陽(yáng) 莉， 胡 元， 陳曉燕 ，黃夢(mèng)淳，盧建溪?

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣東 廣州 510000；2.東莞長(zhǎng)安港灣醫(yī)院內(nèi)科 ，廣東 東莞 523000）

免疫療法作為繼手術(shù)、化療和放療之后治療惡性腫瘤的第四種方法，近年來正在快速發(fā)展并受到廣泛關(guān)注。目前，臨床上使用的免疫療法包括免疫檢查點(diǎn)阻斷劑療法、細(xì)胞因子療法、分子靶向療法和過繼免疫療法等[1-3]。過繼免疫療法又叫免疫細(xì)胞療法，是指取患者自體淋巴細(xì)胞或免疫力強(qiáng)的健康供者的淋巴細(xì)胞，經(jīng)體外活化、擴(kuò)增后，再回輸至患者體內(nèi)以發(fā)揮抗腫瘤作用的一種治療手段。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是人體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，負(fù)責(zé)殺傷老化細(xì)胞、感染病毒的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等異常細(xì)胞。NK 細(xì)胞的這種天然殺傷活性無需抗原致敏，且無主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性，能自動(dòng)識(shí)別并攻擊受病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等異常細(xì)胞。NK細(xì)胞由于其獨(dú)特的抗腫瘤特點(diǎn)，在腫瘤免疫治療中的作用越來越受到重視[4-8]。人體外周血中NK 細(xì)胞的數(shù)量較少，且腫瘤患者體內(nèi)NK 細(xì)胞的活性較低，故需要在體外活化和擴(kuò)增NK 細(xì)胞，使其達(dá)到一定數(shù)量后再回輸至患者體內(nèi)，這樣才能發(fā)揮更好的抗腫瘤作用。本研究主要是探討NK 細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞數(shù)量、免疫表型及殺傷活性的變化趨勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主 要 儀 器 與 試 劑 ALYS505NK-AC 培 養(yǎng) 液 和ALYS505NK-EX 培養(yǎng)液（由日本CSTI 公司生產(chǎn)），重組人白細(xì)胞介素-2（由山東泉港藥業(yè)生產(chǎn)），人淋巴細(xì)胞分離液（由挪威Axis-shield 公司生產(chǎn)），赫賽汀（由美國(guó)Roche 公司生產(chǎn)），淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3（由美國(guó)Beckman Coulter 公司生產(chǎn)），K562 細(xì)胞株（本實(shí)驗(yàn)室保存），細(xì)胞培養(yǎng)袋（由日本Takara 公司生產(chǎn)），倒置顯微鏡（由日本Nikon 公司生產(chǎn)），CytoFLEX 流式細(xì)胞分析儀（由美國(guó)Beckman Coulter 公司生產(chǎn)），Centrifuge 5810R 離心機(jī)（由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)），240i 二氧化碳培養(yǎng)箱（由美國(guó)Thermo Scientific 公司生產(chǎn)）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 采用本中心的NK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，分別對(duì)10 份健康人的外周血進(jìn)行NK 細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 外周血NK 細(xì)胞的培養(yǎng) 采用無血清培養(yǎng)法對(duì)外周血NK 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，方法是：采用密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），用ALYS505NK-AC 培養(yǎng)液對(duì)PBMCs 進(jìn)行重懸處理，將細(xì)胞密度調(diào)整至（1 ～3）×106/mL后裝入預(yù)先用赫賽汀包被好的培養(yǎng)瓶中，并置于37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3 d 用ALYS505NK-EX 培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)液。

1.2.2 外周血NK 細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)、表型分析及殺傷活性檢測(cè) 分別在培養(yǎng)的第0 天、第4 天、第8 天、第12天、第16 天和第20 天對(duì)培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行取樣，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率的測(cè)定，并用淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3 在流式細(xì)胞儀上測(cè)定外周血NK（CD3-CD56+）細(xì)胞和NKT（CD3+CD56+）細(xì)胞的比例。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)NK 細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞的存活率。采用CFSE/PI 雙染法檢測(cè)NK 細(xì)胞的殺傷活性，具體步驟是：1）標(biāo)記靶細(xì)胞。將K562 細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×106/mL，加入熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰 亞 胺 酯（carboxyfluorescein diacetate n-succinimidyl ester，CFSE）對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，在37 ℃下避光染色20 min。加入5 倍體積預(yù)冷的含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，冰浴5 min，終止染色，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×105/mL。2）共培養(yǎng)。加入1.0×106/mL 的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為10:1，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然凋亡對(duì)照孔，在250 g 的離心力下離心5 min 后置于37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育4 h。3）標(biāo)記細(xì)胞。采用熒光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）標(biāo)記死亡細(xì)胞，在24℃下避光染色30 min 后用生理鹽水洗去未結(jié)合的染料。4）上機(jī)檢測(cè)及分析。采用CytoFLEX 流式細(xì)胞儀對(duì)外周血NK 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。計(jì)算公式：靶細(xì)胞的殺傷率=（靶細(xì)胞的死亡率-靶細(xì)胞的自然凋亡率）/（100- 靶細(xì)胞的自然凋亡率）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計(jì)軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，重復(fù)測(cè)量資料用±s表示，采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血NK 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

在培養(yǎng)的第2 天～第3 天，培養(yǎng)基中開始形成細(xì)胞集落，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞集落逐漸變大，數(shù)量也隨之增多，肉眼可見許多小顆粒懸浮物，在顯微鏡下可見這些小顆粒懸浮物為懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆團(tuán)。

