張春林，張苗苗，楊甜甜，郭壯，肖石高，侯強川

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，呼和浩特 010018；2.湖北文理學院食品科學技術(shù)學院，湖北 襄陽 441053；3.湖北澳利龍食品股份有限公司，湖北宜昌 444100）

0 引言

奶豆腐是一種以牛奶、馬奶、羊奶為原料，經(jīng)煮沸使乳清與乳酪分離，隨后經(jīng)過凝固、自然發(fā)酵等過程制作而成的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品[1]，因其形狀與豆腐相似而得名。奶豆腐已有幾千年的食用歷史，深受我國北方蒙古、哈薩克等游牧民族的喜愛[2]。奶豆腐中富含蛋白質(zhì)、氨基酸以及對人體有益的微量元素[3]，具有提高免疫力、美容養(yǎng)顏等方面的作用。目前我國奶豆腐的消費較少，究其原因與當前奶豆腐主要以手工制作為主，尚未實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品品質(zhì)無法得到有效保障等有關(guān)。

作為一種代表性傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，奶豆腐中有著豐富的微生物群系，其在產(chǎn)品發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，其中細菌對于奶豆腐風味及感官品質(zhì)的形成發(fā)揮重要作用。例如乳酸菌通過產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)[4]，有利于奶豆腐的凝固，同時提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)和風味[5]，而丙酸桿菌和哈夫尼菌等細菌的存在則有利于奶豆腐顏色的形成[6]。傳統(tǒng)手工奶豆腐多為牧民自家制作，制作環(huán)境、生產(chǎn)工藝[7]、氣候條件[8]等因素均會對奶豆腐微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進而導致不同地區(qū)手工制作的奶豆腐品質(zhì)存在差異。因此，對奶豆腐細菌群落結(jié)構(gòu)進行解析有助于揭示不同地區(qū)奶豆腐風味品質(zhì)存在差異的潛在機制，促進奶豆腐后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)。當前以Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)為代表的第二代測序技術(shù)具有通量大、準確度高等優(yōu)點，能夠全面解析微生物群落結(jié)構(gòu)[9]，目前已經(jīng)應(yīng)用于食品[10]、土壤[11]、水體[12]等領(lǐng)域的研究。

本研究從新疆塔城和內(nèi)蒙古錫林郭勒兩個代表性的奶豆腐制作地區(qū)各采集了10 份奶豆腐樣品，采用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對其中的細菌群落結(jié)構(gòu)進行解析，探究了兩個地區(qū)奶豆腐中微生物群落結(jié)構(gòu)的共性和差異，為奶豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)及品質(zhì)控制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

奶豆腐：采集自新疆塔城和內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)各10 份，奶豆腐樣品收集后置于自封袋中，依次編號為TC1～TC10和XM1～XM10，運回實驗室中于-20 ℃暫存，用于后續(xù)分析。

DNeasy mericon Food Kit 提取試劑盒，德國QIA?GEN 公司；引物338F/806R，武漢天一輝遠生物科技有限公司；Illumina MiSeq 測序配套試劑，美國Illumina公司。

1.1.2 設(shè)備

MiSeq PE250 高通量測序平臺，美國Illumina 公司；R930 機架式服務(wù)器，美國DELL 公司；Veriti FAST梯度PCR 儀，美國ABI公司。

1.2 奶豆腐DNA 提取、PCR 擴增和高通量測序

將奶豆腐樣品解凍完成后用無菌研缽將其磨碎置于無酶無菌離心管中，使用QIAGEN DNeasymeri?con Food Kit 試劑盒進行基因組DNA 提取。參照Wang 等人的研究方法[13]，使用帶不同barcode 的16S引物以16S rRNA V3～V4 區(qū)為靶點進行PCR 擴增，將經(jīng)過純度和完整性檢測合格后的擴增產(chǎn)物進行Illu?mina MiSeq高通量測序。

1.3 生物信息學分析

根據(jù)引物中不同的barcode（核苷酸標簽）將返回的序列分配給每個樣品，使用QIIME 分析平臺[14]將合格的序列依次 使用PyNAST[15]、UCLUST[16]、Chime?raSlayer 進行對齊、劃分操作分類單元（operational tax?onomic units，OTU）以及去除含嵌合體OTU 的操作，然后使用Silva[17]、Greengene[18]和RDP[19]數(shù)據(jù)庫進行序列比對以明確各OTU 的分類學地位，并對各樣品菌群α多樣性和不同地區(qū)樣品菌群β多樣性進行計算。

1.4 圖形繪制與數(shù)據(jù)分析

使用R 軟件（v3.6.2）對α多樣性指數(shù)、相關(guān)性熱圖進行可視化，基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac 距離進行β多樣性分析，使用Canoco（v4.5）軟件進行冗余分析（Re?dundancy analysis，RDA），其他圖均采用origin2017 進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)奶豆腐中細菌群落組成分析

