鄭 正，付 鵬

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

血府逐瘀膠囊源于清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》血府逐瘀湯[1]，是由11味中藥，即炒桃仁、紅花、赤芍、川芎、麩炒枳殼、柴胡、桔梗、當(dāng)歸、地黃、牛膝和甘草，在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，按照中藥劑型工藝制備而成的中藥復(fù)方制劑。該制劑具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，廣泛用于臨床上的瘀血內(nèi)阻所致胸痛、頭痛、失眠多夢、心悸怔忡、內(nèi)熱瞀悶、急躁善怒等癥[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，制劑中的芍藥苷通過調(diào)控L型電壓依賴型鈣通道顯著改善經(jīng)前煩躁障礙癥肝氣郁結(jié)大鼠的抑郁情緒，橙皮苷可通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和調(diào)控GR、NR2B的表達(dá)發(fā)揮抗抑郁作用[3-4]；柚皮苷能夠抑制關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠炎癥反應(yīng)從而對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用[5]；蕓香柚皮苷是一種具有抗過敏活性的黃酮類化合物[6]；新橙皮苷對糖脂代謝有一定的調(diào)節(jié)作用[7]；甘草苷能夠有效清除氧自由基，甘草酸對治療乙型肝炎病毒、艾滋病毒方面具有良好的效果[8-11]。該制劑的質(zhì)量易受藥材來源、等級、提取工藝等因素的影響而波動(dòng)，而目前《國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)》WS3-B3049-98對血府逐瘀膠囊的質(zhì)量控制為采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中芍藥苷的含量，并規(guī)定每粒膠囊中含芍藥苷不得低于0.24 mg[12-13]。中藥發(fā)揮療效的固有特性是多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用，而僅靠控制單一的中藥有效成分群的含量，難以客觀、全面地評價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，有必要建立一種簡單、方便、實(shí)用、可綜合評價(jià)該制劑的質(zhì)量控制方法。

一測多評法是指通過藥物組分間的某種內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，建立內(nèi)參物和各成分間的相對校正因子，從而實(shí)現(xiàn)多種有效成分含量同時(shí)測定的一種快速評價(jià)手段，該評價(jià)手段已在中藥飲片及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制中廣泛應(yīng)用[14-15]。本研究遵循質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)的原則，選取血府逐瘀膠囊中赤芍的代表成分芍藥苷，枳殼所含主要活性成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷，甘草所含主要成分甘草苷、甘草酸銨為檢測指標(biāo)。其中芍藥苷為內(nèi)參物，采用一測多評法同時(shí)測定該制劑中的7種有效活性成分，為血府逐瘀膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高與完善提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器HPLC色譜儀（美國安捷倫公司，Agilent 1200型），主要包括UV紫外檢測器，四元梯度泵和Empower Pro色譜工作站；自動(dòng)純水機(jī)（美國，Milli Pore Advantage A10）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200 DE型）；電子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司，XS205DU型）。

1.2 藥物與試劑對照品分別為：芍藥苷（批號：110736-201337，純度為95.7%）、新橙皮苷（批號：110727-201608，純度為99.9%）、柚皮苷（批號：110722-201613，純度為94.3%）、橙皮苷（批號：110721-201310，純度為96.1%）、甘草苷（批號：111610-200604，純度為98.0%）、甘草酸銨（批號：110731-201619，純度為93.0%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷（批號：180901，純度為98.0%）來源于成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈和磷酸（色譜級）來源于默克公司，其他試劑（分析純）來源于天津化學(xué)試劑廠，水為屈臣氏蒸餾水。5批血府逐瘀膠囊（批號分別：20190721，20190810，20190920，20191002，20191028，20191125，0.4g/粒）為天津宏仁堂藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～12 min，17% A；12～18 min，17%→20% A；18～23 min，20%→28% A；23～36 min，28%→45% A；36～44 min，45%→70% A；44～50 min，70%→95% A；檢測波長：220nm；柱溫：30℃，流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取1.45 mg的芍藥苷、1.237 mg的柚皮苷、0.840 mg的橙皮苷、1.56 mg的新橙皮苷、1.14 mg的蕓香橙皮苷、1.88 mg的甘草苷、0.678 mg的甘草酸銨對照品，分別置于7個(gè)25 mL的透明容量瓶中，滴加50%的甲醇超聲溶解后定容至刻度線，制成各自質(zhì)量濃度為55.51、46.66、32.29、62.34、44.69、73.70、25.22 μg/mL的對照品貯備溶液。

