程分生，尤龍輝，余錦林，徐惠昌，游惠明，聶森，李建民，葉功富

（1. 福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州350002；2. 福州市林業(yè)局自然保護地規(guī)劃發(fā)展中心，福建 福州350007；3. 福建省林業(yè)科學研究院，福建 福州350012）

殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea）中的錐栗（Castanea henryi）在我國分布廣泛，其果實香甜，并以高維生素和高熱量等營養(yǎng)價值優(yōu)點，成為重要的木本糧食樹種之一［1］，在丘陵山地欠發(fā)達地區(qū)，還是地方重要的財政收入和農(nóng)民增收的重要經(jīng)濟來源［2］。長期以來，我國錐栗園的地面管理模式以高強度集約經(jīng)營如清除林下灌草、翻耕、施用化肥和除草劑等為主［1?2］。高強度經(jīng)營會導致林地生物多樣性降低、水土流失、土壤質(zhì)量下降等一系列問題［3］，使樹體生長勢衰退，錐栗產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重制約著錐栗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)和高質(zhì)量發(fā)展。

果園生草法源于歐美與日本，采用全園或帶狀人工覆植綠肥，或是除去園內(nèi)部分不適宜的自然生長的雜草種類，逐漸達到免耕目的的新型低強度果園地面經(jīng)營方式［4］。大量研究表明，果園綠肥可以改善土壤理化性質(zhì)［5］，提高土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分含量［6］，調(diào)節(jié)果園微域環(huán)境和小氣候，提升果實的產(chǎn)量和品質(zhì)［7］。目前，已有少數(shù)研究者開展了錐栗園的生草栽培試驗，探討了生草對錐栗園坡面水土流失［8］、土壤理化性質(zhì)及錐栗產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［9］，但有關(guān)綠肥對土壤微生物群落的影響及其土壤恢復機制仍未深入研究。

土壤理化性質(zhì)及養(yǎng)分含量動態(tài)可用來反映經(jīng)營干擾對土壤質(zhì)量演化規(guī)律的影響，但土壤長期大量施用化肥和除草劑會削弱這類指標的敏感度［10］，因而一些具有指示預(yù)警作用的生物指標逐漸被重視和應(yīng)用。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分之一，幾乎所有的土壤生物化學過程都直接或間接與土壤微生物有關(guān)，被認為是表征土壤質(zhì)量變化最敏感、最有潛力的生物指標之一［11］。有研究指出，森林土壤高強度集約經(jīng)營會降低土壤微生物多樣性［12］。生草栽培是否有利于提升錐栗園土壤微生物多樣性，不同生草對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響是否有差異，這種差異與土壤質(zhì)量有什么內(nèi)在關(guān)聯(lián)等問題尚未見報道。鑒于此，本試驗利用高通量測序技術(shù)，分析紅壤丘陵山地錐栗園分別種植鼠茅草（Vulpia myuros）、黑麥草（Lolium perenne）和光葉紫花苕（Vicia villosa）等冷季型綠肥后林地土壤微生物群落組成和多樣性的差異，并以傳統(tǒng)清耕和噴施草甘膦等經(jīng)營模式為對照，探討錐栗園土壤質(zhì)量綠肥恢復機制，以期為錐栗果園生草制度的科學制定和高品質(zhì)生態(tài)錐栗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1. 1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于武夷山脈東南麓福建省建甌市龍村鄉(xiāng)（27°12. 24′?27°20. 03′N，118°23. 44′?118°38. 25′E），屬低山丘陵區(qū)，海拔670～750 m，平均坡度20～23°，年均氣溫18. 7 ℃，年降水量1670 mm，年均蒸發(fā)量1250～1530 mm，無霜期274～291 d，晝夜溫差較大，光照充足，雨量充沛，屬亞熱帶季風氣候。土壤類型以紅壤為主，土壤平均厚度在1 m。當?shù)劐F栗栽植的品種以白露仔、長芒仔、油榛和圓蒂仔等為主，林下自然散生草本植物主要有杠板歸（Polygonum perfoliatum）、懸鉤子（Rubus corchorifolius）、狗尾草（Setaria viridis）、積雪草（Centella asiatica）、鐵芒萁（Dicranopteris linearis）、芒草（Miscanthus）、星宿菜（Lysimachia fortunei）等。

