張舒婷，吳凡偉

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市寶安中醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.深圳寶安區(qū)中醫(yī)院（集團），廣東 深圳 518101）

腫瘤嚴(yán)重危害人類的健康，西醫(yī)對于腫瘤的治療手段主要是手術(shù)治療、放療、化療。但對于大多數(shù)患者而言，發(fā)現(xiàn)腫瘤的時候已經(jīng)是晚期，錯失了手術(shù)的機會，此時化療是治療惡性腫瘤常用的一種措施，惡性腫瘤患者因腫瘤大量消耗機體營養(yǎng)而致使代謝紊亂，表現(xiàn)出體質(zhì)量下降、缺乏食欲等癥狀，化療則會加重上述癥狀[1]。而放療不僅能殺傷癌細(xì)胞，也能破壞機體的內(nèi)分泌和免疫功能，致使患者多方面功能下降[2]。中醫(yī)學(xué)作為中華民族幾千年的健康養(yǎng)生理念及其實踐經(jīng)驗的凝聚，在惡性腫瘤的治療中起著不可替代的作用[3]。中醫(yī)藥不僅可抑癌抗癌，同時可以改善放療、化療后的副作用及并發(fā)癥。腫瘤的病因病機可總結(jié)為正氣內(nèi)虛、感受外邪、情志內(nèi)傷、飲食勞倦、年老體弱等，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，氣滯、血瘀、痰凝、熱毒等病理產(chǎn)物搏結(jié)于臟腑，失治、誤治，日久成巖?！稘健吩疲骸胺e者，生于五臟六腑之陰氣也……此由陰陽不和，臟腑虛弱，風(fēng)邪搏之，所以為積……”。《素問·骨空論篇》云：“風(fēng)者，百病之始也?！薄兜は姆āぬ怠吩疲骸胺踩松砩?、中、下有塊者,多是痰。”痰作為癌癥的主要致病因素，由濕而聚、釀斂而成，風(fēng)能升痰，痰隨風(fēng)動，臨床又稱風(fēng)痰[4]。風(fēng)痰入里可成瘤，治療可選用祛風(fēng)痰之藥物。

貓眼草（Euphorbia esula L.）是大戟科大戟屬植物，在我國主產(chǎn)于東北及內(nèi)蒙古、河北、陜西、山東、江蘇等省，別名貓兒眼、打碗花。貓眼草是中國傳統(tǒng)中草藥之一，具有祛痰止咳作用，而民間很早就有貓眼草治療食管癌、子宮囊腫的相關(guān)報道[5-6]。據(jù)相關(guān)報道，貓眼草提取物能抑制腫瘤細(xì)胞生長[7]。為了進一步研究中醫(yī)利用貓眼草抗癌的物質(zhì)基礎(chǔ)并尋找可能的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性成分，筆者對貓眼草干燥全草進行了系統(tǒng)化學(xué)成分分離及活性研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器全自動旋光儀（Anton-Paar MCP 200）；核磁共振儀（Bruker AV-400-III和Bruker AV-500-III）；低分辨質(zhì)譜儀（Agilent 1200 series LC-MS/MS system）；高分辨質(zhì)譜儀（Shimadzu LCMS-IT-TOF）；

1.2 材料反相材料RP-C18（默克公司）；MCI-gel CHP-20P（三菱化學(xué)公司）；硅膠（青島海洋化工廠）；凝膠材料Sephadex LH-20（GE保健生物科學(xué)）；顯色劑（5%硫酸乙醇溶液，5%香草醛濃硫酸溶液）；半制備C18柱（Agilent SB-C18column 250×9.4 mm，5 mm）；有機溶劑（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；RPIM-1640（Gibco）；10%胎牛血清（Gibco）；MTT（Sigma）；順鉑（Sigma）。HONE-1細(xì)胞（未分化型人鼻咽癌細(xì)胞）來自中山大學(xué)腫瘤防治中心；MCF-7細(xì)胞（人乳腺癌細(xì)胞）來自中山大學(xué)微生物與生化制藥研究室；MGC-803（人胃癌細(xì)胞）來自美國保藏中心（ATCC）。貓眼草（采于河南省漯河市），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市寶安中醫(yī)院吳凡偉副教授鑒定為大戟科大戟屬植物貓眼草（Euphorbia esula L.）全草。

