李 莎， 楊冬冬， 譚真真， 張子英， 金 蓉， 馬麗杰*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 呼和浩特 010110； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所， 北京 100050)

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種由肝細(xì)胞自身免疫介導(dǎo)進(jìn)行性的肝臟疾病[1]。自1950年6月首次被報道[2]以來，人們對AIH的特征的認(rèn)識逐漸加深，這類疾病的檢出率逐年升高[3],自身免疫性肝炎以女性為主，發(fā)病年齡呈雙峰型，發(fā)病高峰是兒童和中年人，尤其是更年期的婦女[4]。

古日古木，即中藥紅花(CarthamustinctoriusL.)為菊科植物。傳統(tǒng)蒙藥成方中，古日古木-13是由紅花、丁香、蓮子、訶子、川楝子、桅子、麥冬、木香、紫檀香、麝香、銀朱、水牛角濃縮粉、牛黃組成的水丸，又稱紅花清肝十三味丸。古日古木-13出自《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊)。臨床實(shí)踐中主要應(yīng)用于肝熱性病中，如脂肪肝、病毒性肝炎、藥物性肝損傷等[5]。研究證明，古日古木通過減少氧自由基生成、抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)合成、減少轉(zhuǎn)化生長因子1(transforming growth factor 1，TGF-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)表達(dá)等途徑發(fā)揮減輕肝損傷的作用。古日古木中的訶子具有增加白介素2(interleukin-2，IL-2)分泌同時減少白介素8(interleukin-8，IL-8)，進(jìn)而降低腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)生成減少炎性反應(yīng)的作用。而梔子也可以通過清除自由基、調(diào)節(jié)肝微粒酶作用等途徑有效的保護(hù)肝損傷。另外，麥冬、蓮子、麝香、牛黃等也被證明具有保護(hù)肝功能的作用[5]。胡建燃等[6]的研究發(fā)現(xiàn)紅花作為活血化瘀類中藥可以清除活性氧自由基，具有體外抗氧化和抗補(bǔ)體活性，表明可以在一定程度上應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療。本課題組前期研究證明，古日古木和古日古木-13對CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，可能通過提高小鼠肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)及NO含量實(shí)現(xiàn)的[7-8]。而在CCl4誘導(dǎo)的小鼠慢性肝損傷模型中，古日古木-13通過降低C-Jun、C-Fos蛋白表達(dá)，增加肝再生增強(qiáng)因子ALR表達(dá)，并抑制C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)信號激活等途徑發(fā)揮減輕肝損傷、促進(jìn)肝修復(fù)的作用[9]。本課題組前期研究證明古日古木和古日古木-13也可降低血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)等肝臟轉(zhuǎn)化酶而對刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)誘導(dǎo)的免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。

在Con A誘導(dǎo)的AIH模型中，IFN-γ/細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1(signal transducer and activator of transcription1，STAT1)/血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)信號通路發(fā)揮了重要作用[10]。探討古日古木和古日古木-13對這條通路的影響可能揭示出它們的可能的分子內(nèi)作用機(jī)制之一，為它們在AIH中的應(yīng)用和進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

基于此，現(xiàn)應(yīng)用現(xiàn)代藥理學(xué)方法探討蒙藥古日古木單、復(fù)方對Con A誘導(dǎo)的小鼠急性自身免疫性肝損傷的保護(hù)作用，探索它們對INF-γ/STAT1/VCAM-1信號通路的影響。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c小鼠，體重(18±2) g，雌性，8～10周齡，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2011-0004。小鼠飼養(yǎng)于室溫、濕度55%、12 h晝夜節(jié)律的環(huán)境中，不限食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥物與試劑

古日古木，即紅花草藥，購自同仁堂大藥房。古日古木-13(紅花清肝十三味丸)，由內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：150152。用研缽將古日古木研磨成細(xì)粉，過80目篩。加1%吐溫80研磨均勻，分別加蒸餾水溶解并稀配成40、80、160 mg/kg混懸液，用即古日古木低劑量、中劑量、高劑量灌胃液，用前搖勻。古日古木-13灌胃液配制方法同古日古木。

