禽類養(yǎng)殖區(qū)；大縱湖北部圍網(wǎng)養(yǎng)殖密集，湖心水生植物繁密。使用抓斗式采樣器采集表層10 cm左右的沉積物，速凍后運回實驗室用于DNA提取和理化性質(zhì)測定。

圖1 研究區(qū)采樣點布設與位置Fig.1 Arrangement and location of sampling points in the study area

1.2 上覆水理化性質(zhì)測定

1.3 沉積物相關指標測定

1.4 DNA提取、PCR擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析

將凍干過篩后的0.5g沉積物進行DNA提取和純化，經(jīng)70%乙醇與TE溶液處理后體積為50 μL，-20℃保存。重復3次，合并稀釋后作為模板進行25 μL體系擴增。采用特異性引物amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) 和amoA-2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[11]進行amoA基因擴增。參照文獻[12]克隆與測序，最后獲得AOB核酸序列登錄號為KM516473- KM516706。使用DOTUR軟件選取代表性序列，在GenBank中比對最相似序列，再選取參照序列，用ClustalX 1.8、Jukes-Cantor模型、MEGA 5.0進行序列比對、計算距離和檢驗對比，通過Kimura 2 參數(shù)矩陣的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，并評估進化樹的可靠性，自舉值為1 000次。

1.5 多樣性分析方法

通過 DOTUR軟件計算克隆文庫覆蓋率(C)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)、Sace豐度指數(shù)以及Chao1豐度指數(shù)。Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數(shù)反映群落結構的復雜程度，Sace豐度指數(shù)和Chao1豐度指數(shù)表示種類豐富程度。

C=[1-(n1/N)]×100%

(1)

式中：n1——分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)數(shù)目；N——相應克隆庫的總克隆數(shù)量[14]。

1.6 反硝化同位素測定方法

菌種為致金色假單胞菌(P.aureofaciens)，編號NRRLB-1578。將復活復壯的菌株接種到胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基，濃縮后倒入頂空瓶，用高純N2吹出N2O，加入蒸餾水，攪拌、震蕩、離心，用氣密性注射器將離心后的上清液注入帶有濃縮菌的頂空瓶中，倒置放入恒溫箱30℃過夜培養(yǎng)。第2天注入NaOH溶解培養(yǎng)產(chǎn)生CO2。用帶有預濃縮裝置和氣相色譜儀的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(MAT-253，Thermo，美國)分析N2O中的δ15N[15]。

2 結果與討論

2.1 基本理化性質(zhì)

表1 各采樣點基本理化指標

2.2 沉積物-水界面的氮素分布特征

2.2.1 間隙水中TN和可交換態(tài)氮的垂向分布特征

圖2 間隙水TN和可交換態(tài)氮的垂向分布特征Fig.2 Vertical distribution characteristics of TN and exchangeable nitrogen in interstitial water

2.2.2 沉積物中TN和可交換態(tài)氮的垂向分布特征

圖3 沉積物中TN和可交換態(tài)氮的垂向分布Fig.3 Vertical distribution of TN and exchangeable nitrogen in sediments

2.3 amoA基因多樣性分析

利用細菌特異性PCR引物來擴增AOB的amoA基因，獲得491 bp的擴增產(chǎn)物。在挑出的240個克隆序列中，成功測定了235個，DS、JLK、DZ1、DZ2的目的序列克隆數(shù)分別為59個、58個、59個、60個。將測序結果用ClustalX1.8和Dnadist軟件生成相似矩陣，用DOTUR軟件進行OTU劃分。根據(jù)式(1)計算的克隆文庫的覆蓋率大于75%(表 2)，包括了大多數(shù)的amoA基因的類型。通過表 2可知，DS的Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數(shù)大于其他采樣點；DZ1的AOB生物多樣性最低；DZ2與DZ1相比，多樣性指數(shù)與豐度指數(shù)均較高。