2 提取與分離

將干燥的貓眼草的全草（2 kg）粉末用95%的乙醇（3×30 L）室溫下浸提3次。所得浸提液合并減壓濃縮后得其浸膏50 g，將浸膏混懸于水中，再用乙酸乙酯萃取，濃縮后得到乙酸乙酯部分浸膏15 g。經(jīng)硅膠柱色譜（100～200目），石油醚-乙酸乙酯（30∶1、9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1:1和1∶0，v/v）梯度洗脫，分離得到4個組分（Fr.A～Fr.D）。Fr.C（3 g）經(jīng)RP-C18柱（甲醇-水，40%～90%，v/v）得到3個組分（Fr.C1～Fr.C3）。Fr.C1通過HPLC（70%MeCN in H2O，2.0 mL/min）分離得到化合物1（15 mg）和2（10 mg）。Fr.C2通過HPLC（65% MeCN in H2O，2.0 mL/min）分離得到化合物3（10 mg）。Fr.D部分（3 g）經(jīng)由RP-C18柱（甲醇-水，30%～100%，v/v）得到兩個組分（Fr.D1～Fr.D2）。Fr.D1部分（1 g）經(jīng)膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯洗脫，得化合物4（15 mg）。Fr.D2在Sephadex LH-20柱通過3個部分并用HPLC進行處理分離到化合物5（10 mg）和6（10 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色固體，10%硫酸乙醇溶液顯色呈棕黃色，C38H42O12，ESI-MS：m/z 690[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH 7.64（4H，dd，J=11.1，7.8 Hz，OBz），7.31（1H，t，J=7.4 Hz，OBz），7.19（1H，t，J=7.4 Hz，OBz），7.11（2H，t，J=7.7 Hz，OBz），7.01（2H，t，J=7.6 Hz，OBz），6.05（1H，s，H-17b），6.03（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），6.00（1H，d，J=16.0 Hz，H-11），5.86（1H，dd，J=16.0，9.5 Hz，H-12），5.96（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），5.74（1H，s，H-17a），5.43（1H，dd，J=4.0，1.0 Hz，H-3），4.85（1H，d，J=9.5 Hz，H-8），4.34（1H，m，H-13），3.70（1H，dd，J=8.8，4.0 Hz，H-4），2.93（1H，d，J=16.5 Hz，H-1a），2.46（1H，d，J=16.5 Hz，H-1b），2.13（3H，s，15-OAc），1.94（3H，s，3-OAc），1.37（3H，d，J=6.6 Hz，H-20），1.34（3H，d，H-19），1.23（3H，s，H-18）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC 211.0（s，C-9），205.0（s，C-14），169.3（s，3-OAc），166.1（s，5-OBz），165.0（s，7-OBz），135.8（s，C-6），134.7（d，C-11），134.6（d，C-12），132.7×2（d，OBz），129.9×2（d，OBz），129.5×2（d，OBz），129.0（s，OBz），129.0（s，OBz），127.8×2（d，OBz），127.7×2（d，OBz），123.9（t，C-17），90.8（s，C-15），80.3（d，C-3），79.0（s，C-2），72.4（d，C-8），72.3（d，C-7），66.0（d，C-5），50.3（t，C-1），48.6（s，C-10），46.6（d，C-4），42.0（d，C-13），25.1（q，C-16），23.4（q，C-20），23.0（q，C-18），21.2（q，3-OAc），20.6（q，15-OAc），19.8（q，C-19）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物esulone A[8]一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為esulone A。（見圖1）

