吳金蘭，萬(wàn)福生

(南昌大學(xué)a.第四附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)科；b.醫(yī)學(xué)部生化與分子生物學(xué)教研室，南昌330006)

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首[1-2]，其侵襲轉(zhuǎn)移特性是病死率高的重要原因。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis associated in colon cancer 1，MACC1)最早被發(fā)現(xiàn)是與結(jié)腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。近幾年發(fā)現(xiàn)MACC1異常表達(dá)與胃癌[4-5]、乳腺癌[6]和肺癌[7]等的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，但對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖與凋亡研究較少。磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(phophatidylinsotitol-3-kinase，PI3K)/絲/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)，參與細(xì)胞代謝[8-10]、細(xì)胞增殖與分化、凋亡等過(guò)程[11-12]，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。本研究以卵巢癌SKOV3細(xì)胞株為對(duì)象，觀察沉默MACC1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖、凋亡與遷移的影響，并從PI3K/AKT信號(hào)通路方面探討其分子機(jī)制，以期為后續(xù)更多的防治研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體

人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)于北京腫瘤醫(yī)院。MACC1抗體、PCNA抗體、PI3K抗體、p-AKT抗體及cleaved caspase 3抗體購(gòu)于美國(guó)abcam公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于美國(guó)Ameresco公司；AnnexinV-FIFC/PI購(gòu)于南京凱基公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶及PBS購(gòu)于北京Solarbio公司；siRNA MACC1及siRNA陰性由廣州銳博有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

SKOV3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)分3組：正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和si-MACC1組。正常對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)后更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；陰性對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA 6 h；si-MACC1組：常規(guī)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染si-MACC1 6 h。所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 western blot法檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路及增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集3組細(xì)胞并用裂解液提取總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，根據(jù)分組分別取30 μg總蛋白加樣電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜浸入TBST封閉液中封閉2 h。之后將膜與一抗MACC1、PI3K、cleaved caspase3、p-AKT、PCNA抗體(1:200)等在4℃孵育過(guò)夜后，用TBST液洗滌3次，加入二抗(1:2000)室溫孵育2 h。最后，在暗室內(nèi)加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑ECL進(jìn)行顯色。將膠片進(jìn)行掃描，以GAPDH內(nèi)參條帶為參照，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

3組細(xì)胞均調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×104mL-1，取200 μL細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。各孔加入20 μL(0.5 μg·mL-1)MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后倒掉上清液，向每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)終止反應(yīng)，震蕩混勻10 min，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm)處測(cè)定各孔光密度OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

用聚碳酸酯微孔膜(孔徑8.0 μm)的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。步驟如下：將3組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105mL-1，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，取200 μL的細(xì)胞懸浮液加入小室的上室，下室加入10%胎牛血清500 μL的完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，取出膜，用棉簽輕輕拭去上室表面的細(xì)胞，用甲醛固定，結(jié)晶紫染色。100倍的光鏡下進(jìn)行拍照，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)視野的細(xì)胞，取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

按凋亡試劑盒操作說(shuō)明操作，取轉(zhuǎn)染后48 h的3組細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液潤(rùn)洗2次，離心后棄上清液，加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，制成1～5×105mL-1的單細(xì)胞懸液，按試劑盒說(shuō)明分別加入5 μL染料AnnexinⅤ和PI，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組MACC1蛋白表達(dá)水平

western blot檢測(cè)SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后MACC1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示si-MACC1組MACC1的蛋白低于正常對(duì)照組或陰性對(duì)照組(均P<0.01)，而陰性對(duì)照組的MACC1蛋白水平與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

**P<0.01，與正常和陰性對(duì)照組比較。圖1 各組SKOV3細(xì)胞中MACC1蛋白的表達(dá)(western blot法)

2.2 各組細(xì)胞增殖比較

MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示si-MACC1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD490值均低于正常對(duì)照組或陰性對(duì)照組(均P<0.05)，而陰性對(duì)照組的OD490值與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

*P<0.05，與正常和陰性對(duì)照組比較。圖2 各組SKOV3細(xì)胞的增殖(MTT法)

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-MACC1組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著少于正常對(duì)照組或陰性對(duì)照組(均P<0.05)，陰性對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

*P<0.05，與正常和陰性對(duì)照組比較。圖3 各組SKOV3細(xì)胞的遷移能力(×100)(Transwell法)

2.4 各組SKOV3細(xì)胞凋亡比較

采用AnnexinⅤ/PI雙染色法處理各組細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和si-MACC1組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.22±0.32)%、(4.31±0.12)%和(11.08±0.15)%，與正常對(duì)照組比較，si-MACC1組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，而與陰性對(duì)照組的凋亡率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

