吳嬌 余桂珍 袁航 劉嫻 高艷秀 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學生命科學學院 云南省生物質能源和環(huán)境生物技術重點實驗室 教育部生物質能源持續(xù)發(fā)展和應用工程研究中心，昆明 650500）

大腸桿菌表達系統(tǒng)是當前重組蛋白生產(chǎn)的主要途徑，但仍面臨不少挑戰(zhàn)，包括蛋白降解、錯誤折疊、溶解性差以及需要高效的純化方法等［1］。在此方面，基因融合表達策略是一重要解決手段，并已有一些功效相當穩(wěn)定的融合標簽，包括麥芽糖結合蛋白（maltose-binding protein，MBP）、谷胱甘肽 S-轉 移 酶（glutathione S-transferase，GST）、 硫氧還蛋白（Trx）、泛素（Ub）、小泛素相關修飾物（smallubiquitin-related modifier，SUMO）［1-3］以及一些超酸性小分子蛋白（MsyB、YjgD）等［4］。

另外，該策略也可以用來提高蛋白質的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性對重組蛋白（如一些工業(yè)酶制劑和多肽類藥品）的功能活性、應用范圍和保存時效至關重要［5］，也對那些與物種耐熱性和作物產(chǎn)量非常密切的功能蛋白（特別是酶）非常關鍵［6-8］。蛋白質在高溫下的可溶性變化可被視為衡量其熱穩(wěn)定性的重要依據(jù)，因而通過融合表達策略提高蛋白質的可溶性本身就具備提高其熱穩(wěn)定性的潛力，在這點目前已有一些研究報道證實。譬如，融合超酸性短肽（包括大腸桿菌 MsyB、YjgD［4］和酰基載體蛋白 ACP［9］，以及人 α-Synuclein 蛋白［4，10］、擬南芥微管蛋白［4］和核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）長鏈型活化酶［11］的酸性尾部），不但能提高靶蛋白——小桐子和擬南芥抗壞血酸過氧化物酶1（JcAPX1、AtAPX1）［4，9］、大豆和煙草短鏈型 Rubisco 活化酶（GmRCA2、NtRCA2）［9，11］、大腸桿菌高絲氨酸 O-轉琥珀酰酶（EcMetA）［9］以及小桐子TATA盒結合蛋白（JcTBP1）［11］的可溶性，而且還增強了它們的熱穩(wěn)定性和/或由它們介導的宿主耐熱能力。除此之外，還有一類熱穩(wěn)定融合標簽主要來源于嗜熱微生物蛋白，它們可以將自身很高的熱穩(wěn)定性賦予給靶蛋白。譬如，融合超嗜熱菌Pyrococcus furiosus的麥芽糖結合蛋白（PfMBP）能顯著提高環(huán)孢桿菌木聚糖酶的熱穩(wěn)定性［12］，獲得產(chǎn)量和熱穩(wěn)定性更高的抗體來免疫檢測炭疽桿菌孢子蛋白［13］，特別是能制備溶解性和熱穩(wěn)定性更好的流感血凝素抗原疫苗［14］。通過這種方法可以實現(xiàn)高產(chǎn)熱穩(wěn)定重組蛋白疫苗，使疫苗的運輸和使用更為便捷。還有，融合Pyrococcus furiosus連接酶的DNA結合域可以增強普通Taq DNA聚合酶的耐熱性并改善其擴增特性［15］，融合來源于嗜熱菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571的幾丁質結合域可以提升多功能半纖維素酶的高溫酶活性，使之具有更高溫度的適用潛能［16］。但是，上述來源于嗜熱微生物的熱穩(wěn)定蛋白融合標簽有一共同缺點就是分子偏大，某些情況下可能會干擾目標蛋白的高級結構進而影響其活性。