化合物2為白色固體，10%硫酸乙醇溶液顯色呈棕黃色，C40H44O12，ESI-MS：m/z 716[M+H]+；1H NMR（400×MHz，CDCl3）δH 7.62（2H，overlapped，OBz），7.61（2H，overlapped，OBz），7.23（1H，t，J=6.8 Hz，OBz），7.19（1H，t，J=6.8 Hz，OBz），7.12（2H，t，J=6.8 Hz，OBz），6.99（2H，t，J=6.8 Hz，OBz），6.22（1H，s，H-7），6.09（1H，d，J=5.5 Hz，H-5），5.98（1H，d，J=16.0 Hz，H-11），5.94（1H，d，J=15.8 Hz，H-12），5.74（1H，d，J=2.9 Hz，H-3），5.73（1H，s，H-17a），5.63（1H，s，H-8），5.42（1H，s，H-17b），3.55（1H，m，H-13），3.02（1H，dd，J=5.3，3.0 Hz，H-4），2.94（1H，dd，J=16.0，9.2 Hz，H-1a），2.42（1H，m，H-2），2.12（1H，overlapped，H-1b），2.09（3H，s，3-OAc），2.08（3H，s，15-OAc），1.93（3H，s，8-OAc），1.33（3H，s，H-18），1.43（3H，d，J=6.9 Hz，H-20），1.25（3H，s，H-19），1.03（1H，d，J=7.2 Hz，H-16）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC 206.3（s，C-9），205.1（s，C-14），171.8（s，15-OAc），171.2（s，3-OAc），171.1（s，8-OAc），164.8（s，5-OBz），164.2（s，7-OBz），138.7（s，C-6），136.3（d，C-11），135.6（d，C-12），132.9-129.0（5-OBz and 7-OBz），125.1（t，C-17），91.0（s，C-15），78.4（d，C-3），74.2（d，C-5），75.0（d，C-8），72.7（s，C-7），50.2（d，C-4），50.1（s，C-10），46.1（t，C-1），44.1（d，C-13），40.0（d，C-2），27.3（q，C-18），25.2（q，C-19），21.7（s，C-20），21.8（q，15-OAc），21.4（q，8-OAc），21.1（q，3-OAc），15.3（q，C-16）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物mesulones C[9]一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為mesulones C。（見圖1）

化合物3為白色固體，10%硫酸乙醇溶液顯色呈棕紅色，C40H44O14，ESI-MS：m/z 748[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH 7.70（2H，overlapped，OBz），7.70（2H，overlapped，OBz），7.33（1H，t，J=6.8 Hz，OBz），7.30（1H，t，J=6.8 Hz，OBz），7.20（2H，t，J=6.8 Hz，OBz），7.00（2H，t，J=6.8 Hz，OBz），6.22（1H，s，H-7），6.15（1H，d，J=16.0 Hz，H-11），5.93（1H，d，J=5.5 Hz，H-5），5.91（1H，d，J=15.8 Hz，H-12），5.54（1H，d，J=2.9 Hz，H-3），5.52（1H，s，H-17a），5.50（1H，s，H-8），5.49（1H，s，H-17b），4.93（1H，s，H-1），4.39（1H，m，H-13），3.66（1H，dd，J=10.0，5.0 Hz，H-4），2.16（3H，s，1-OAc），2.14（3H，s，3-OAc），1.93（3H，s，8-OAc），1.49（3H，s，H-20），1.38（3H，d，J=6.9 Hz，H-18），1.34（1H，d，J=6.5 Hz，H-16），1.27（3H，s，H-19）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC 211.3（s，C-14），205.1（s，C-9），170.8（s，1-OAc），170.0（s，3-OAc），170.0（s，8-OAc），165.8（s，5-OBz），164.9（s，7-OBz），137.7（s，C-6），136.5（d，C-11），133.6（d，C-12），133.0-127.8（5-OBz and 7-OBz），125.3（t，C-17），85.2（s，C-15），83.0（d，C-1），80.9（s，C-2），80.4（d，C-3），74.0（d，C-8），70.0（d，C-5），65.0（s，C-7），49.1（d，C-10），45.1（s，C-4），44.0（d，C-13），26.3（q，C-18），25.0（q，C-19），22.1（s，C-20），21.8（q，1-OAc），21.5（q，3-OAc），21.4（q，8-OAc），19.5（q，C-16）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物kanesulone B[10]一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為kanesulone B。（見圖1）