1. 2 樣地設(shè)置與研究方法

2018 年，在龍村鄉(xiāng)錐栗生產(chǎn)示范區(qū)選取集中連片、面積較大、立地條件基本一致的樣地（地理位置為27°13′55″N，118°32′5″E，園區(qū)總面積>10. 0 hm2），將其劃分成若干面積大小為0. 3～0. 5 hm2的試驗小區(qū)，進行生草栽培管理，每個小區(qū)隨機選取一種綠肥草種，栽培方式具體為：撒播草種前，整平整細地面，樹干基部周圍（半徑約30 cm）采用行間旋耕土起壟后不覆草。采用撒播方式進行全園播種，首次在冬末10?12 月，翌年早春3?5 月續(xù)播，每個小區(qū)播種量均為30 kg·hm?2，并覆蓋薄膜；苗長至5 cm 左右及時撤掉薄膜，每年追肥2 次，早春及早秋，采用復合肥（NPK 配比N?P2O5?K2O=15∶15∶15）追肥，追肥量120 kg·hm?2，并采取人工除雜草、刈割、壓青、防治病蟲害等撫育措施。另外選取兩塊試驗小區(qū)作為對照組，一組采用清耕法進行管理，每年4 和6 月各人工鋤草一次；另一組則每年4 和6 月，用10% 草甘膦水劑1.5 kg，均勻兌水30 kg，向雜草莖葉處噴霧除草。為了保證可比性，對照組的水肥管理與生草栽培處理保持一致。供試樣地林分基本情況見表1。

表1 供試林分基本情況Table 1 Basic information of tested stands

2020 年10 月，對各生草栽培模式和對照組，分別設(shè)置3 個垂直投影為20 m×20 m 的調(diào)查樣地，樣地間隔20 m 以上，共計15 個樣地，總面積6000 m2。在各樣地選取3 株砧木為毛榛（Corylus mandshurica），接穗為白露仔且樹體生長健康、樹高和胸徑基本一致的錐栗，距樹干基部1 m 處，區(qū)分東西南北4 個方向，清除表層凋落物，手持土鉆采集4 個方向表層（0～10 cm）土壤，放入自封袋混合均勻后采用四分法得到土壤鮮樣，去除根系、石礫等雜質(zhì)后等分成2 份，一份土壤鮮樣用干冰保存，用于土壤微生物群落高通量分析，另一份土壤放入自封袋，風干后研磨過2. 000 和0. 147 mm 篩備用，測定其土壤養(yǎng)分含量和酶活性。鉆取土壤的同時，利用環(huán)刀取鄰近鉆點的土壤，用于測定土壤容重、孔隙度和自然含水率。

1. 3 土壤理化性質(zhì)和酶活性測定

土壤容重、孔隙率、含水率采用環(huán)刀法測定，pH 值采用電位法測定（水∶土=2. 5∶1. 0），土壤全碳、氮采用元素分析儀（Vario EL Ⅲ，Elementar Analysensysteme GmbH，Hanau，Germany）測定，堿解氮采用堿解擴散法測定，采用碳酸氫鈉浸提?鉬銻抗分光光度法測定土壤有效磷含量，醋酸銨?火焰光度計法測定土壤速效鉀含量，土壤酶活性參照楊露等［6］和井趙斌等［13］的方法：脲酶活性測定采用苯酚鈉比色法，酸性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法，用3，5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶和纖維素酶活性，采用鄰苯三酚比色法測定多酚氧化酶活性，α-葡萄糖苷酶采用S-α-GC 法測定、β-葡萄糖苷酶采用硝基酚比色法測定。

1. 4 土壤微生物多樣性測定

1. 4. 1 土壤DNA 的提取 采用南京集思慧遠生物科技有限公司提供的總DNA 提取試劑盒。稱取0. 5 g 保存于?20 ℃冰箱中的土壤樣品，參照試劑盒所述方法提取土壤樣品總DNA，隨后DNA 總?cè)芤悍謩e通過1% 瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop-2000（Thermo Scientific，USA）檢測DNA 溶液的純度和濃度，提取DNA 的土壤樣品保存于?20 ℃冰箱中備用。