本研究20 份奶豆腐樣本中共測得序列647 963條，平均每份樣本的測序量為32 398 條。依據(jù)97%相似度進行OTU劃分后共得到4 760個非嵌合體OTU，平均每份樣本OTU 數(shù)為238 個?；贠TU 的注釋信息，本研究首先在門水平對不同地區(qū)奶豆腐中細菌群落結(jié)構(gòu)進行了比較分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢菌門的相對豐度

所有奶豆腐樣本中共注釋到32 個細菌門。由圖1 可知，奶豆腐中的優(yōu)勢菌門（平均相對含量大于1.0%）共有4 個，分別為Firmicutes（硬壁菌門）、Proteo?bacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）和Bac?teroidetes（擬桿菌門），其平均相對含量分別為69.56%、20.35%、6.85%和2.19%，累計相對含量為98.95%。這與雷炎[20]等人之前的研究基本一致，不同之處在于上述研究發(fā)現(xiàn)奶豆腐中硬壁菌門和變形菌門的相對含量基本相同。顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)，塔城地區(qū)樣品中放線菌門的相對含量顯著高于錫林郭勒地區(qū)（P<0.05），顯示出不同地區(qū)奶豆腐菌群群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。本研究進一步在屬水平上對奶豆腐中細菌群落結(jié)構(gòu)進行了比較分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2 可知，奶豆腐中含有12 個優(yōu)勢細菌屬（平均相對含量大于1.0%），分別為Lactococcus（乳球菌屬，28.52%）、Lactobacillus（乳桿菌屬，26.77%）、Streptococcus（鏈球菌屬，5.23%）、Acetobacter（醋桿菌屬，4.98%）、An?oxybacillus（無氧芽胞桿菌屬，3.57%）、Kocuria（考克氏菌屬，2.87%）、Pseudochrobactrum（假蒼白桿菌屬，2.70%）、Arthrobacter（節(jié)桿菌屬，1.93%）、Pseudomonas（假單胞菌屬，1.76%）、Acinetobacter（不動桿菌屬，1.52%）、Rouxiella（魯希氏菌屬，1.34%）和Ralstonia（羅爾斯頓菌屬，1.18%）。可見奶豆腐中的優(yōu)勢菌屬大多隸屬于乳酸菌，且以乳球菌屬和乳桿菌屬為主。在優(yōu)勢菌屬類群方面，本研究的結(jié)果與之前的報道基本一致[21]，但不同菌屬間相對含量存在明顯差異。乳酸菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中主要的微生物，不僅可以在奶豆腐發(fā)酵過程中分解乳糖產(chǎn)生乳酸，提升營養(yǎng)價值，還可以分解蛋白質(zhì)形成具有特殊風味的物質(zhì)，對于形成奶豆腐的特殊風味具有重要的作用[22]。例如，乳酸乳球菌可將牛奶中的乳糖發(fā)酵形成乳酸，進而產(chǎn)生風味物質(zhì)雙乙酰和乙醛[23]，其胞內(nèi)的肽酶和胞外蛋白酶在乳制品成熟過程中可促進蛋白質(zhì)水解，對最終產(chǎn)品風味物質(zhì)的形成具有重要作用[24]。此外，相關(guān)報道顯示，乳桿菌屬中的植物乳桿菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生一系列抑菌物質(zhì)如抗菌肽、雙乙酰、過氧化氫等[25]，這對于提高機體免疫力和抑制病原菌具有積極的作用。

圖2 不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢菌屬的相對豐度

2.2 不同地區(qū)奶豆腐細菌群落結(jié)構(gòu)α和β多樣性分析

α多樣性常用來評估樣本中微生物的多樣性情況，其常用的評估指標包括物種多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)）和物種豐富度指數(shù)（發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和Chao1 指數(shù)）。本研究為探究不同地區(qū)奶豆腐微生物多樣性的整體差異，對4 種不同的α多樣性指數(shù)進行了比較分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同地區(qū)奶豆腐中微生物α多樣性的比較分析

由圖3 可知，錫林郭勒地區(qū)奶豆腐中微生物在香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)上均略高于塔城地區(qū)奶豆腐，但所有α多樣性指數(shù)差異均不顯著（P>0.05）。可見，塔城和錫林郭勒地區(qū)奶豆腐中微生物的多樣性和豐富度均無顯著性差異。本研究在此基礎(chǔ)上進一步對不同地區(qū)奶豆腐中微生物群落的整體結(jié)構(gòu)進行了比較分析，結(jié)果如圖4所示。

