付強(qiáng) 郭妍婷 陳俊貞 王金泉 史慧君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是導(dǎo)致牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea，BVD）的病原［1］。牛、羊、鹿等易感動(dòng)物感染BVDV后，會(huì)造成腹瀉、急和慢性黏膜病、病毒血癥、免疫耐受和持續(xù)感染、免疫抑制、繁殖障礙等癥狀［2］，是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一。國(guó)際獸疫局（Office International Des Epizooties，OIE）將BVD定為B類傳染病，在我國(guó)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫中也將其列為二類傳染病。

BVDV的非結(jié)構(gòu)蛋白p7，位于E2蛋白與NS2蛋白之間，分子量約7 kD，是主要由疏水氨基酸構(gòu)成的一個(gè)小分子肽［3］。由Harada和Carrere-Kremer等人最初提出BVDV和HCV的p7蛋白寡聚并形成離子通道［4］。因?yàn)閜7的離子通道活性使其被納入在病毒孔蛋白（Viroporin）家族中，Viroporin是一種小的疏水蛋白，當(dāng)這些蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞膜中寡聚時(shí)，它們會(huì)形成親水孔，增加膜的通透性，進(jìn)行離子和小分子運(yùn)動(dòng)，破壞細(xì)胞的許多生理特性［5-6］。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多的病毒能表達(dá)膜蛋白結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出細(xì)胞的離子通道樣的某些功能，以介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞、幫助病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)病毒釋放［7］。目前，針對(duì)BVDV p7的研究較少，p7寡聚形成離子孔道的機(jī)理尚不明確，抗p7抗體是開(kāi)展研究工作的必要工具。本試驗(yàn)通過(guò)合成p7蛋白的抗原表位多肽，免疫動(dòng)物后獲取多克隆抗體，為進(jìn)一步探索BVDV致病機(jī)制提供了有利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒和動(dòng)物 MDBK細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；BVDV毒株NADL為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)毒株，購(gòu)自中國(guó)藥品監(jiān)察所；新西蘭大白兔，體重約2.5-3.0 kg，購(gòu)自陜西西咸新區(qū)灃東新城實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2020040）。

1.1.2 主要試劑和耗材 弗氏完全/不完全佐劑（F5881）和明膠購(gòu)自Sigma公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker和透析袋10 kD購(gòu)自Thermo公司；細(xì)胞爬片購(gòu)自NEST公司；Proclin 300和Casein購(gòu)自北京索萊寶生物公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（SA00001）和 CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（SA00013）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液、BCA蛋白定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色、Triton X-100、小牛血清白蛋白BSA、山羊血清購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（111-7）、蛋白電泳槽和電源購(gòu)自Bio-Rad公司；NanodropTMOne（DS-11）購(gòu)自DeNovi+公司；恒溫振蕩器（B0101123）購(gòu)自太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM500）購(gòu)自德國(guó)蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 p7蛋白多肽抗原的設(shè)計(jì)與合成 使用蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)平臺(tái)JPred（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4 /index.html）進(jìn)行BVDV p7蛋白（GenBank登錄號(hào)NC_001461.1）的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)抗原表位，設(shè)計(jì)多肽并偶聯(lián)KLH載體蛋白形成MSQYGAGEIVMMGN-Cys-KLH，交由吉爾生化（上海）有限公司合成，并由該公司完成RP-HPLC檢測(cè)多肽純度和質(zhì)譜分析多肽分子量。

1.2.2 抗血清的制備 首次免疫前，對(duì)2只新西蘭大白兔進(jìn)行耳緣靜脈采血并分離血清，作為陰性對(duì)照。取多肽與等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑進(jìn)行充分乳化；對(duì)2只新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)免疫注射，首免使用弗氏完全佐劑，劑量為400 μg/只，濃度為1 mg/mL；此后使用弗氏不完全佐劑乳化多肽，每?jī)芍苓M(jìn)行一次免疫；第5次免疫PBS溶解的多肽，劑量為400 μg/只，濃度為2 mg/mL。免疫完成后對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行心臟采血，收集血清。

1.2.3 抗原親和柱制備 將多肽與溴代預(yù)活化的交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)Bromohydrin Purose?4 Fast Flow偶聯(lián)。先用10倍體積純水將基質(zhì)中乙醇洗凈，用篩選通過(guò)注射器抽干基質(zhì)；使用偶聯(lián)緩沖液（0.2 mol/L Na2CO3和 0.5 mol/L NaCl，pH 10） 溶 解 多 肽 成 7 mg/mL多肽溶液；將活化的基質(zhì)與多肽溶液按1∶1混合，25℃反應(yīng)約20 h；使用Nanodrop測(cè)定流出液的濃度并計(jì)算偶聯(lián)效率，大于95%表明多肽偶聯(lián)成功；偶聯(lián)結(jié)束后，用10倍柱體積的去離子水沖液洗去多肽溶液；添加1 mol/L乙醇胺反應(yīng)8 h，以封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)；反應(yīng)結(jié)束后用去離子水沖洗干凈。