1. 4. 2 PCR 擴增和基因測序 將提取后的土壤DNA 樣品送南京集思慧遠生物科技有限公司進行PCR 及高通量測序，分別以16S rRNA V3～V4 區(qū)通用引物對338F/806R（ACTCCTACGGGAGGCAGCA/GGACTA CHVGGGTWTCTAAT）［14］和ITS1-F/ITS2（CTTGGTCATTTAGAGAGAGTAA/GCTGCGTTCTTCAT CGATGC）［15］進行PCR 擴增。使用的PCR 程序為98 ℃2 min，98 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，30 個循環(huán)，然后72 ℃5 min。PCR 擴增產(chǎn)物通過2% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，純化PCR 產(chǎn)物，采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 進行文庫構(gòu)建。

上機測序前，需質(zhì)檢文庫。對合格的測序文庫梯度稀釋后，按所需測序量一定比例混合，并經(jīng)NaOH 變性為單鏈進行上機測序。本實驗采用Illumina MiSeq PE300 測序儀進行2×300 bp 的雙端測序。通過QIIME 軟件分析原始細菌和真菌的讀數(shù)，并調(diào)用USEARCH 檢查并剔除低質(zhì)量和嵌合體序列。通過Barcode 序列找回每個樣品對應(yīng)的序列。 將前述高質(zhì)量序列以97% 的相似性聚類為可操作的分類單位（operational taxonomic units，OTU）。最后，依據(jù)細菌的Greengenes 數(shù)據(jù)庫和真菌的UNITE Fungal ITS 數(shù)據(jù)庫對每個OTU 的代表性序列進行了分類。再對OTUs 進行豐度、Chao1、Shannon、Goods_coverage 多樣性指數(shù)等分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

1. 5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 22. 0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準差，并采用Duncan多重比較進行顯著性檢驗（α=0. 05）；基于OTUs 操作分類單元，使用R 軟件vegan 包進行非計量多維尺度轉(zhuǎn)換排序（non-metric multidimensional scaling，NMDS），采用Origin 9. 4 對排序結(jié)果作圖；使用R 軟件pheatmap 包對優(yōu)勢門和土壤環(huán)境因子進行熱圖分析；采用Canoco 5. 0 對土壤理化性質(zhì)和酶活性與微生物群落結(jié)構(gòu)進行冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 5 種土壤管理模式對錐栗土壤環(huán)境因子的影響

由表2 可知，5 種模式中生草處理占有較高的土壤養(yǎng)分含量，其中Mode1土壤養(yǎng)分含量最高，其堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為74. 14、156. 87 和234. 76 mg·kg?1。多重比較顯示，CK1和CK2堿解氮、有效磷、速效鉀顯著低于Mode1、Mode2和Mode3（P<0. 05，下同），但CK1土壤全碳/氮則顯著高于其他處理。在土壤物理性質(zhì)方面，Mode2土壤容重顯著低于其他模式，但其土壤孔隙度最高；CK2土壤自然含水率最低。另外，Mode1、Mode2、Mode3和CK1土壤pH 值均高于CK2。

表2 5 種土壤管理模式對錐栗園土壤理化性質(zhì)的影響Table 2 Effects of five soil management modes on soil physicochemical properties of C. henryi orchard

土壤酶來源于植物根系分泌、動植物殘體分解和土壤微生物進行的代謝活動，是土壤營養(yǎng)轉(zhuǎn)化的重要催化劑，其活性的大小是指示土壤生物活性和生化反應(yīng)強度的重要指標［16］。由表3 可知，土壤過氧化氫酶、蔗糖酶活性均表現(xiàn)為Mode1最高，分別為42. 64、32. 29 U·g?1，而Mode3最低，分別為15. 40、14. 37 U·g?1，脲酶活性則表現(xiàn)為Mode1和CK2較高，分別為2. 23、2. 35 U·g?1；α-葡萄糖苷酶則表現(xiàn)為3 種生草處理均顯著高于兩組對照，纖維素酶活性則表現(xiàn)為CK2最小，β-葡萄糖苷酶則表現(xiàn)為Mode3最低。5 種模式土壤酸性磷酸酶、多酚氧化酶活性均無顯著差異。

表3 5 種土壤管理模式對錐栗園土壤酶活性的影響Table 3 Effects of five soil management modes on soil enzyme activities of C. henryi orchard（U·g-1）

