張 慧，閆夢真，張振凌，4，陳祎甜，劉 爽

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450046；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046；4.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046）

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，味苦、甘、酸，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功效，用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、腰膝酸痛、筋骨無力、淋證、水腫、頭痛眩暈、牙痛、口瘡、吐血、衄血[1]。具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、提高免疫力等藥理作用[2-6]。隨著中國工業(yè)的快速發(fā)展，中藥污染問題受到人們越來越多的關(guān)注，中藥中的重金屬、農(nóng)藥殘留、黃曲霉毒素等有害殘留物對人類健康的影響已受到國內(nèi)和國際上的普遍重視?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版）及《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[7]對鉛、鎘、砷、汞、銅等重金屬，農(nóng)藥殘留，黃曲霉毒素作出了限量規(guī)定。牛膝等級分類較為繁雜，但整體分類大致相同[8-9]，參考團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CACM 032.58－2017《中藥材商品規(guī)格等級牛膝》及市場調(diào)研，根據(jù)直徑大小將牛膝分為4個等級。一等：0.8 cm＜d；二等：0.6 cm＜d≤0.8 cm；三等：0.4 cm＜d≤0.6 cm；統(tǒng)貨；酒牛膝不分等級。查閱文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于牛膝不同等級飲片中有害殘留物差異的研究，《中華人民共和國藥典》2015年版未對牛膝不同等級飲片有害殘留物作出限量規(guī)定。因此，本研究對牛膝不同炮制方法不同商品等級中重金屬、農(nóng)藥殘留及黃曲霉毒素進(jìn)行測定，參考《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》及《中華人民共和國藥典》（2015年版）有關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價，比較牛膝不同等級飲片間、牛膝與酒牛膝間含量差異，探討有害殘留物在牛膝等級、不同炮制品間的分布規(guī)律，為牛膝不同等級飲片與酒牛膝質(zhì)量分級和質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（TSQ Quantis，賽默飛世爾科技有限公司）；氮吹儀（HSC-12A，天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Fisher）；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（iCAP-Qc，賽默飛世爾科技有限公司）；微波消解儀（TOPEX+，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；黃曲霉毒素免疫親和柱（AF1351-1812，Romer）；真空固相萃取裝置（Mediwax 12孔，北京科百特科技有限公司）。

1.2 試劑乙腈（默克，批號：JA073430）；甲醇（默克，批號：I0964207832）；無水硫酸鎂（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10418599）；乙二核基-N丙基（PSA，天津博納艾杰爾科技有限公司，批號：P19-00436）；甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20170110）；乙酸銨（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20171007）；純化水（一級水）；吡蟲琳（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所，批號：201904，純度為100%）；噁草酮（BePure，批號：B0004342，純度為98.00%）；乙酸乙酯（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20181124）；冰醋酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20170510）；氯化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20190504）；PSA粉末（優(yōu)級，艾杰爾菲諾美，批號：P19-00436）；C18粉末（優(yōu)級，艾杰爾菲諾美，批號：P19-00345）；硝酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2019052201）；過氧化氫（廣州化學(xué)試劑廠，批號：20180901-1）；ICP分析用標(biāo)準(zhǔn)溶液26元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（o2Si，批號：977657-4）；黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（Pribolab，批號：1100A25）。

1.3 樣品來源收集市場上牛膝不同等級與酒牛膝飲片共35批，均來源于河南道地產(chǎn)區(qū)，河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根經(jīng)炮制后的飲片，符合2015年版《中華人民共和國藥典》牛膝飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。樣品信息見表1。

表1 牛膝樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 方法重金屬含量測定參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部通則0412電感耦合等離子體質(zhì)譜法，《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部通則2321鉛、鎘、砷、汞、銅測定法進(jìn)行測定。吡蟲啉殘留量參照NY/T 1379-2007《蔬菜中334種農(nóng)藥多殘留的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》進(jìn)行測定；噁草酮?dú)埩袅繀⒄誈B 23200.113《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法》進(jìn)行測定。黃曲霉毒素殘留量參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部通則0431質(zhì)譜法、《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部通則2351黃曲霉毒素測定法進(jìn)行測定[10]。