由圖4（a）可知，在以前兩個主成分繪圖時，采集自錫林郭勒的奶豆腐樣品分布較為集中，而塔城的奶豆腐樣品在圖中分布較為分散，同時兩個地區(qū)的樣品存在一定的交疊。由圖4（b）可知，錫林郭勒和塔城奶豆腐沿第一主成分方向具有完全分離的趨勢。上述結(jié)果表明，兩個地區(qū)的奶豆腐樣品在高豐度的菌群組成方面具有一定相似性，但是低豐度的菌群組成存在較大差異。同時，隸屬于塔城的奶豆腐菌群群落結(jié)構(gòu)差異大于錫林格勒地區(qū)奶豆腐，這為將來從中分離和收集乳酸菌菌株資源提供了寶貴的原材料。之前有研究發(fā)現(xiàn)奶豆腐中的微生物主要來源于環(huán)境[21]，塔城位于歐亞大陸腹地，屬于溫帶干旱和氣候[26]，而錫林郭勒為高原草場，屬北溫帶大陸性氣侯[27]。兩者在氣候上的差異會可能會導致環(huán)境中的微生物存在明顯的不同[28]，這可能是導致奶豆腐中微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異的最主要的原因之一。除此之外，不同牧民家庭在制作奶豆腐時擠壓乳酪以分離乳清時所采用的力度可能不同，使得原始奶豆腐中的水分含量存在較大差異。由于塔城地區(qū)的氣候更為干燥，乳酪中原始的水分含量對最終奶豆腐產(chǎn)品中菌群組成影響更為顯著，導致該地區(qū)奶豆腐制品中菌群群落結(jié)構(gòu)差異更大。

圖4 基于加權(quán)（a）和非加權(quán)（b）UniFrac距離的主坐標分析

2.3 不同地區(qū)奶豆腐中差異菌屬的甄別

為了進一步甄別導致兩個地區(qū)奶豆腐中微生物群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵細菌屬，本研究以不同采樣地作為分組依據(jù)，以優(yōu)勢菌屬為響應(yīng)變量進行了RDA 分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5 可知，僅有乳球菌屬和鏈球菌屬共計2 個優(yōu)勢菌屬與RDA 排序軸上的奶豆腐樣本具有良好的賦值相關(guān)性?？梢娙榍蚓鷮俸玩溓蚓鷮偈窃斐蓛傻啬潭垢⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵細菌類群，其中乳球菌屬在錫林郭勒奶豆腐中的相對含量較高，鏈球菌屬在塔城奶豆腐中的相對含量較高。Li 等人使用乳酸乳球菌進行奶制品發(fā)酵時能提升酸奶中3-甲基丁醛和3-甲基-2-丁酮等揮發(fā)性香味物質(zhì)的含量，對于提升酸奶風味品質(zhì)具有重要的作用[29]；而嗜熱鏈球菌作為酸奶發(fā)酵常用的發(fā)酵劑之一，其在與保加利亞乳桿菌進行復配發(fā)酵酸奶時，對于奶制品品質(zhì)的形成具有重要的作用[30]。此外，本研究對優(yōu)勢菌屬在兩地奶豆腐中的差異進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果如6所示。

圖5 RDA雙序圖

由圖6 可知，12 個優(yōu)勢細菌屬中有5 個菌屬在兩地奶豆腐中存在顯著性差異。其中乳球菌屬在錫林郭勒奶豆腐中的相對含量顯著高于塔城奶豆腐（P<0.05），與RDA 結(jié)果一致。而假蒼白桿菌屬（Pseudo?chrobactrum）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、不動桿菌屬（Aci?netobacter）和羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）在塔城奶豆腐中的相對含量顯著高于錫林郭勒奶豆腐（P<0.05）。乳球菌屬的生長與周圍環(huán)境中水分活度之間存在密切聯(lián)系，Bassit[31]等人的研究發(fā)現(xiàn)，水分活度的降低會顯著抑制乳酸乳球菌乳酸亞種diacetylactis 變種（Lactococ?cus lactis subsp.lactis var.diacetylactis，原名為Streptococcus diacetylactis）的生長。由于塔城身居歐亞大陸內(nèi)部，導致該地區(qū)氣候較錫林郭勒地區(qū)更為干燥，這可能是乳球菌屬在錫林郭勒奶豆腐中的相對含量顯著高于塔城奶豆腐的原因之一。同時，不同地區(qū)奶豆腐中菌群群落結(jié)構(gòu)的差異進一步引起各地奶豆腐不同的產(chǎn)品風味和品質(zhì)。

圖6 不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢菌屬的差異分析

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)，對采自塔城和錫林郭勒地區(qū)奶豆腐中的微生物多樣性進行了解析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢菌屬的種類相似，但一些優(yōu)勢菌屬相對含量及低豐度物種組成存在較大差異。不同地區(qū)奶豆腐中存在大量的乳酸菌類群，且主要以Lactococcus（乳球菌屬）、Lactobacillus（乳桿菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）為主，乳球菌屬和乳桿菌屬是造成塔城和錫林郭勒菌群結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵菌屬，上述兩個菌屬可以作為后續(xù)評估不同地區(qū)奶豆腐品質(zhì)差異的重點關(guān)注菌屬。