2. 2 5 種土壤管理模式對錐栗土壤微生物多樣性的影響

2. 2. 1 5 種土壤管理模式對錐栗土壤細菌門水平主要豐度的影響 在門水平上（圖1），5 種模式土壤共有優(yōu)勢細菌群落從高到低分別為放線菌門（Actinobacteria，24. 9%～28. 9%）、變形菌門（Proteobacteria，20. 9%～28. 8%）、綠彎菌門（Chloroflexi，13. 7%～18. 6%）、酸桿菌門（Acidobacteria，10. 8%～12. 9%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，4. 6%～6. 9%）、浮霉菌門（Planctomycetes，3. 2%～4. 2%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，1. 8%～2. 3%）、厚壁菌門（Firmicutes，1. 4%～1. 9%）。其中，放線菌門細菌相對豐度較高為Mode1（28. 9%）、Mode2（28. 4%）和CK1（28. 9%），變形菌門細菌相對豐度較高為CK2（28. 8%），綠彎菌門細菌相對豐度較高為3 種生草處理（16. 8%～18. 6%），擬桿菌門細菌相對豐度較高為CK1（6. 9%），Mode2酸桿菌門細菌相對豐度（10. 8%）顯著降低；5 種模式土壤浮霉菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門細菌無顯著差異?？傮w來講，與CK1和CK2相比，3 種人工生草處理土壤變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門細菌相對豐度均有所下降，綠彎菌門和浮酶菌門細菌則有所增加。

圖1 5 種土壤管理模式下錐栗園土壤細菌門水平的相對豐度Fig. 1 Effects of five soil management models on relative abundance of soil bacteria in C. henryi orchard

2. 2. 2 5 種土壤管理模式對錐栗土壤真菌門水平主要豐度的影響 在門水平上（圖2），5 種模式土壤共有優(yōu)勢真菌群落從高到低分別為子囊菌門（Ascomycota，37. 4%～73. 7%）、擔子菌門（Basidiomycota，15. 3%～54. 4%）、被孢霉門（Mortierellomycota，2. 1%～4. 3%）、壺菌門（Chytridiomycota，0. 2%～0. 5%）、羅茲菌門（Rozellomycota，0. 16%～0. 36%）、球囊菌門（Glomeromycota，0. 01%～0. 23%）、絲足蟲門（Cercozoa，0. 04%～0. 10%）、毛霉門（Mucoromycota，0. 01%～0. 08%）。其中，子囊菌門真菌相對豐度最高為Mode3（73. 7%）；擔子菌門真菌相對豐度較高為Mode1（49. 7%）、Mode2（54. 4%）和對照處理CK2（54. 9%），CK1（36. 9%）次之，Mode3（15. 3%）最低；被孢霉門真菌則表現(xiàn)為Mode3（4. 3%）>CK2（3. 3%）>Mode2（2. 7%）>Mode1（2. 5%）>CK1（2. 1%）；毛霉門真菌表現(xiàn)為3 種生草處理大于兩組對照。

圖2 5 種土壤管理模式下錐栗園土壤真菌門水平的相對豐度Fig. 2 Effects of five soil management models on relative abundance of soil fungi in C. henryi orchard

基于OTU 分類操作單元對5 種模式的土壤細菌、真菌群落組分進行NMDS 分析，結(jié)果表明（圖3），5 種模式土壤細菌群落分布較為集中，且各模式間未明顯分開，表明5 種模式細菌群落結(jié)構(gòu)無顯著差異。而5 種模式土壤真菌群落均較分散，且各模式間均能獨立分開，表明5 種模式真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著差異。

圖3 土壤細菌、真菌群落結(jié)構(gòu)的非計量多維尺度轉(zhuǎn)換排序（NMDS）分析Fig. 3 Non quantitative multidimensional scaling ordination（NMDS）analysis of soil bacterial and fungal community structure

2. 3 5 種土壤管理模式土壤微生物多樣性指數(shù)

由表4 可知，5 種模式的Goods_coverage 指數(shù)均接近于1，表明土壤微生物測序深度基本達到全覆蓋水平，能夠較為全面地揭示土壤樣品的微生物組成。Chao1 指數(shù)用以反映微生物群落的豐富度，即指群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況。Shannon 指數(shù)用以反映微生物群落的多樣性，受樣品中微生物群落物種豐富度和均勻度的協(xié)同影響。3 種生草處理土壤細菌群落多樣性指數(shù)與兩組對照模式相比均有所提升，土壤真菌群落多樣性指數(shù)則相反；與其他處理相比，CK2真菌群落的OTUs、Chao1 和Shannon 指數(shù)最大，分別為1876，1982 和7. 31。