2.2 結(jié)果牛膝與酒牛膝樣品中重金屬鎘、砷、銅含量分別為0.03～0.10、0.02～0.20、3.00～5.00 mg/kg，重金屬鉛、汞、農(nóng)藥殘留及黃曲霉毒素未檢出。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部通則2341農(nóng)藥殘留量測定法及中華人民共和國外經(jīng)貿(mào)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》對重金屬、農(nóng)藥及黃曲霉毒素殘留檢出限及限量規(guī)定：鉛≤5.0 mg/kg、鎘≤0.30 mg/kg、砷≤2.0 mg/kg、汞≤0.20 mg/kg、銅≤20.00 mg/kg、黃曲霉毒素B1≤5.00 μg/kg，吡蟲啉檢出限為0.005 mg/kg，噁草酮檢出限為0.05mg/kg，牛膝不同等級飲片與酒牛膝中重金屬、農(nóng)藥及黃曲霉毒素含量均符合相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。測定結(jié)果見表2～3。

表2 牛膝不同等級飲片與酒牛膝重金屬測定結(jié)果

表3 牛膝不同等級飲片與酒牛膝農(nóng)藥殘留及黃曲霉毒素測定結(jié)果

3 結(jié)果分析

3.1 牛膝不同等級飲片重金屬含量分析對20批牛膝不同等級飲片重金屬含量進(jìn)行分析，牛膝飲片重金屬鎘、砷、銅殘留水平見表4。結(jié)果表明，不同等級重金屬含量差異性較小，以牛膝不同等級飲片重金屬鎘、砷、銅平均值比較，鎘、砷含量由低到高為：一等＜二等≤統(tǒng)貨＜三等，銅含量由低到高為：統(tǒng)貨/三等＜二等＜一等。（見圖1）

表4 牛膝不同等級重金屬殘留水平

圖1 牛膝不同等級飲片重金屬平均含量

3.2 牛膝、酒牛膝重金屬含量分析根據(jù)結(jié)果，使用SIMCA 14.1軟件對牛膝和酒牛膝中重金屬鎘、砷、銅含量進(jìn)行PCA分析，用UV算法進(jìn)行特征縮放，調(diào)整主成分個數(shù)為3，使Q2大于0.5，得出三維散點(diǎn)圖（見圖2）。根據(jù)散點(diǎn)圖可將樣品分為兩類，即牛膝、酒牛膝，分類結(jié)果與樣品規(guī)格信息基本一致，以不同炮制品牛膝與酒牛膝重金屬鎘、砷、銅含量平均值比較，可知牛膝中鎘、砷、銅含量均低于酒牛膝。（見表5）

圖2 牛膝、酒牛膝PCA散點(diǎn)圖

表5 牛膝飲片與酒牛膝重金屬平均含量

4 討 論

不同等級牛膝飲片中多種化學(xué)成分含量有差異，但其有害殘留物是否也因等級不同有差別尚未可知。本研究對牛膝不同等級不同炮制品中的重金屬、農(nóng)藥殘留、黃曲霉毒素進(jìn)行測定，比較牛膝不同等級不同炮制品間含量差異，探討牛膝不同炮制方法及不同商品等級飲片中有害殘留物的分布規(guī)律。