2.3 供試品溶液的制備取血府逐瘀膠囊樣品約0.2 g，精密稱定樣品質(zhì)量，置于100 mL的具塞錐形瓶中，精密量取25 mL的50%甲醇溶液，緩慢加入后稱定總質(zhì)量，超聲波提取目標(biāo)成分40 min后，取出，放冷后再稱重，補(bǔ)足減失的甲醇溶液質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜0.45 μm過濾，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照品溶液的制備缺少赤芍藥材的陰性對照樣品、缺少麩炒枳殼藥材的陰性對照樣品和缺少甘草藥材的陰性對照樣品均在中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，參照血府逐瘀膠囊用藥比例和制備工藝分別制備完成，最后再按“2.3”項(xiàng)下方法制備各陰性對照溶液。

2.5 方法學(xué)考察已制備好的混合對照品溶液和供試品溶液各精密吸取10 μL，按照既定的HPLC-UV進(jìn)樣程序設(shè)置進(jìn)樣，最后記錄50 min的HPLC色譜圖（見圖1）。結(jié)果顯示，芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的色譜峰分離度均≥1.5，理論塔板數(shù)按照各成分色譜峰計(jì)算均≥3 500，陰性樣品對含量測定無干擾。表明所建立的HPLC-UV方法滿足本次實(shí)驗(yàn)的測試要求

圖1 對照品與樣品HPLC色譜圖

2.6 線性關(guān)系、定量限和檢出限精密量取0.25、0.50、1.25、2.50、5.0 mL的芍藥苷（濃度為55.51 μg/mL）、柚皮苷（濃度為46.66μg·mL-1）、橙皮苷（濃度為32.29μg·mL-1）、新橙皮苷（濃度為62.34μg·mL-1）、蕓香橙皮苷（濃度為44.69 μg·mL-1）、甘草苷（濃度為73.70 μg·mL-1）、甘草酸銨（濃度為25.22 μg·mL-1）混合對照品溶液，置于透明的容量瓶中，緩慢滴加甲醇溶液定容至5 mL的刻度線處，即可稀釋配制成不同質(zhì)量濃度的芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷和甘草酸銨對照品溶液，然后依次按照既定的HPLC-UV色譜條件進(jìn)樣10 μL定量分析，根據(jù)峰面積（A）計(jì)算各個(gè)成分的含有量。即7種成分的質(zhì)量（X，μg）為橫坐標(biāo)，其各自的峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，通過計(jì)算得出各自標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程與相關(guān)系數(shù)r。結(jié)果見表1，表明各成分的線性關(guān)系在其相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。以3倍的信噪比（S/N=3）得出儀器檢出限和10倍的信噪比（S/N=10）得出儀器的定量限。

表1 7種化學(xué)成分線性關(guān)系

2.7 精密度試驗(yàn)取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品1份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法，連續(xù)測定6次后計(jì)算各成分的含量。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的含有量RSD值分別為：1.20%、1.03%、1.02%、1.05%、0.95%、1.03%、0.98%，表明本次實(shí)驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品1份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法，分別于0、2、4、6、8、12 h注入HPLC色譜儀。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種有效成分的峰面積（A）的RSD值分別為：1.05%、1.12%、1.33%、0.84%、0.73%、1.02%、0.98%，表明樣品溶液中的7種成分在12 h內(nèi)均有良好的穩(wěn)定性。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品共6份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法，分別進(jìn)樣分析。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的含有量RSD值分別為：1.01%、1.22%、1.21%、0.99%、0.95%、1.35%、0.98%，表明建立的方法重復(fù)性較好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品共9份，每份取約0.1 g，精密稱定后分別置于錐形瓶100 mL中，每組分別加入芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨對照品溶液，加入的量為血府逐瘀膠囊樣品中各成分含量的50%、100%和150%，按照已定的樣品制備和HPLC-UV程序進(jìn)樣方法進(jìn)行色譜分析，并計(jì)算7種有效成分的加樣回收率。結(jié)果顯示，平均回收率分別是芍藥苷為99.88%（RSD=1.12%）；柚皮苷為101.80%（RSD=1.10%）；橙皮苷為105.07%（RSD=0.53%）；新橙皮苷為98.98%（RSD=1.21%）；蕓香橙皮苷為101.22%（RSD=1.23%）；甘草苷為100.99%（RSD=1.31%）；甘草酸銨為98.79%（RSD=1.02%），本次實(shí)驗(yàn)的加樣回收率良好，表明建立的實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確、可靠。

2.11 建立一測多評（QASM）法的質(zhì)量評價(jià)模式

2.11.1 計(jì)算相對校正因子（fi/s） 精密量取“2.6”項(xiàng)下配制的一系列混合對照品溶液，按照HPLC-PDA程序進(jìn)樣的方法依次進(jìn)樣測定芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的峰面積，以芍藥苷為內(nèi)參物，用濃度與峰面積之比計(jì)算校正因子，將待測成分與內(nèi)參物校正因子之比計(jì)算fi/s，計(jì)算公式為fi/s=AsCi/AiCs，式中As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度，Ai為待測成分峰面積，Ci為待測成分濃度。計(jì)算柚皮苷（f1）、橙皮苷（f2）、新橙皮苷（f3）、蕓香橙皮苷（f4）、甘草苷（f5）、甘草酸銨（f6）的fi/s分別為1.80、1.08、0.82、0.78、0.57、0.52。

