崔 進(jìn)，張秀娟，祝 倩

（濰坊市婦幼保健院，山東 濰坊 261000）

據(jù)調(diào)查，在發(fā)生自然流產(chǎn)的孕婦中，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦占1% ～5%[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與孕婦的染色體異常、子宮結(jié)構(gòu)及功能異常、發(fā)生感染、內(nèi)分泌功能紊亂、存在自身免疫系統(tǒng)疾病等因素有關(guān)[3-5]。Klotho 蛋白是1997 年發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老蛋白[6]。Klotho蛋白可參與到心血管疾病、腎臟損傷、腫瘤、代謝病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中[7]。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，Klotho 蛋白在子癇前期、子宮內(nèi)膜異位癥、早產(chǎn)等婦產(chǎn)科疾病患者體內(nèi)呈異常表達(dá)。有研究者認(rèn)為，Klotho 蛋白可能通過(guò)與其受體結(jié)合影響相關(guān)信號(hào)的傳導(dǎo)通路[8]，引發(fā)基因突變、胚胎發(fā)育異常，進(jìn)而導(dǎo)致孕婦發(fā)生流產(chǎn)。本次研究主要是分析復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清及胚胎組織中Klotho 蛋白表達(dá)的水平。

本次研究的對(duì)象是2019 年3 月至10 月期間在濰坊市婦幼保健院進(jìn)行人工流產(chǎn)手術(shù)的80 例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦及同期該院收治的100 例胚胎正常要求流產(chǎn)的孕婦。將其中80 例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦設(shè)為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組，將其中100 例胚胎正常主動(dòng)要求流產(chǎn)的孕婦設(shè)為正常妊娠要求流產(chǎn)組。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組孕婦的平均年齡為（28.5±1.3）歲，其流產(chǎn)時(shí)的平均孕周為（7.8±0.3）周。本組孕婦進(jìn)行腹部超聲檢查的結(jié)果顯示其胚胎停止發(fā)育或孕7 周后多次腹部超聲檢查的結(jié)果提示其宮腔內(nèi)無(wú)胎芽及胎心搏動(dòng)。胚胎正常要求流產(chǎn)組孕婦的平均年齡為（26.5±1.8）歲，其流產(chǎn)時(shí)的平均孕周為（7.8±0.2）周。本組孕婦進(jìn)行腹部超聲檢查可見(jiàn)其宮腔內(nèi)存在胚芽及胎心搏動(dòng)。兩組孕婦的一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

本次研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)是：1）既往身體健康，無(wú)內(nèi)、外科疾病史；2）自然受孕；3）在此次妊娠的前3個(gè)月月經(jīng)正常。本次研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)是：1）存在妊娠期并發(fā)癥；2）在妊娠期間接受過(guò)藥物治療。

1.3 標(biāo)本采集方法

在對(duì)兩組孕婦進(jìn)行人工流產(chǎn)手術(shù)前，均抽取其4 mL的空腹靜脈血。對(duì)抽取的血液樣本進(jìn)行抗凝處理，然后放到離心機(jī)中進(jìn)行10 min 的離心處理，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000 r/min。將分離出的血清樣本放到-80℃的冰箱中保存。在對(duì)兩組孕婦進(jìn)行人工流產(chǎn)手術(shù)后的10 min 內(nèi)，取大小約0.8 cm×0.8 cm 的胚胎組織。使用生理鹽水對(duì)胚胎組織進(jìn)行3 次漂洗，將其分成兩份。將其中一份胚胎組織置入滅活RNA 酶凍存液中，并放到-80℃的冰箱中保存。將另一份胚胎組織使用10%甲醛固定液進(jìn)行固定，然后進(jìn)行石蠟包埋處理，制作成組織切片，放到60℃的烤箱中烘干，然后置于37℃的溫箱中保存。