表4 錐栗園5 種土壤管理模式土壤微生物多樣性指數(shù)Table 4 Soil microbial diversity index of five soil management models in C. henryi orchard

2. 4 微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的響應(yīng)關(guān)系

2. 4. 1 細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的響應(yīng)關(guān)系 相關(guān)系數(shù)熱力圖（correlation coefficient heatmap）能夠直觀展現(xiàn)出不同土壤環(huán)境因子與細菌、真菌群落的相關(guān)性。由圖4 可知，細菌群落結(jié)構(gòu)門分類水平中擬桿菌門與自然含水率（WC）、多酚氧化酶（PPo）呈顯著負相關(guān)關(guān)系，多酚氧化酶與厚壁菌門顯著負相關(guān)，浮霉菌門與纖維素酶（Cel）顯著正相關(guān)，芽單胞菌門與α-葡萄糖苷酶顯著負相關(guān)。

圖4 土壤環(huán)境因子與細菌門水平相對豐度相關(guān)系數(shù)熱力圖Fig. 4 Thermodynamic diagram of correlation coefficient between soil environmental factors and relative abundance of bacteria at phylum level

2. 4. 2 真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系 由圖5 可知，土壤養(yǎng)分含量和酶活性與真菌群落結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)較強的相關(guān)關(guān)系，其中子囊菌門與土壤孔隙度（PO）、蔗糖酶（Suc）呈顯著負相關(guān)關(guān)系，與土壤容重（BD）呈顯著正相關(guān)關(guān)系；擔子菌門與土壤孔隙度、蔗糖酶顯著正相關(guān)，與土壤容重呈顯著負相關(guān)關(guān)系；被孢霉門與蔗糖酶顯著負相關(guān)，壺菌門與纖維素酶（Cel）顯著負相關(guān)；球囊菌門與多酚氧化酶（PPo）、α-葡萄糖苷酶顯著負相關(guān)，與過氧化氫酶（Cat）顯著正相關(guān)；毛霉門和堿解氮（HN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）和α-葡萄糖苷酶均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

圖5 土壤環(huán)境因子與真菌門水平相對豐度相關(guān)系數(shù)熱力圖Fig. 5 Thermodynamic diagram of correlation coefficient between soil environmental factors and relative abundance of fungi at phylum level

2. 5 微生物群落影響因子分析

為進一步探究人工生草法和噴施草甘膦相較于傳統(tǒng)清耕法的錐栗林土壤微生物群落變化的影響機制，以及確定能夠引起這種變化所要改變的首要土壤環(huán)境因子，揭示人工生草?土壤?微生物間的相互作用關(guān)系，以土壤理化性質(zhì)和酶活性為解釋變量，微生物群落為響應(yīng)變量，對供試樣地中影響細菌群落和真菌群落的土壤環(huán)境因子分別進行冗余分析（RDA），結(jié)果顯示如下：細菌群落的RDA 分析結(jié)果表明（圖6a），第一排序軸解釋貢獻度為38. 25%，第二排序軸為29. 47%，前兩軸總方差解釋度為67. 72%，降維后信息保留相對較高，但無顯著變量因子影響細菌群落組成；真菌群落的RDA 分析結(jié)果表明（圖6b），第一排序軸解釋貢獻度69. 72%，第二排序軸為20. 12%，前兩軸總方差解釋度為89. 84%，降維后信息保留完整，且土壤蔗糖酶活性（貢獻度為32. 4%，F(xiàn)=6. 2，P=0. 012）、土壤自然含水率（貢獻度為12. 5%，F(xiàn)=3. 2，P=0. 036）、土壤過氧化氫酶活性（貢獻度為9. 9%，F(xiàn)=3. 0，P=0. 050）、土壤全碳/氮（貢獻度為12. 1%，F(xiàn)=5. 3，P=0. 016）、土壤堿解氮含量（貢獻度為7. 4%，F(xiàn)=4. 5，P=0. 012）等土壤顯著性變量因子對于樣方沿著第一軸、第二軸的分布起到關(guān)鍵作用，是影響土壤真菌群落的主要因子。

圖6 土壤環(huán)境因子和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)冗余分析Fig. 6 Redundancy analysis of soil environmental factors and soil microbial community structure