地塞米松磷酸鈉注射液，由鄭州卓峰制藥有限公司生產(chǎn)，批號：150722184，加入生理鹽水配制成0.002 mg/kg的灌胃液。丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定試劑盒(批號：201603)；堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(批號：201601)；刀豆蛋白A(SLBR620V,Sigma公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測定試劑盒(批號：201601-1)；干擾素-γ(IFN-γ)測定試劑盒(批號：201603-4)(南京博爾迪公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：4293719，BD公司)；兔單克隆抗VCAM1抗體(批號：GR257919-27)；羊抗兔抗IgG抗體(批號：GR297013-1)兔多克隆抗STAT1抗體(批號：GR1095-11)；α-Tublin(批號：GR286515-3)(Abcam公司)；兔多克隆p-STAT1抗體(批號：0018，Cell Signaling 公司)NC膜(0.45 μmol/L，批號：MM0006，Pull公司)；ECL Western Blot顯色試劑盒(批號：RE230466)；BCA蛋白定量試劑盒(批號：RL242684，Thermo 公司)。

1.3 主要儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀Multiskan MK3(美國Thermo公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Mastercycler Gradient高速低溫離心機(jī)(德國eppendorf公司)；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(BD公司)；LeicaCTR6000熒光顯微鏡(Leica 公司)；Tanon-5200化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(北京原平皓生物技術(shù)公司)。

2 方法

2.1 動物分組給藥與模型建立

90只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為9組，即空白對照組、模型對照組、陽性對照組、古日古木低、中、高劑量組、古日古木-13低、中、高劑量組。古日古木和古日古木-13低、中、高各劑量組分別給予古日古木和古日古木-13 400、800、1 600 mg/kg進(jìn)行灌胃；陽性對照組給予0.02 mg/kg地塞米松灌胃；空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃7 d。末次給藥1 h后，尾靜脈注射給予除空白對照組外各組小鼠20 mg/kg的Con A。

2.2 細(xì)胞因子檢測

小鼠麻醉下心臟取血，室溫下靜置30 min，1 000 r/min,低溫離心20 min，分離血清。酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中TNF-α和IFN-γ水平。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 TUNEL 法檢測肝細(xì)胞凋亡

TdT-mediated dUTP Nick-End labeling(TUNEL)檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)說明書說明進(jìn)行操作。將組織石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K(proteinase K) 37 ℃反應(yīng)30 min，磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)洗3遍。用配置好的TUNEL反應(yīng)液37 ℃避光反應(yīng)60 min，PBS洗3次。Streptavidin-Fluorescein標(biāo)記液37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗3次。DAB(diaminobenzidine)顯色，蘇木素復(fù)染3 s后沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測肝細(xì)胞凋亡

取新鮮的肝組織剪碎制成細(xì)胞懸液，加入結(jié)合緩沖液(1×binding Buffer)重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為106cells/mL，每管加5 μL 膜聯(lián)蛋白V(annexin V)和2.5 μL碘化丙啶(propidine iodide, PI)于重懸細(xì)胞液中，避光孵育15 min，最后加400 μL 1×binding Buffer后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，Annexin V為綠色熒光代表早期凋亡細(xì)胞，PI將核染為紅色，標(biāo)記中晚期凋亡細(xì)胞。

2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)檢測各組小鼠肝組織STAT1、p-STAT1、VCAM-1表達(dá)

提取小鼠肝細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量，聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，電轉(zhuǎn)2 h，脫脂奶粉封閉，加入一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h，洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗3次，每次10 min；超敏化學(xué)發(fā)光顯影液發(fā)光，儀器攝影。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果分析

3.1 對小鼠血清中炎性細(xì)胞因子水平的影響

與空白對照組相比，模型對照組TNF-α和IFN-γ水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型對照組相比，古日古木-13中、高劑量TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。古日古木高劑量組、古日古木-13對自身免疫性肝損傷有保護(hù)作用且作用強(qiáng)度呈劑量依賴性，保護(hù)作用可能是通過降低炎性細(xì)胞因子IFN-γ實(shí)現(xiàn)的，如表1所示。

表1 對ConA所致小鼠肝損傷TNF-α、IFN-γ活力的影響Table 1 Effect of TNF-α and IFN-γ activity in liver injury induced by Con A in mice