表2 AOB的amoA多樣性

2.4 amoA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

按95%同源性將沉積物中AOB的amoA基因克隆序列分為20個OTU，用Blast尋找參比序列，用MEGA5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，分為4個Cluster，共235個序列。Cluster 1、Cluster 2和Cluster 3聚類于亞硝化單胞菌屬，Cluster 4聚類于亞硝化螺菌屬。Cluster1中包含了68個序列，占28.9%，被分為7個OUT，分別從DS、JLK、DZ1、DZ2中分離得到21個、14個、2個和31個；參考序列來自長江口、廢棄的礦業(yè)池塘、沙質(zhì)河流沉積物和廢水處理系統(tǒng)中。Cluster 2中包含147個序列，占62.6%，被分為5個OUT，分別從DS、JLK、DZ1、DZ2中分離得到32個、39個、50個和26個；參考序列來自湖泊沉積物、河口沉積物、廢水處理系統(tǒng)。Cluster3中包含2個序列，僅占0.9%，被分為2個OUT；參考序列來源于廢水處理系統(tǒng)。Cluster 4中包含18個序列，占7.7%，被分為6個OUT，分別從DS、JLK、DZ1、DZ2中分離得到4個、6個、6個和2個。Cluster 4同時又可分為兩個亞Cluster，第一個亞Cluster有6個序列，來自DS、DZ2、JLK，分別有3個、1個和2個，參考序列來源于城市飲用水配送系統(tǒng)和長江口；另一個亞Cluster有12個序列，來自DS、DZ1、DZ2、JLK，分別有1個、6個、1個和4個，參考序列為城市飲用水配送系統(tǒng)和富營養(yǎng)化淡水沉積物。DS和DZ2中的AOB主要聚類于Cluster1和Cluster2；JLK和DZ1的AOB主要聚類于Cluster2。20個OUT代表序列與參考序列的基因片段在核苷酸水平上的同源性均為95%。在20個OTU中，聚類于Cluster1和Cluster2中的OTU1和OTU12能在所有樣品中找到，序列數(shù)量最多，分別為53個(22.6%)和122個(51.9%)。4個采樣點表層沉積物AOB都屬于β-Proteobacteria亞綱的亞硝化單胞菌群(占92.3%)和亞硝化螺菌群。亞硝化單胞菌屬共有217個克隆序列，占14個OTU；亞硝化螺菌屬只有18個序列，占6個OTU。

圖4 AOB的amoA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of amoA gene sequence of ammonia-oxidizing bacteria

2.5 AOB的分布與同位素溯源分析

Purkhold等[18]的研究指出，亞硝化螺菌屬易在低氨環(huán)境中有更優(yōu)的氨氧化功能，而亞硝化單胞菌屬通常在富含氨氮環(huán)境中有競爭優(yōu)勢；在235個amoA基因克隆序列中有217個序列屬于亞硝化單胞菌群，占92.3%，反映了氨氮污染程度較高的現(xiàn)狀。DZ2中AOB的Nitrosospira群落占該點總克隆序列的3.34%，δ15N為1.0%，結合該點沉水植物密集的狀況，認為硝酸鹽主要來源于植物的腐爛。DS、DZ1、JLK的Nitrosospira群落占各采樣點總克隆序列的比例是DZ2的2倍以上，分別為6.8%、10.4%和10.4%，氮同位素比值偏正(0.829%、0.569%和0.884%)。結合現(xiàn)場狀況，既有養(yǎng)殖污染匯入，又有農(nóng)業(yè)面源污染，導致了Nitrosospira群落較豐富，與已有研究存在共性[19-21]，即農(nóng)牧廢水濕地處理系統(tǒng)中AOB以Nitrosospira為主，而畜類糞便和沖洗水中以Nitrosomonas為主。DS中的AOB生物多樣性和豐度最高，可能與得勝湖AOB的來源較為復雜有關，硝酸鹽定源結果為混合型污染(氮同位素比值為0.829%)。

周邊環(huán)境的復雜性影響AOB的生物多樣性和相對豐度。DZ1的AOB生物多樣性和氮同位素比值低于DS、DZ2和JLK，可能與該采樣點受圍網(wǎng)養(yǎng)殖的直接影響較大有關，長期圍網(wǎng)養(yǎng)殖增加了人為污染源的注入量，降低了氮同位素比值，并造成該采樣點生物多樣性和相對豐度的降低?？梢姡粎^(qū)域擁有不同污染物來源的湖泊表層底泥中硝氮δ15N存在差異，長期的圍網(wǎng)養(yǎng)殖(DZ1)會導致δ15N降低(0.57%)、AOB的豐度和生物多樣性降低；腐爛植物(DZ2)的長期過度累積會導致δ15N增大(1.0%)，AOB的豐度和生物多樣性降低。

3 結 論

得勝湖、九龍口和大縱湖存在AOB，豐度最多的是亞硝化單胞菌屬(占92.3%)。DS、DZ1和JLK表層沉積物中亞硝化螺菌屬相對豐度是DZ2的2倍以上。環(huán)境與污染來源復雜的地方AOB的生物多樣性較高，得勝湖AOB生物多樣性和豐度最高，大縱湖入湖口的AOB生物多樣性最低。長期的圍網(wǎng)養(yǎng)殖增加了人為污染源的注入量，降低了氮同位素比值，降低了AOB的豐度和生物多樣性。