而來自超嗜熱菌Pyrococcus furiosus的紅素氧還蛋白（Rubredoxin）即PfRub則是一種小分子鐵硫蛋白，由53個氨基酸殘基構成，是目前已知最耐熱的蛋白質之一［17］。PfRub在大腸桿菌中重組表達純化后呈現(xiàn)紅色，表明能正確折疊并與鐵硫簇結合［17］。進一步的高級結構研究發(fā)現(xiàn)它當中特殊的氫鍵以及數(shù)量較多的丙氨酸殘基和β折疊可能賦予它超乎尋常的耐熱性［18-19］。本研究擬選擇3個對熱敏感但具有重要功能的酶作為靶蛋白（包括JcAPX1［4，9］、EcMetA［9］和假單胞菌亞磷酸鹽脫氫酶（PsPtxD）［20］），首次檢驗PfRub（后簡稱Rub）作為融合標簽能否有效增強大腸桿菌重組酶蛋白的熱穩(wěn)定性并保護其在高溫下的酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒 pET（JcAPX1）、pET（PsPtxD）、pET（EcMetA）均為本實驗室先前構建［4，9，20］，載體 pET32a（+）及大腸桿菌菌株BL21（DE3）均由本實驗室保存。限制性內切酶（Sal I、Xho I、Nde I）、Phusion高保真DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶和堿性磷酸酶等均購于Thermo Scientific公司；質粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、DNA/蛋白質分子量標準等均購自北京Transgene公司；HisTrap FF crude層析柱購自GE Healthcare；引物（表1）合成和DNA測序均由北京華大基因公司完成。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 Rub基因的合成及其融合表達載體的構建本工作采用Phusion DNA聚合酶和兩輪PCR進行Rub基因片段的合成。首先，引物Rub-F2、Rub-R2互補延伸后直接作為模板，通過程序：95℃ 2 min；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 12 s，1 個循環(huán)；95℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 12 s，35 個循環(huán) ；72℃ 10 min，合成第一輪PCR產(chǎn)物。隨后，將它進行適當稀釋（0.1-1 ng/μL）并從中取1 μL作模板，使用引物Rub-F1Sa、Rub-R1Xh 和程序 95℃ 2 min ；95℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 12 s，1 個 循 環(huán) ；95℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃12 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min擴增出第二輪PCR產(chǎn)物片段即Rub。Rub純化后用Sal I和Xho I雙酶切，再與經(jīng)XhoI酶切和去磷酸化的pET（JcAPX1）、pET（PsPtxD）、pET（EcMetA）載體片段分別連接，構建成融合表達載體pET（JcAPX1-Rub）、pET（PsPtxD-Rub）和pET（EcMetA-Rub）。陽性重組克隆分別用靶蛋白基因5′端引物JcAPX1-5Nd/PsPtxD-5Nd/EcMetA-5Nd和Rub片段3′端引物Rub-R1Xh進行菌落PCR鑒定，并最后通過測序驗證。DNA和蛋白質序列分析以及蛋白質的基本屬性（氨基酸數(shù)目、分子量大小、等電點以及pH 7.0條件下的凈電荷）分析均采用Invitrogen公司的Vector NT suite 11.5軟件。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達與純化 將含表達載體的大腸桿菌BL21（DE3）單克隆37℃培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，然后根據(jù)不同靶蛋白而區(qū)別進行誘導表達：對pET（JcAPX1）及pET（JcAPX1-Rub）菌液，37℃誘導4 h；對pET（EcMetA）及pET（EcMetA-Rub）菌液，30℃誘導8 h；對pET（PsPtxD）及pET（PsPtxD-Rub）菌液，25℃誘導過夜。參照文獻［4-9］離心收集菌體，重懸和超聲裂解，制備樣品進行SDS-PAGE分析，并且使用凝膠成像和分析軟件Quantity One（Bio-Rad）對膠上目標蛋白條帶進行灰度定量分析，然后根據(jù)同一重組蛋白在上清（S）、沉淀（P）組分中的條帶灰度值來計算其可溶性（公式： S /（S + P）×100%）。采用His標簽親和層析，參照文獻［20］對重組PsPtxD及其Rub融合蛋白進行純化并洗脫在無磷緩沖液中。

1.2.3 重組蛋白的熱穩(wěn)定性分析 將上述誘導表達菌的超聲裂解液離心后取上清，采用梯度PCR儀為給定溫度范圍自動提供的幾個合適溫度點（間隔均勻），分別成組對重組JcAPX1 | 融合蛋白JcAPX1-Rub樣品（37-60℃）、PsPtxD | 融合蛋白PsPtxD-Rub樣品（30-50℃）、EcMetA | 融合蛋白EcMetA-Rub樣品（25-45℃）熱處理30 min。然后，將每個處理樣品離心分為S和P兩個組分進行SDS-PAGE分析。對膠上每個溫度處理樣品（S和P兩組分）中目標蛋白條帶進行灰度定量分析并以此估算其可溶性。最后，依據(jù)可溶性隨溫度的變化作圖來評價重組蛋白的熱穩(wěn)定性。詳細步驟參照文獻［4-9］。