化合物4為白色固體粉末，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫紅色，C30H48O3，ESI-MS：m/z 463[M+Na]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH 3.26（1H，dd，J=11.4，4.2 Hz，H-3），1.10（3H，s，H-26），0.96（3H，s，H-25），0.96（3H，s，H-23），0.87（H，d，J=6.4 Hz，H-30），0.85（3H，s，H-24），0.81（3H，d，J=6.4 Hz，H-29），0.75 3H，s，H-27），0.73（3H，s，H-28）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC 35.0（t，C-1），27.6（t，C-2），78.3（d，C-3），39.0（s，C-4），47.4（d，C-5），36.7（t，C-6），198.6（t，C-7），139.9（s，C-8），165.5（d，C-9），39.6（s，C-10），21.1（t，C-11），29.8（t，C-12），37.1（d，C-13），40.4（s，C-14），25.9（t，C-15），36.2（t，C-16），42.8（d，C-17），51.8（s，C-18），20.5（t，C-19），28.3（t，C-20），59.9（d，C-21），30.9（s，C-22），27.3（q，C-23），16.1（q，C-24），19.0（q，C-25），21.8（q，C-26），15.1（q，C-27），14.7（q，C-28），23.1（q，C-29），22.2（t，C-30）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻[11]報道supinenolone E基本一致，故鑒定為supinenolone E。（見圖1）

化合物5為白色固體粉末，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫紅色，C32H50O3，ESI-MS：m/z505[M+Na]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH 4.53（1H，dd，J=10.0，6.7 Hz，H-3），2.41（1H，dd，J=12.5，11.3 Hz，H-6a），2.39（1H，dd，J=12.5，5.3 Hz，H-6b），2.07（3H，s，H-32），1.14（3H，s，H-26），1.01（3H，s，H-25），0.96（3H，s，H-24），0.88（3H，s，H-23），0.83（6H，m，H-29，30），0.76（6H，s，H-27，28）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC 34.7（t，C-1），24.1（t，C-2），80.0（d，C-3），37.9（s，C-4），47.6（d，C-5），36.5（t，C-6），198.2（s，C-7），140.0（s，C-8），165.2（s，C-9），39.5（s，C-10），21.1（t，C-11），29.7（t，C-12），37.1（s，C-13），40.5（s，C-14），25.9（t，C-15），36.2（t，C-16），42.8（s，C-17），51.8（d，C-18），20.6（t，C-19），28.3（t，C-20），60.0（d，C-21），30.9（d，C-22），27.3（q，C-23），16.2（q，C-24），19.1（q，C-25），21.8（q，C-26），16.1（q，C-27），14.7（q，C-28），23.1（q，C-29），22.2（q，C-30），171.0（s，C-31），21.4（q，C-32）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻[11]報道supinenolone E acetate基本一致，故鑒定為supinenolone E acetate。（見圖1）