3 討論

3. 1 5 種土壤管理模式對錐栗土壤理化性質(zhì)和酶活性的影響

本研究中，3 種生草處理土壤總孔隙度、自然含水率相比清耕模式均有所升高，一方面是由于綠肥生長迅速、莖葉茂盛、對地表遮蔽度高，可以明顯地抑制根際表土水分的蒸發(fā)［6，10］，另一方面綠肥根系的穿插作用，增大了土壤空隙，再者綠肥根莖周轉(zhuǎn)及莖葉周期性干枯腐解產(chǎn)生的CO2和腐殖質(zhì)降低了土壤的緊實度，有利于土壤團粒結(jié)構(gòu)的形成和土壤通透度的改善［6］。Abdulaki 等［17］研究表明，綠肥通過根系的吸收富集作用可以將土壤深層的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到土壤表層，增加表層土壤養(yǎng)分含量。王亞麒等［18］和楊葉華等［19］則指出，生草有利于活化土壤中的元素，提高土壤中有機質(zhì)含量，增加土壤中有效態(tài)養(yǎng)分的含量。本研究也發(fā)現(xiàn)，3 種生草模式土壤有效態(tài)氮磷鉀養(yǎng)分含量均高于清耕模式和噴施草甘膦模式。另外，丘陵山地錐栗園采用清耕或噴施草甘膦除草的方式管理地面，形成的裸露表土在雨季易發(fā)生水土流失，也會導致土壤養(yǎng)分含量下降［8?9］。

綠肥根系的胞外分泌物不僅直接增加了土壤有關(guān)酶種類，且根系分泌物和植被有機殘體還提供了多種容易為微生物利用的營養(yǎng)和能源物質(zhì)，從而增加了土壤微生物和相關(guān)酶類的活性［20］。井趙斌等［13］研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃（Actinidia Chinensis）園生草處理后，土壤過氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶和磷酸酶活性分別較清耕處理高出35. 5%、24. 7%、47. 9% 和19. 2%。與前人研究結(jié)果相似，本研究鼠茅草和黑麥草處理土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、纖維素酶和α-葡萄糖苷酶活性也高于清耕處理。但光葉紫花苕處理土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和β-葡萄糖苷酶活性則低于清耕處理，這可能與光葉紫花苕根莖生長和死亡分解過程釋放的化感物質(zhì)影響錐栗細根的正常生長，抑制相關(guān)酶類活性有關(guān)［21］。噴施草甘膦模式土壤蔗糖酶、脲酶、多酚氧化酶、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性均較低，可能是由于枯死雜草腐解的莖葉中殘存的草甘膦隨雨水進入土壤，被錐栗根系吸收富集，絡(luò)合對根尖分生組織有絲分裂有關(guān)鍵作用的營養(yǎng)元素而阻礙根系的生長，甚至阻斷根系蛋白質(zhì)的合成而致其死亡，導致根系分泌物急劇減少［9，22］，土壤微生物由于底物減少，生長繁殖受到影響，胞外酶分泌減少，活性降低。