3.2 古日古木、古日古木-13對肝細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL標(biāo)記定位于肝細(xì)胞核，正常肝細(xì)胞核藍(lán)染，凋亡肝細(xì)胞核呈棕黃色?？瞻讓φ战M肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞核呈藍(lán)色且體積較大。模型對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，界限不清，絕大部分細(xì)胞核皺縮并出現(xiàn)棕黃色著染，提示這些這些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生凋亡，其余未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象。各給藥組的肝細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞核皺縮、著染。其中古日古木各劑量組著染程度較重，古日古木-13各劑量組著染程度較輕，提示復(fù)方各劑量組對干細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用較顯著，尤其是復(fù)方中劑量組和高劑量組，如圖1所示。

圖1 TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡(10×40)Fig.1 Apoptosis was measured by TUNEL staining(10×40)

由圖2和表2可知，流式細(xì)胞儀 (flow cytometry，F(xiàn)CM)測凋亡能力結(jié)果顯示：與空白對照組相比，模型對照組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，古日古木和古日古木-13各劑量組均能明顯降低肝細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)，說明經(jīng)過古日古木和古日古木-13處理后，大鼠肝細(xì)胞凋亡能力降低。其中古日古木低劑量組、中劑量組降低幅度較小，其余4組降低幅度較大，但4組間沒有顯著差異。另外，古日古木、古日古木-13各劑量組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于陽性對照組。

圖2 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Hepatocytes apoptosis in each group

表2 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡率比較Table 2 The apoptosis rate of hepatocytes in each group was compared

3.3 Western Blot檢測肝組織內(nèi)STAT1、p-STAT1和VCAM-1蛋白表達(dá)情況

Western Blot結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型組小鼠肝組織內(nèi)STAT1蛋白、p-STAT1蛋白和VCAM-1蛋白表達(dá)量明顯升高。與模型組相比，除古日古木-13中劑量組外，其他給藥組STAT1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；除古日古木低劑量組外，其余給藥組p-STAT1蛋白均顯著降低(P<0.05)，尤其是古日古木-13高劑量組。所有給藥組的VCAM-1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，尤其是古日古木-13高劑量組和古日古木-13低劑量組。提示藥物影響上述蛋白分子的表達(dá)方面劑量依賴性不明顯。如圖3和圖4所示。

圖3 蛋白印跡檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of apoptosis related proteins was tested by western blot

*為與空白對照組比較， P<0.05；#為與模型組比較， P<0.05圖4 蛋白印跡檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of apoptosis related proteins was tested by western blot

4 討論

目前鮮有針對AIH病因的治療，主要采用非特異性免疫抑制：潑尼松龍或者與免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用。但約有70%應(yīng)用免疫抑制劑停藥后會再次復(fù)發(fā)[11]?；诿伤幑湃展拍竞凸湃展拍?13在肝病治療中已經(jīng)具備大量臨床成功經(jīng)驗(yàn)，探索它們在自身免疫性肝炎中的治療作用和作用機(jī)制，可能提供新的更為安全的治療手段。刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)的免疫性肝損傷動物模型[12]。Con A是一種提取自刀豆的可以促進(jìn)T細(xì)胞有絲分裂的植物凝集素,它可以刺激T細(xì)胞，快速誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高和大量T細(xì)胞浸潤，繼而引發(fā)肝臟組織壞死，導(dǎo)致AIH[13]。常見的給藥劑量為10～30 mg/kg，常見取樣時間則以給藥后4～24 h[14]，由前期實(shí)驗(yàn)的血清生化檢測結(jié)果可知，給予小鼠20 mg/kg Con A刺激16 h后進(jìn)行取樣可以得到理想的急性免疫性肝損傷模型。