1.2.4 抗原特異性抗體純化 將上述抗原親和基質(zhì)裝填重力柱，上樣前先用5倍柱體積0.1 mol/L，pH 9.5的Na2HPO4·12H2O沖洗親和柱，進(jìn)行柱平衡；加入抗血清，每次10 mL，棄去流出液；加入5倍柱體積的0.1 mol/L，pH 9.5 Na2HPO4·12H2O淋洗，棄去淋洗液；加入3倍柱體積的0.2 mol/L，pH 4.0 檸檬酸溶液洗脫抗體，收集洗脫液后立即加入1 mol/L，pH 8.0 Tris緩沖液中和；將洗脫抗體溶液使用PBS溶液透析2 h；0.22 μm濾器過(guò)濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 抗體效價(jià)檢測(cè) 使用pH 9.6碳酸鹽緩沖液將600 ng/孔多肽包被至96孔酶標(biāo)板，4℃孵育過(guò)夜；每孔加入200 μL封閉液（2%明膠、1‰ Proclin 300、5‰ Casein，PBS配制），37℃孵育2 h；對(duì)純化后的抗體進(jìn)行10倍比梯度稀釋，稀釋比依次從1∶10-1∶1×1012；按照每孔100 μL將稀釋后的抗體加入各孔中，37℃孵育1 h；每孔100 μL加入HRP標(biāo)記羊抗兔 IgG（H+L）（稀釋度 1∶5 000），37℃孵育 30 min；TMB 顯色液顯色10 min后，使用2 mol/L稀硫酸終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。檢測(cè)孔OD450nm值平均值/陰性對(duì)照孔OD450nm平均值 ＞ 2.1則判定為陽(yáng)性；可檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)的抗體最低稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。

1.2.6 抗體純度檢測(cè) 使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)抗體蛋白定量后，加入5×SDS-PAGE loading buffer混勻，100℃加熱10 min使蛋白變性。使用12%SDS-PAGE電泳分離5和10 μg變性蛋白，100 V電泳約2 h；使用考馬斯亮藍(lán)染色30 min，脫色液（30%甲醇、10%冰醋酸，PBS配制）脫色2 h。使用GeL Doc2000成像系統(tǒng)獲得圖像，并使用ImageJ分析p7抗體所占灰度值。

1.2.7 間接免疫熒光檢測(cè)多克隆抗體特異性 將MDBK細(xì)胞接種至鋪有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%時(shí)，接種1 000 TCID50BVDV感染24 h后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，使用4%多聚甲醛溶液固定15 min，加入0.5% TritonX-100孵育10 min，加入封閉液（0.5%Triton X-100、3% BSA、1%山羊血清，PBS配制）封閉1 h；加入p7多克隆抗體（稀釋度1∶100），4℃孵育過(guò)夜；使用CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（稀釋度1∶250）室溫孵育1 h，使用抗熒光淬滅封片液封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光陽(yáng)性情況及定位。

2 結(jié)果

2.1 p7蛋白多肽抗原的設(shè)計(jì)

為合成p7蛋白的多肽抗原，使用JPred預(yù)測(cè)p7蛋白抗原表位，結(jié)果如圖1所示，BVDV p7蛋白共由71個(gè)氨基酸所組成，其中綠色為β片層結(jié)構(gòu)，紅色為α螺旋結(jié)構(gòu)，其中B表示氨基酸疏水情況；在25% cut-off溶劑可及性時(shí)，p7蛋白的親水區(qū)域主要位于該蛋白的氨基端，設(shè)計(jì)MSQYGAGEIVMMGN多肽，并偶聯(lián)KLH載體蛋白以刺激輔助T細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫反應(yīng)，合成MSQYGA GEIVMMGNCys-KLH多肽。

圖1 P7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 1 Prediction of secondary structure of P7 protein

2.2 多肽純度和分子量檢測(cè)

使用RP-HPLC檢測(cè)多肽的純度，同時(shí)使用質(zhì)譜分析多肽的分子量。結(jié)果如圖2和3所示，合成多肽的保留時(shí)間為9.810 min，峰面積1 197 903（mAU*s），多肽的純度為 80.19%（1 197 903/1 493 847），合成的多肽分子量為794.2 Da。

圖2 RP-HPLC檢測(cè)多肽純度Fig. 2 Determination of polypeptide purity by RP-HPLC

2.3 p7多肽抗體效價(jià)檢測(cè)

圖3 質(zhì)譜鑒定多肽分子量Fig. 3 Identification of molecular weight of polypeptide by mass spectrometry

第5次免疫后10 d，心臟采血并收集血清，使用多肽偶聯(lián)的抗原純化柱進(jìn)行親和純化。間接ELISA檢測(cè)純化后、PBS對(duì)照組和免疫前的抗體反應(yīng)性。結(jié)果如表1所示，經(jīng)過(guò)親和純化后的抗體效價(jià)達(dá)1∶100 000（PBS對(duì)照組的陰性參考值為OD450nm=0.110），與抗原有顯著的反應(yīng)性，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