3. 2 5 種土壤管理模式對錐栗土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

細菌作為土壤微生物的主要類群，約占其總體數(shù)量的70%～90%，對土壤生態(tài)功能的作用至關(guān)重要，是土壤質(zhì)量優(yōu)劣的敏感指標［23］。本研究利用高通量測序技術(shù)，對供試錐栗園不同生草模式、清耕和噴施草甘膦處理的土壤細菌群落進行分析，結(jié)果表明放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門細菌為優(yōu)勢類群。放線菌門和變形菌門細菌是陸地生態(tài)系統(tǒng)的主要優(yōu)勢類群，生態(tài)幅寬廣，環(huán)境適應(yīng)能力較強［24］，因此，錐栗園土壤管理方式的改變對其優(yōu)勢種群地位的影響較小；綠彎菌門細菌是一類兼性厭氧型菌群，雖在養(yǎng)分匱乏的條件下，能表現(xiàn)出一定的光能自養(yǎng)型特征，但仍以無光或有光且缺氧的條件下的化能或光能異養(yǎng)生長為主［25］。3 種人工生草處理由于生草覆蓋使錐栗園表層土壤光照降低，對綠彎菌門細菌的生長更有利，因此其相對豐度均高于清耕和噴施草甘膦處理。酸桿菌門是新近被分出的一門細菌，主要為嗜酸菌，大多數(shù)研究表明其相對豐度與土壤pH 呈負相關(guān)關(guān)系［26］，但本研究中，供試錐栗園的酸桿菌門細菌與pH 無顯著相關(guān)關(guān)系，可能與研究區(qū)酸桿菌門亞群及土壤環(huán)境因子不同有關(guān)［27］，這有待進一步研究驗證。另外，有研究指出，變形菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門以及厚壁菌門細菌為快速生長型菌群，而酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和疣微菌門細菌為緩慢生長型菌群［28］。本研究中，與清耕和噴施草甘膦相比，3 種人工生草處理土壤變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門細菌相對豐度均有所下降，綠彎菌門和浮酶菌門細菌則有所增加，細菌類群有從快速生長型向緩慢生長型轉(zhuǎn)變的趨勢，這與張勝男等［29］對榆樹（Ulmus pumila）疏林封育自然生草后，土壤微生物從緩慢生長型向快速生長型轉(zhuǎn)變的結(jié)論相反，這是由于清耕和噴施草甘膦處理雖去除了園內(nèi)雜草，但錐栗園裸露的坡面在雨季易造成水土養(yǎng)分流失，而快速生長型細菌類群由于其嗜營養(yǎng)特性，能快速吸收錐栗園每年為增加錐栗產(chǎn)量而追施的肥料，進而保障其生存繁殖［30］；錐栗園人工生草后，土壤蓄水保肥能力變強，土壤環(huán)境相對穩(wěn)定，土壤微生物種類趨于多元，緩慢生長型細菌類群也能逐漸生存定殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，3 種錐栗園人工生草處理與噴施草甘膦和清耕相比，細菌類群的豐富度和多樣性均有所增加，這是因為生草根系分泌物、細根周轉(zhuǎn)及枯死莖葉腐解為土壤細菌分解輸入大量有機底物［10］，激發(fā)其快速增殖，又因為生草種類的不同，輸入底物的碳氮比有所不同，使各模式間細菌優(yōu)勢種群表現(xiàn)出一定的差異性，但未達到顯著性水平，這可能與人工生草年限較短有關(guān)［7］。本研究NMDS 和RDA 分析也表明，錐栗園5 種土壤管理模式細菌群落組分未發(fā)生統(tǒng)計學意義上的顯著變化，說明供試錐栗園土壤細菌群落較為穩(wěn)定，生草措施短時間內(nèi)的影響作用有限。

3. 3 5 種土壤管理模式對錐栗土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

真菌作為一種種類繁多、分布廣泛的真核微生物，在維持各類生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)平衡中均扮演重要角色［31］。本研究中，5 種錐栗園土壤管理模式土壤真菌的優(yōu)勢類群均為子囊菌門和擔子菌門，約占總真菌數(shù)量的90% 以上，這與前人的研究結(jié)果一致［32］。子囊菌門大多為腐生菌，承擔著分解木質(zhì)素、角質(zhì)素等難降解有機質(zhì)的任務(wù)，在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起關(guān)鍵作用［33］。子囊菌門和擔子菌門能夠快速代謝植物根際沉積的有機底物，加快土壤碳循環(huán)［29］。而毛霉門真菌大多腐生于土壤動物糞便、動植物殘體等基物中，或寄生于動植物甚至其他真菌中［34］。本研究中，3種錐栗園人工生草處理毛霉門相對豐度均顯著高于兩種對照，這可能與人工生草增加土壤腐殖質(zhì)和土壤小動物，促進毛霉門真菌的生長有關(guān)。另外，被孢霉門某些特定被孢霉菌對土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和有效性具有重要貢獻，有可以在土壤中釋放多種有機酸來溶解土壤磷的潛力，也可影響礦質(zhì)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和促進植物生長［35］。本研究中，錐栗園種植光葉紫花苕處理被孢霉門真菌含量最高，可能與被孢霉菌易與光葉紫花苕根系共生，形成根系共生真菌有關(guān)，但還需進一步研究驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)，3 種錐栗園人工生草處理和噴施草甘膦土壤真菌群落的Chao1 和Shannon 指數(shù)與清耕相比，均有所下降，這可能與生草內(nèi)生真菌代謝物有關(guān)［36］，有研究指出，果園生草后，不同草種的內(nèi)生真菌會分泌多種毒素和生物堿，通過根系沉積物、凋落物和根組織分泌物等形式，抑制病原菌的侵染和群落組成［37］。而噴施草甘膦則會降低部分外生菌根真菌如牛肝菌屬的豐度，破壞根際外生菌根真菌的微生態(tài)平衡，進而降低土壤真菌多樣性和豐富度［38］。