**P<0.01，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較。圖4 各組SKOV3細(xì)胞的凋亡率(流式細(xì)胞術(shù)法)

2.5 各組PI3K/AKT信號(hào)通路及增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，si-MACC1組SKOV-3細(xì)胞中PCNA、PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組或陰性對(duì)照組均有顯著性下降(均P<0.05)，cleaved caspase3蛋白表達(dá)呈顯著性上升(P<0.05)，而陰性對(duì)照組的PCNA、PI3K、p-AKT、和cleaved caspase3蛋白水平與正常對(duì)照組相比均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

ΔP<0.05，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較。圖5 各組PI3K/AKT信號(hào)通路及增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)(western blot法)

3 討論

卵巢癌發(fā)病比較隱匿，加之缺乏特異性的臨床表現(xiàn)及有效的早期診斷方法，大部分患者在就診時(shí)已屬腫瘤晚期，伴有廣泛的盆腹腔浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移或腹水形成[2]。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡率高的主要原因之一。MACC1是由STEIN等[3]在2009年發(fā)現(xiàn)的，通過(guò)基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)其是一種與結(jié)腸癌密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，因此命名為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。后續(xù)多項(xiàng)研究[4-7]顯示MACC1在多種腫瘤組織細(xì)胞中呈高表達(dá)。WEI等[4]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中MACC1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，下調(diào)MACC1抑制了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。郭宏艷等[6]用免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌腫瘤直徑越大，分化越差，惡性度越高，MACC1陽(yáng)性表達(dá)越高。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MACC1基因可使卵巢癌細(xì)胞的增殖下降、細(xì)胞遷移能力明顯降低，而細(xì)胞的凋亡率增加，這提示MACC1在卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移方面具有重要作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路是一種胞內(nèi)傳導(dǎo)的信號(hào)通路，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，在大多數(shù)腫瘤中該通路處于激活狀態(tài)。有研究[13]證實(shí)，阻斷該信號(hào)通路可提高腫瘤的治療效果。PI3K/AKT信號(hào)通路主要包括兩個(gè)部分組成：PI3K和AKT。PI3K可引起AKT的磷酸化，磷酸化AKT參與細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程[14]。有研究[15]表明PI3K/AKT信號(hào)通路的激活是實(shí)體瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和生存的重要決定因素。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受多個(gè)因素的調(diào)控，其中細(xì)胞的增殖與凋亡失衡是引起腫瘤的重要原因。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)代表著細(xì)胞的增殖活性，被認(rèn)為是細(xì)胞增殖狀態(tài)的理想預(yù)后標(biāo)志物[16]。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用，其中半胱氨酸蛋白酶3剪切體(cleaved caspase3)是激活各種凋亡酶激活因子的關(guān)鍵蛋白酶，在線粒體參與的凋亡途徑中具有重要作用[17]。周斌等[14]研究抑制MACC1基因可上調(diào)cleaved caspase3蛋白，下調(diào)PCNA及PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白降低子宮內(nèi)膜癌增殖活性，促進(jìn)凋亡。宋爽等[18]發(fā)現(xiàn)，沉默MACC1的表達(dá)能顯著抑制人食管癌細(xì)胞增殖，并通過(guò)上調(diào)cleaved caspase3蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。與這些研究相類(lèi)似，本研究發(fā)現(xiàn)，抑制MACC1表達(dá)后PI3K、p-AKT和PCNA蛋白表達(dá)量下調(diào)，而cleaved caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)。除了PI3K/AKT信號(hào)通路，有多個(gè)研究[19-24]報(bào)道MACC1與其他信號(hào)通路之間也有著聯(lián)系。例如，金思豪等[19]報(bào)道MACC1在肺腺癌中呈高表達(dá)，并能增強(qiáng)β-catenin的表達(dá)，從而促進(jìn)肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。王瑋尉等[21]發(fā)現(xiàn)MACC1在胃癌患者血清及胃癌組織中均高表達(dá)，且表達(dá)水平呈正相關(guān)。鄭建坤等[22]證實(shí)MACC1和TK1的表達(dá)均與前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，沉默MACC1能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，降低細(xì)胞遷移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，提示MACC1可能是卵巢癌防治中的新靶點(diǎn)。但本研究?jī)H基于體外細(xì)胞水平的研究結(jié)果，MACC1與卵巢癌更為確切的關(guān)系仍需在組織和體內(nèi)水平進(jìn)行更為深入地探討。