2.2 外周血NK 細(xì)胞的免疫表型變化

采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外周血NK 細(xì)胞中CD3-CD56++細(xì)胞和CD3+CD56+細(xì)胞的有效細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，至第16 天后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細(xì)胞中CD3-CD56++細(xì)胞和CD3+CD56+細(xì)胞的比例相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1、圖3、表1。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間NK 細(xì)胞的比例

2.3 外周血NK 細(xì)胞的擴(kuò)增效率和殺傷活性

在培養(yǎng)的第8 天～第20 天（快速增殖期），不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細(xì)胞的存活率均＞95%。細(xì)胞總數(shù)由培養(yǎng)初始的（1.15e×107±0.10×107）個(gè)，至第20 天達(dá)到了（4.78×109±1.63×109）個(gè)，擴(kuò)增了（602.20±210.70）倍。不同時(shí)間點(diǎn)（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在效靶細(xì)胞比例為10:1、孵育4 h 的條件下，檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)外周血NK 細(xì)胞的殺傷活性發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細(xì)胞的殺傷活性相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖2、表1。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間外周血NK 細(xì)胞的殺傷活性

2.4 外周血NK 細(xì)胞擴(kuò)增效率及殺傷活性的變化趨勢(shì)

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外周血中NK 細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加，不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細(xì)胞的數(shù)量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NK 細(xì)胞的殺傷活性從培養(yǎng)第8 天開始升高，至第12 天達(dá)到峰值后開始下降，不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細(xì)胞的殺傷活性相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NK 細(xì)胞的比例先增加后下降（培養(yǎng)至16 d 達(dá)到峰值后開始下降），其比例的下降趨勢(shì)較殺傷活性的下降趨勢(shì)滯后。不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細(xì)胞的比例相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1、圖3。綜合考慮外周血NK 細(xì)胞的存活率、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞比例和殺傷活性等因素，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)第12 天～第16天外周血NK 細(xì)胞的綜合質(zhì)量較優(yōu)，此時(shí)間段為患者回輸NK 細(xì)胞較為合適。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間外周血NK 細(xì)胞的擴(kuò)增效率、比例和殺傷活性（n=10，± s）

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間外周血NK 細(xì)胞的擴(kuò)增效率、比例和殺傷活性（n=10，± s）

注：10:1 指效靶細(xì)胞比例為10:1，4 h 指孵育時(shí)間為4 h。

指標(biāo) 第4 天 第8 天 第12 天 第16 天 第20 天 F 值 P 值數(shù)量（×108） 0.58±0.19 3.74±1.15 12.59±3.19 24.62±6.23 47.77±16.28 8.236 0.025擴(kuò)增倍數(shù) 5.35±1.63 48.31±16.09 155.10±37.36 293.90±63.27 602.20±210.70 6.503 0.041 CD56+細(xì)胞的數(shù)量（%） 47.25±3.27 61.76±2.74 70.07±3.23 73.20±4.90 65.69±6.60 31.170 ＜0.001殺傷活性（%）（10:1，4 h） 16.95±4.24 25.26±5.63 34.21±4.59 28.07±3.27 24.50±3.21 6.587 0.010

3 討論

NK 細(xì)胞可通過釋放顆粒酶和穿孔素等殺傷性介質(zhì)及分泌大量細(xì)胞因子直接攻擊靶細(xì)胞，或通過抗體依賴的細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞，或通過誘導(dǎo)Fas/Fasl 和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）分子使靶細(xì)胞凋亡，進(jìn)而可起到抗腫瘤的作用[9]。通常情況下，人體內(nèi)NK 細(xì)胞的生存周期較短，一個(gè)成年人體內(nèi)約含有2×109個(gè)NK 細(xì)胞[10]。通過向惡性腫瘤患者體內(nèi)輸注經(jīng)體外活化擴(kuò)增的NK 細(xì)胞，可使其體內(nèi)NK 細(xì)胞的數(shù)量提升約兩倍。本研究?jī)?yōu)化了NK 細(xì)胞的體外活化擴(kuò)增方案，建立了一種NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)基中只需將白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）的濃度維持在1000 IU/mL，經(jīng)過約兩周的培養(yǎng)就可使總細(xì)胞數(shù)達(dá)到約600 倍的擴(kuò)增，其中NK 細(xì)胞的比例高達(dá)80%。此方法雖然在擴(kuò)增效率及提取純度方面低于滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)法，但能滿足臨床使用的要求，且安全性較高。目前，臨床常用的NK 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間一般為14 d 左右[4]。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然NK 細(xì)胞的數(shù)量會(huì)不斷增加，但細(xì)胞的殺傷活性會(huì)逐漸下降，因此并不是培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。NK 細(xì)胞在臨床使用的過程中，受患者自身狀態(tài)、醫(yī)學(xué)檢查、用藥或接受其他治療等因素的影響，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞回輸時(shí)間需要提前或推后的情況。為了使患者達(dá)到最佳的治療效果，本文深入研究了外周血中NK 細(xì)胞數(shù)量、比例和殺傷活性的變化趨勢(shì)，明確了NK 細(xì)胞臨床應(yīng)用的時(shí)間窗。

綜上所述，采用無血清培養(yǎng)法對(duì)外周血NK 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外周血NK 細(xì)胞的數(shù)量呈逐漸增加的趨勢(shì)。外周血NK 細(xì)胞的殺傷活性在培養(yǎng)12 d 后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在培養(yǎng)的第12 天～第16 天，NK 細(xì)胞的殺傷活性較強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞純度較高，此階段細(xì)胞的質(zhì)量較好，是臨床應(yīng)用的最佳時(shí)期。采用無血清培養(yǎng)法體外擴(kuò)增NK 細(xì)胞的效率較高。