NMDS 分析表明，供試錐栗園5 種土壤管理模式間的真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，是因為相較于土壤細菌，真菌在土壤微生物中的數(shù)量較少，個體較大，生長速度相對緩慢，對環(huán)境變化的響應(yīng)較敏感［38］。RDA 分析表明，驅(qū)動錐栗園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要土壤因子為蔗糖酶、土壤含水率、過氧化氫酶、土壤全碳/氮和堿解氮含量。鼠茅草和黑麥草處理與其他處理的真菌群落結(jié)構(gòu)差異，主要由土壤蔗糖酶、過氧化氫酶和土壤堿解氮含量等因素主導。其中，鼠茅草屬冷季型牧草，夏季高溫倒伏枯死，不僅抑制了果園雜草生長，而且腐解的莖葉向土壤輸入大量有機物［39］，增加了土壤擔子菌門、毛霉門、壺菌門和球囊菌門真菌的數(shù)量，提高了土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性，使土壤堿解氮含量升高，有利于滿足處于坐果期錐栗的氮素需求。黑麥草根系發(fā)達，細根周轉(zhuǎn)快，根系分泌物豐富［5，13］，同樣有利于前述真菌類群的生長繁殖，提高土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性，但由于調(diào)查期間，處于生長盛期的黑麥草與錐栗存在一定的水肥競爭，因此土壤堿解氮含量較鼠茅草處理低。光葉紫花苕系豆科野豌豆屬草本，具固氮根瘤，調(diào)查期間由于完成生命周期開始干枯腐解，會顯著提升分解有機含氮化合物能力強的毛霉門真菌的相對豐度［40］，增加土壤氮素含量，但是腐解的莖葉和根系同時也會釋放萜類、生物堿類化感物質(zhì)，抑制土壤過氧化氫酶、蔗糖酶的活性［21］，改變相關(guān)真菌優(yōu)勢門相對豐度。草甘膦則通過抑制叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）孢子活力和定殖能力，降低AMF 和植物根系對土壤氮素的有效吸附和保留能力［41］，使土壤全碳/氮上升。清耕模式由于地表草被覆蓋低，夏季蒸發(fā)散強烈，土壤含水率顯著低于其他模式，有研究指出，亞熱帶地區(qū)土壤微生物活性對土壤濕度的敏感度高于土壤溫度［42］，因此土壤含水率成為該模式土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要限制因子。相應(yīng)地，3 種生草處理較低的全碳/氮和較高的土壤含水率，兩組對照較低的土壤蔗糖酶、過氧化氫酶活性、堿解氮含量也是驅(qū)動錐栗園不同模式土壤真菌群落分異的重要因素。

4 結(jié)論

與傳統(tǒng)清耕法和噴施草甘膦相比，生草法管理錐栗園，一定程度上改變了林地的土壤環(huán)境，進一步影響了土壤微生物群落。其中，土壤細菌類群多樣性和豐富度指數(shù)均有所提升，呈現(xiàn)由快速生長型向緩慢生長型轉(zhuǎn)變的趨勢；而土壤真菌類群由于不同的生草草種產(chǎn)生明顯分異，顯著相關(guān)的土壤環(huán)境因子主要為土壤蔗糖酶活性、自然含水率、過氧化氫酶活性、全碳/氮和堿解氮含量。丘陵山區(qū)錐栗園傳統(tǒng)的地面管理措施，導致的水土流失、化肥面源污染，以及錐栗樹勢衰退、產(chǎn)量降低等問題，已無法滿足錐栗木本糧食產(chǎn)業(yè)健康、快速發(fā)展的需求。本研究通過實踐證明，生草法對于改善錐栗園土壤質(zhì)量，增加土壤微生物群落多樣性和豐富度，提升土壤有效養(yǎng)分利用率，促進錐栗健康生長，均有重要作用，可為今后南方丘陵山區(qū)錐栗園生草制度的科學制定和高品質(zhì)生態(tài)錐栗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。