AIH的發(fā)病機(jī)制，較為公認(rèn)的觀點(diǎn)是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)[13]。文獻(xiàn)[15-17]發(fā)現(xiàn)TNF-α和INF-γ是自身免疫性肝細(xì)胞損傷的病原學(xué)原因，Mizuhara等[18]、Gantner等[19]發(fā)現(xiàn)Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損傷與TNF-α有關(guān)。Wang等[20]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TNF-α和IFN-γ都是ConA誘導(dǎo)肝炎的主要介質(zhì)。TNF-α以其可溶性形式和膜結(jié)合前體形式參與介導(dǎo)Con A肝炎，抑制細(xì)胞分裂并促進(jìn)凋亡。而IFN-γ可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活化與增殖，促進(jìn)主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ的表達(dá)，因此參與肝損傷的形成[12-13,21]。已經(jīng)上市的已經(jīng)上市的TNF-α中和抗體英夫利昔單抗對AIH具有臨床療效，但僅僅體現(xiàn)在個別病例上，尚無大規(guī)模的研究證明[22-24]。而目前已經(jīng)在使用的干擾素中和性抗體類藥物主要是IFN-α類，用于治療病毒性肝炎，在治療AIH方面鮮有報道[25]。本文研究中發(fā)現(xiàn)古日古木-13中、高劑量給藥組對TNF-α有明顯的降低作用，古日古木中、高劑量組、古日古木-13所有劑量對IFN-γ有明顯的降低作用。說明藥物對IFN-γ的影響更為顯著。提示藥物對AIH的保護(hù)作用主要是通過降低炎性細(xì)胞因子IFN-γ來實(shí)現(xiàn)的。

肝損傷發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)多種機(jī)制都可以參與誘導(dǎo)受損的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，如Fas介導(dǎo)、肝內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞凋亡減少導(dǎo)致的的肝細(xì)胞凋亡等[26]。原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法和流式細(xì)胞術(shù)是兩種檢測細(xì)胞凋亡常用的方法。TUNEL法能夠精確定位組織切片上的凋亡細(xì)胞，敏感性極高，但它只能標(biāo)記中、晚期凋亡細(xì)胞，且凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)時易受主觀因素的影響；而流式細(xì)胞術(shù)具有簡單、快速、準(zhǔn)確的有點(diǎn)，但它不能區(qū)分晚期凋亡與壞死細(xì)胞[27]。本文研究中利用兩種方法檢測給與Con A后小鼠肝細(xì)胞的凋亡情況，互相印證、補(bǔ)充。結(jié)果表明古日古木、古日古木-13各個劑量組均能夠明顯抑制Con A引起的肝細(xì)胞的凋亡，尤其是古日古木高劑量組和古日古木-13的三個劑量組。但這4組間的細(xì)胞凋亡率并不存在顯著差異，與預(yù)想的劑量依賴趨勢并不符合。這說明，提高濃度也許并不能增加古日古木-13的抗凋亡效果。

IFN-γ受體由IFNGR1和IFNGR2兩個亞單位組成，與IFN-γ結(jié)合后，它們分別引起JAK1和AK2活化。活化的JAKs磷酸化IFN-γ受體的胞內(nèi)部分，進(jìn)而引起STAT1的Tyr-701殘基磷酸化。磷酸化的STAT1自受體結(jié)合部位釋放入細(xì)胞形成二聚體之后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，包括一氧化氮合酶(iNOS)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)和IFN-γ誘生的單核因子(Mig)，以及干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1)[28-29]。IRF-1是一種可以調(diào)控若干抗病毒和抗凋亡基因、調(diào)節(jié)機(jī)體對病原體的固有免疫及適應(yīng)性免疫的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，Con A肝炎發(fā)生時，小鼠體內(nèi)的IRF-1表達(dá)明顯增加[30]，且IRF-1-/-小鼠對Con A敏感度降低[31]。INF-γ/STAT1/IRF-1信號通路可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞間黏附分子-1(ICM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、CC類趨化因子配體-20(CCL-20),上皮來源的中性粒細(xì)胞活化肽-78 (ENA-78)，干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞α趨化因子(I-TAC)、Mig以及IP-10等多種趨化因子和黏附分子，它們促進(jìn)白細(xì)胞的浸潤，發(fā)揮促炎作用參與AIH的形成[32]。結(jié)果表明，古日古木和古日古木-13對INF-γ/STAT1信號通路有影響，尤其是古日古木-13高劑量組最為明顯，抑制INF-γ/STAT1信號通路并減少其下游分子VCAM-1的表達(dá)很有可能是藥物抑制AIH的作用機(jī)制之一。

5 結(jié)論

綜上所述，古日古木和古日古木-13均能不同程度的保護(hù)Con A導(dǎo)致的小鼠急性自身免疫性肝損傷，其機(jī)制可能是通過降低炎癥因子的釋放、減輕肝臟組織學(xué)改變、抑制INF-γ/STAT1信號通路及其下游效應(yīng)分子VCAM-1，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，同時減輕肝細(xì)胞凋亡來發(fā)揮保護(hù)肝臟作用的。