表1 間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)Table 1 Detection of antibody titer using indirect ELISA

2.4 SDS-PAGE檢測(cè)抗體純化結(jié)果

多抗血清通過(guò)多肽偶聯(lián)的抗原純化柱親和純化后，使用10 kD半透膜對(duì)純化血清進(jìn)行透析，并使用0.22 μm濾器過(guò)濾除雜質(zhì)。SDS-PAGE電泳后使用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定抗體純度。結(jié)果如圖4所示，在55 kD處可見(jiàn)抗體重鏈分子，在25 kD處可見(jiàn)輕鏈分子，使用ImageJ分析p7抗體所占灰度值比為90.2%。表明已純化出兔抗p7多肽IgG抗體。

圖4 SDS-PAGE 檢測(cè)抗體純化結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE results of antibody purification

2.5 免疫熒光染色鑒定p7多肽多克隆抗體

為進(jìn)一步鑒定多克隆抗體的反應(yīng)性，使用免疫熒光染色鑒定BVDV感染MDBK細(xì)胞p7蛋白表達(dá)及分布情況。結(jié)果如圖5所示，BVDV感染MDBK細(xì)胞后表達(dá)的p7蛋白能與p7多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，可見(jiàn)紅色熒光廣泛分布于BVDV感染MDBK細(xì)胞的細(xì)胞膜周圍，與p7寡聚在細(xì)胞膜上形成離子孔道的蛋白分布一致，而對(duì)照組細(xì)胞則無(wú)法檢測(cè)到紅色熒光，表明p7多肽多克隆抗體具有較好的反應(yīng)性和特異性。黑色箭頭指示細(xì)胞核。

圖5 免疫熒光染色測(cè)定p7多肽多克隆抗體的反應(yīng)性Fig. 5 Determination of the reactivity of p7 polypeptide polyclonal antibody by immunofluorescence staining

3 討論

病毒進(jìn)入宿主后，病毒孔蛋白與宿主細(xì)胞中的不同細(xì)胞器膜相互作用，借助宿主細(xì)胞某些因子組裝成離子通道，介導(dǎo)一些離子（Na+、Ca2+、K＋、H＋等）運(yùn)輸而對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞及子代病毒在細(xì)胞中成熟產(chǎn)生影響［8-9］。新型丙型肝炎病毒p7離子通道抑制劑BIT225可抑制脂質(zhì)膜中的p7離子通道活性，并在BVDV感染試驗(yàn)中具有抗病毒活性，BIT225與重組干擾素α-2b的組合顯示出針對(duì)BVDV的協(xié)同抗病毒作用，并且通過(guò)添加利巴韋林進(jìn)一步增強(qiáng)了協(xié)同作用［10］。用長(zhǎng)烷基鏈亞氨基糖衍生物處理人工脂質(zhì)膜中的p7，對(duì)p7的離子通道活性的抑制作用隨著濃度的升高而增強(qiáng)。而這類化合物對(duì)BVDV具有強(qiáng)大的抗病毒活性［11-12］。這表明病毒傳播過(guò)程中離子通道活性的重要性，以及p7有可能是潛在的藥物靶點(diǎn)。而目前關(guān)于p7如何形成離子孔道幫助BVDV釋放？p7蛋白翻譯后如何轉(zhuǎn)運(yùn)？需要哪些輔助蛋白的修飾和協(xié)作？這些問(wèn)題的解決都需要構(gòu)建p7蛋白抗體，否則難以檢測(cè)其定位和表達(dá)，并探明其形成離子孔道的機(jī)制。在本研究中，使用p7蛋白的N端氨基酸，合成多肽，經(jīng)多次免疫家兔后使用ELISA和免疫熒光染色檢測(cè)多肽多克隆抗體具有較好的反應(yīng)性和特異性。

使用生物信息學(xué)平臺(tái)分析p7蛋白，發(fā)現(xiàn)N端1-14位氨基酸具有較好的親水性。使用化學(xué)方法合成多肽并偶聯(lián)KLH，免疫新西蘭大白兔制備抗p7多抗血清。ELISA測(cè)定經(jīng)抗原純化柱親和純化后的抗體效價(jià)，結(jié)果顯示抗血清效價(jià)在1∶100 000，說(shuō)明制備的p7多肽抗體具有較好的反應(yīng)性。Western blot檢測(cè)抗p7多肽抗體結(jié)果顯示在55 kD和25 kD處有較為明顯的條帶。免疫熒光染色BVDV感染MDBK細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞膜上出現(xiàn)與p7多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，而p7蛋白主要形成離子孔道存在于細(xì)胞膜上，綜上結(jié)果表明本研究獲得的多肽多克隆抗體可作為抗BVDV p7檢測(cè)方法中的具有特異性結(jié)合作用的抗體，也為后期深入研究BVDV p7的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功制備兔抗BVDV p7多肽多克隆抗體，使用ELISA和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)該抗體具有較好的反應(yīng)性和特異性，為進(jìn)一步研究p7形成離子孔道的機(jī)理提供了有利工具。