1.4 檢測(cè)方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組孕婦血清中Klotho 蛋白的表達(dá)水平，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白的表達(dá)水平。嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。對(duì)切片組織進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)及DBA 顯色處理。將PBS 液代替一抗作為陰性對(duì)照品，將已知陽(yáng)性的胚胎組織作為陽(yáng)性對(duì)照品。Klotho 在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，鏡下表現(xiàn)為棕黃色顆粒。選取5個(gè)高倍鏡視野，將陽(yáng)性細(xì)胞占正常細(xì)胞的百分比作為評(píng)估進(jìn)行Klotho 蛋白檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。陽(yáng)性細(xì)胞占正常細(xì)胞的百分比＜5%，計(jì)0 分。陽(yáng)性細(xì)胞占正常細(xì)胞的百分比為5% ～20%，計(jì)1 分。陽(yáng)性細(xì)胞占正常細(xì)胞的百分比為21%～50%，計(jì)2 分。陽(yáng)性細(xì)胞占正常細(xì)胞的百分比＞50%，計(jì)3 分。若進(jìn)行Klotho 蛋白檢測(cè)結(jié)果的評(píng)分為0 分、1 分，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性。若進(jìn)行Klotho蛋白檢測(cè)結(jié)果的評(píng)分為2 分、3 分，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。在免疫組織化學(xué)圖像分析儀上計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和灰度值，由凝膠圖像分析處理系統(tǒng)完成圖像采集、定性和半定量檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理本次研究中的所有數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用%表示，采用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦血清Klotho 蛋白表達(dá)水平的比較

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組孕婦血清Klotho 蛋白的表達(dá)水平高于正常妊娠要求流產(chǎn)組孕婦，P＜0.05。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組孕婦血清Klotho 蛋白表達(dá)水平的比較（ng/dl，± s）

表1 兩組孕婦血清Klotho 蛋白表達(dá)水平的比較（ng/dl，± s）

注：a 表示與正常妊娠要求流產(chǎn)組相比，P ＜0.05。

組別 Klotho 蛋白復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組（n=80） 1.25±0.38 a正常妊娠要求流產(chǎn)組（n=100） 1.09±0.26 t 值 3.2410 P 值 0.0016

2.2 兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白表達(dá)水平的比較

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白的表達(dá)水平高于正常妊娠要求流產(chǎn)組孕婦，P＜0.05。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白表達(dá)水平的比較（ng/dl，± s）

表2 兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白表達(dá)水平的比較（ng/dl，± s）

注：a 表示與正常妊娠要求流產(chǎn)組相比，P ＜0.05。

組別 Klotho 蛋白復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組（n=80） 2.05±0.34a正常妊娠要求流產(chǎn)組（n=100） 1.66±0.35 t 值 7.4868 P 值 0.0013

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與孕婦的染色體異常、生殖器官結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌功能紊亂、感染等因素均有關(guān)。據(jù)調(diào)查，約有40% 的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦的病因不能明確，且此類孕婦再次妊娠時(shí)發(fā)生流產(chǎn)的幾率高達(dá)70%～80%[9]。

1997 年，研究者發(fā)現(xiàn)了Klotho 蛋白。人體可以通過(guò)多種方式調(diào)控Klotho 蛋白的表達(dá)水平[10-11]。例如，成纖維生長(zhǎng)因子-3 可提高Klotho 蛋白的表達(dá)水平[12-13]，腎素- 血管緊張素可以降低Klotho 蛋白的表達(dá)水平，從而發(fā)揮不同的生理作用。Klotho 蛋白的表達(dá)產(chǎn)物包括膜結(jié)合蛋白和分泌型蛋白。膜結(jié)合蛋白位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，胞外區(qū)的蛋白序列與葡萄糖苷酶相似。分泌型蛋白存在于血液循環(huán)中，是一種肽類激素。這兩種蛋白的高表達(dá)均可通過(guò)影響機(jī)體相關(guān)元素的代謝對(duì)血管產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用[14-15]。有報(bào)道指出，Klotho 蛋白亦參與到了腎病、不孕不育癥、皮膚萎縮、骨質(zhì)疏松癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，klotho蛋白可以調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）的信號(hào)通路，并可參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程。這提示，Klotho 蛋白在基因突變、蛋白質(zhì)空間構(gòu)象異常的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[16]。在本研究中，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組孕婦外周血及胚胎組織中Klotho蛋白的表達(dá)水平均高于正常妊娠要求流產(chǎn)組孕婦，原因是：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦體內(nèi)高表達(dá)的Klotho 蛋白與細(xì)胞膜上的Klotho 蛋白受體結(jié)合后，可改變細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，生成多種生物因子，并作用于母體的內(nèi)皮組織，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷及母體血管內(nèi)皮組織因子被激活，影響細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，引起基因突變、衰老甚至細(xì)胞死亡，進(jìn)而可導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育、孕婦發(fā)生流產(chǎn)。

本次研究的結(jié)果證實(shí)，與胚胎正常主動(dòng)要求流產(chǎn)的孕婦相比，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清及胚胎組織中Klotho 蛋白的表達(dá)水平較高。