重金屬是指相對密度在4.5 g/cm3以上的金屬，在人體中累積達(dá)到一定程度，會造成慢性中毒，嚴(yán)重影響人們的身體健康。重金屬在水中不能被分解，人飲用后毒性放大，與水中的其他毒素結(jié)合生成毒性更大的有機(jī)物或無機(jī)物，影響人體健康。生長發(fā)育期兒童體內(nèi)含有過多的鉛可導(dǎo)致智力水平降低、學(xué)習(xí)記憶功能損害、精細(xì)技巧障礙等一系列神經(jīng)系統(tǒng)的損害[11]；鎘位列“五毒”（銅、汞、砷、鎘、鉛）之首,是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)[12]，具有腎毒性，肝毒性[13]，內(nèi)分泌和生殖毒性等[14]。砷暴露造成大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷[15]；汞具有神經(jīng)毒性[16]，可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡；銅是人體必需的微量元素，是人體中多種酶的組成部分，參與人體的造血過程及鐵的代謝，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生殖機(jī)能、防御機(jī)能、精神智力活動和激素代謝等，銅參與黑色素的形成，缺銅可致毛發(fā)脫色甚至成為白化病[17]。本研究所用牛膝均為合格飲片，服用不會對人體產(chǎn)生不良影響，一等飲片中鎘、砷等有害元素含量最低，銅含量最高，質(zhì)量相對較好，臨床上可使用優(yōu)等飲片，既能發(fā)揮藥效又能適量補(bǔ)充銅元素增強(qiáng)人體防御機(jī)能。

本次測定牛膝飲片與酒牛膝均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，對鎘、砷和銅進(jìn)行分析，牛膝不同等級飲片中鎘、砷含量由低到高為：一等＜二等≤統(tǒng)貨＜三等，銅含量由低到高為：統(tǒng)貨/三等＜二等＜一等；牛膝中鎘、砷、銅含量均低于酒牛膝。牛膝不同等級飲片及不同炮制品中重金屬含量差異較小，重金屬鎘、砷主要分布于低等級飲片中，其原因可能因為低等級飲片多來源于直徑較細(xì)的牛膝藥材，表皮與土壤等環(huán)境接觸面積較大，吸收重金屬的機(jī)會較多。另外，本研究所用牛膝均為道地藥材，李金亭等[18]研究表明道地牛膝對銅的富集能力較強(qiáng)，這可能與牛膝中化學(xué)成分對重金屬結(jié)合能力不同導(dǎo)致的，銅含量越高結(jié)合能力越強(qiáng)，而對鎘、砷的結(jié)合能力則相反，牛膝對銅的結(jié)合吸收作用較鎘、砷強(qiáng)，也可能與土壤中的重金屬有關(guān)，牛膝種植過程中可通過調(diào)節(jié)土壤環(huán)境控制牛膝質(zhì)量。通過不同炮制品之間的對比，炮制過程可能導(dǎo)致重金屬含量出現(xiàn)差異，在黃酒生產(chǎn)過程中原料、設(shè)備等均可能引入重金屬，黃酒中含有鎘、砷、銅等金屬元素，可能導(dǎo)致酒牛膝中重金屬含量增加，另外，酒牛膝炮制過程中需加熱炒制，水分流失，也可導(dǎo)致重金屬含量相對增加。

牛膝是多年生草本藥用植物，在種植過程中雜草較多且易感染多種病蟲害，需用農(nóng)藥進(jìn)行噴灑除去雜草和害蟲。吡蟲啉是煙堿類超高效殺蟲劑，噁草酮為我國東北地區(qū)水、旱田作物主打除草劑品種[19]。黃曲霉毒素對人及動物肝臟組織有破壞作用，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡[20]。牛膝在種植、運(yùn)輸、生產(chǎn)、加工、儲存等的過程中由于操作不當(dāng)可能會出現(xiàn)發(fā)霉變質(zhì)的現(xiàn)象，產(chǎn)生生物毒素。本研究所用牛膝飲片來源于道地產(chǎn)區(qū)，進(jìn)行規(guī)范化種植、采收、加工等，結(jié)果未檢測出農(nóng)藥及黃曲霉毒素殘留量，說明飲片質(zhì)量較好。

牛膝不同等級飲片、不同炮制品中有害殘留物含量存在差異，2015年版《中華人民共和國藥典》未對牛膝等級進(jìn)行劃分，不同炮制方法不同商品等級飲片有害殘留物含量未做限量規(guī)定，本研究可為牛膝飲片質(zhì)量分級和質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。