化合物6為白色固體粉末，10%硫酸乙醇溶液顯色呈棕紅色，C30H50O2，ESI-MS：m/z 465[M+Na]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH 5.59（2H，m，H-23，24），3.29（1H，m，H-3），1.33（6H，s，H-26，27），0.98（6H，s，H-18，29），0.89（3H，s，H-28），0.87（3H，s，H-21），0.82（3H，s，H-30），0.56（1H，d，J=4.2Hz，H-19a），0.34（1H，d，J=4.2Hz，H-19b）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC32.1（t，C-1），30.5（t，C-2），79.0（d，C-3），40.6（s，C-4），47.2（d，C-5），21.2（t，C-6），26.1（t，C-7），48.1（d，C-8），20.1（s，C-9），26.2（s，C-10），26.6（t，C-11），32.9（t，C-12），45.4（s，C-13），49.0（s，C-14），35.7（t，C-15），28.2（t，C-16），52.1（s，C-17），18.2（q，C-18），30.0（t，C-19），36.5（d，C-20），18.4（q，C-21），39.2（t，C-22），125.7（d，C-23），139.5（d，C-24），70.9（s，C-25），30.5（q，C-26），30.0（q，C-27），25.5（q，C-28），14.1（q，C-29），19.4（q，C-30）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻[12]報道cycloart-（23Z）-ene-3β，25基本一致，故鑒定為cycloart-（23Z）-ene-3β，25。（見圖1）

圖1 化合物1-6的化學(xué)結(jié)構(gòu)

4 化合物的抑制癌細(xì)胞增殖活性篩選

4.1 實驗方法取HONE-1、MCF-7和MGC-803細(xì)胞，并用RPMI-1640、10%胎牛血清、1%的雙抗所配培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。96孔板（Biofil）種板前，對細(xì)胞計數(shù)，1 000個細(xì)胞每孔，每孔100 μL培養(yǎng)基，孵育1 d后，加藥，其中空白對照組為培養(yǎng)基，陰性對照組為不加藥處理的細(xì)胞，加順鉑處理作為陽性對照組。48 h后，加入用PBS配置好的5 mg/mL的MTT 20 μL處理4 h。再棄去培養(yǎng)基，每孔加入120 μL的DMSO，振蕩10 min，最后用酶標(biāo)儀測定其在492 nm處的OD值。根據(jù)OD值計算出各藥物濃度對細(xì)胞的抑制率，通過GraphPad Prism軟件，采用非線性回歸計算出各化合物的IC50值。

4.2 實驗內(nèi)容（1）抗癌活性評價：以順鉑作為陽性對照,采用MTT法[13-14]對貓眼草中分離得到的6個化合物，利用HONE-1、MCF-7和MGC-803細(xì)胞模型進行抗癌活性評價。（2）IC50測定：如下圖2所示，在10 μmol/L濃度下，化合物4、5和6抑制HONE-1和MCF-7細(xì)胞增殖率大于50%。因此，繼續(xù)對這3個化合物抑制細(xì)胞增殖的IC50進行測試。

圖2 貓眼草中分離化合物對HONE-1、MCF-7和MGC-803細(xì)胞的抑制活性

4.3 實驗結(jié)果活性測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物4、5和6具有明顯的抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖活性，化合物6具有明顯的抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖活性，其IC50值如表1所示。

表1 貓眼草中分離化合物對HONE-1和MCF-7細(xì)胞抑制活性的IC50值

5 小 結(jié)

本研究從中藥貓眼草的乙醇提物中分離鑒定了6個化合物，其中化合物1～3為jatrophane二萜，化合物4～6為三萜。對分離得到的所有的化合物進行了癌細(xì)胞毒活性測試，以評價其抗癌活性。發(fā)現(xiàn)了化合物4、5和6具有潛在抗鼻咽癌和乳腺癌活性（10 μmol/L時的抑制率大于50%），其中化合物6對HONE-1和MCF-7細(xì)胞抑制增殖活性分別為5.2 μmol/L和6.6 μmol/L。通過研究，發(fā)現(xiàn)中藥貓眼草發(fā)揮抗癌活性作用的可能為三萜類活性，初步闡明了貓眼草抗癌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。為探究中藥貓眼草在治療癌癥的作用及物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。