2.11.2 fi/s的耐用性考察 本次實(shí)驗(yàn)對不同人員、流速、柱溫、色譜柱和HPLC儀器對fi/s的影響進(jìn)行了考察：分別選用了Agilent 1260色譜儀和Waters 2695色譜儀系統(tǒng)；Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo BDS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；3種不同的流速；3種不同柱溫；2名研究人員進(jìn)行了耐用性考察。結(jié)果表明各因素對fi/s無顯著影響，RSD值在0.48%～1.87%（見表2），表明重現(xiàn)性良好、方法可行，因此可采用一測多評法進(jìn)行血府逐瘀膠囊的含量測定。

表2 各種因素對fi/s的影響

2.12 樣品含量測定及比較為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建立的一測多評法的準(zhǔn)確性，本研究采用外標(biāo)法和一測多評法的fi/s對5批血府逐瘀膠囊中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的含量進(jìn)行測定，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的相對誤差（RD）小于2%，無明顯差異，表明所建立的一測多評法可以用于血府逐瘀膠囊的質(zhì)量評價(jià)研究（見表3）。

表3 5批血府逐瘀膠囊7種指標(biāo)成分含量測定結(jié)果（mg/粒）

3 討 論

3.1 測定指標(biāo)成分的選擇血府逐瘀膠囊是在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，經(jīng)過中藥藥劑制備工藝精心制備而成的中藥復(fù)方，該方中各有效成分協(xié)同作用、共同發(fā)揮藥效。2015年版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定芍藥苷和柚皮苷為血府逐瘀膠囊的指標(biāo)成分，筆者結(jié)合該復(fù)方的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇可能發(fā)揮療效的芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種化學(xué)成分為測定指標(biāo)，采用一測多評-HPLC法同時(shí)定量分析了各有效成分在樣品中的含有量，結(jié)果顯示，7種有效成分在已定的HPLC色譜方法下分離度均較好。

3.2 波長的選擇本次實(shí)驗(yàn)筆者通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)，在波長220 nm處芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨均有明顯的吸收，故實(shí)驗(yàn)選擇在波長220 nm下對芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種有效成分的含量進(jìn)行測定。

3.3 HPLC條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程中分別對乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水3種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.05%磷酸水流動(dòng)相體系下進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種成分之間色譜峰的分離度均大于1.5，分離效果較好；考察不同的溫度（29、30、31℃）和不同的流速（0.7、0.8、0.9 mL·min-1）對各有效成分色譜峰的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30℃的柱溫、0.8 mL·min-1的流速可以達(dá)到色譜峰基線平穩(wěn)、分離度和峰形較好的效果；考察不同品牌的4種色譜柱Agilent EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；Waters XBridgeTM C18（4.6mm×250mm，5 μm）；Thermo BDS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Agilent TC-C18柱能將7種成分，即芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的色譜峰分開，并達(dá)到良好的分離度。通過對耐用性的考察，結(jié)果顯示不同品牌的色譜柱、不同的HPLC檢測儀器和不同的實(shí)驗(yàn)人員操作對相對校正因子（f）的影響均不顯著，并且在不同條件下，7種有效指標(biāo)性成分的f重現(xiàn)性較好（RSD＜2.0%）。

3.4 樣品提取方法的選擇通過單因素考察的方式對血府逐瘀膠囊樣品的提取溶劑、提取方法等進(jìn)行考察?？疾炝思状?、50%甲醇，70%甲醇；加熱回流、浸提和超聲提取；提取30、40、50 min對芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%的甲醇超聲提取40 min即可使該制劑樣品中的芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨提取完全。

3.5 小結(jié)本研究建立了一測多評-HPLC法同時(shí)測定血府逐瘀膠囊中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨含量的方法，對5批血府逐瘀膠囊中7種成分進(jìn)行了外標(biāo)法和一測多評法定量分析，結(jié)果表明兩種方法測定的成分含量差異較小。通過對HPLC分離參數(shù)進(jìn)行了一系列的方法學(xué)考察，優(yōu)化得出最理想的HPLC色譜分離方法，表明本次實(shí)驗(yàn)所建立的一測多評方法能同時(shí)測定血府逐瘀膠囊中7種有效成分的含有量，結(jié)果較為準(zhǔn)確、快速。本研究不僅能夠科學(xué)客觀的評價(jià)血府逐瘀膠囊內(nèi)在質(zhì)量，同時(shí)又能節(jié)約對照品、提高檢測速度、降低成本，便于應(yīng)用于該制劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。