1.2.4 重組蛋白的酶活耐熱分析 按上述相同方式對重組靶蛋白及其Rub融合蛋白進行溫度處理，但此時需使用純化過的重組PsPtxD及其融合蛋白PsPtxD-Rub。參照文獻［4］對JcAPX1及其融合蛋白JcAPX1-Rub的熱處理后樣品進行APX膠活性染色分析，同時通過分光光度法定量測定其酶活。將未經(jīng)溫度處理樣品（CK）的APX酶活性定義為100%，以此為標準計算出各溫度點處理后樣品的相對酶活性，并隨溫度作圖直觀展示它的變化趨勢。類似地，參照袁航等［20］對PsPtxD及其融合蛋白PsPtxD-Rub經(jīng)熱處理后的樣品進行分光光度法酶活測定，并作圖展示它隨溫度變化的曲線。通過M9基本培養(yǎng)基上的細菌梯度稀釋點板實驗，直接對重組EcMetA及其Rub融合蛋白在菌體內的酶活進行耐熱性分析：將含表達載體pET（EcMetA）、pET（EcMetA-Rub）及pET32a（+）空載體的BL21（DE3）大腸桿菌37℃培養(yǎng)至OD600為0.4，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，25℃誘導培養(yǎng)過夜；然后將菌液OD600均調為1.4，分別取200 μL放置在44℃、48℃、52℃恒溫水浴鍋中處理2 h；最后將熱處理菌液和未處理菌液（CK）按照10-1、10-2、10-3、10-4倍數(shù)進行梯度稀釋，各取2 μL成行點板于M9固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2 d，觀察菌落的生長情況并拍照記錄。

2 結果

2.1 Rub基因的合成及其大腸桿菌融合表達載體的構建

本工作根據(jù)超嗜熱菌Pyrococcus furiosus紅素氧還蛋白（簡稱Rub）的基因片段（GenBank NC_018092，1008432...1008596 nt） 的 大 小 設 計 了4條約60 bp的引物。首先，通過內部引物對Rub-F2/Rub-R2之間互補延伸作模板，擴增出約100 bp的第一輪PCR產(chǎn)物；然后以之為模板，使用外部引物對Rub-F1Sa / Rub-R1Xh進行第二輪PCR，合成得到大小約180 bp的完整Rub基因片段（圖1-A）。通過SalⅠ和XhoⅠ雙酶切，Rub隨后分別插入到載體pET（JcAPX1）、pET（PsPtxD）、pET（EcMetA） 上靶蛋白基因編碼區(qū)的3′末端，最后各自經(jīng)菌落PCR鑒定獲得了其融合表達載體pET（JcAPX1-Rub）（圖1-B）、pET（PsPtxD-Rub）（圖 1-C）和 pET（EcMetARub）（圖1-D），并且通過測序驗證了Rub基因的合成準確及與靶蛋白基因編碼區(qū)的無框移融合。

圖1 Rub基因的PCR合成及其融合表達載體的構建Fig.1 PCR synthesis of the Rub gene and construction of its fusion expression vectors

通過比較Rub標簽、靶蛋白及其融合蛋白一些特性，如氨基酸數(shù)目、分子量大小、等電點以及pH 7.0條件下的凈電荷等（表2），可以看出Rub是一小分子酸性蛋白，作為融合標簽可以使它的靶蛋白得到一定程度的酸化，帶上更多的凈負電荷，而且分子量并未增大許多。

表2 Rub、靶蛋白及其融合蛋白的特性Table 2 Properties of Rub，target proteins，and their fusion forms

2.2 融合Rub可提高大腸桿菌重組靶蛋白的可溶性

將 靶 蛋 白 表 達 載 體 pET（JcAPX1）、pET（PsPtxD）、pET（EcMetA）及與Rub融合的表達載體 pET（JcAPX1-Rub）、pET（PsPtxD-Rub）、pET（EcMetA-Rub）分別成對于相同條件下在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達，表達菌經(jīng)超聲裂解后通過SDS-PAGE分析。結果顯示，本工作選用的3種靶蛋白JcAPX1、PsPtxD、EcMetA在大腸桿菌重組表達時大部分確實為不溶的沉淀形式（圖2-A、D、G），可溶性不到或接近10%（圖2-B、E、H），并且表達菌裂解液幾乎以本色呈現(xiàn)（圖2-C、F、I）。相比較，加了Rub標簽的融合蛋白JcAPX1-Rub、PsPtxD-Rub、EcMetA-Rub重組表達時有相當部分存在于上清中（圖2-A、D、G），可溶性顯著得到提高（對JcAPX1-Rub甚至高達90%以上）（圖2-B、E、H）。另外，由于融合了屬鐵硫蛋白的Rub（能結合Fe離子）使得表達菌裂解液可呈現(xiàn)出暗紅色，顏色的深淺看似與Rub融合蛋白的可溶性呈正相關，其中JcAPX1-Rub表達菌裂解液的暗紅色顯然最深（圖2-C、F、I）。這些結果表明Rub可作為一個增溶標簽有效促進靶蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達。盡管當中對各靶蛋白可溶性提高的程度似乎并不相同，但這可能與靶蛋白本身性質有很大關系。

圖2 融合Rub可促進靶蛋白JcAPX1、PsPtxD、EcMetA在大腸桿菌中的可溶性表達Fig. 2 Rub fusion enhances the soluble expressions of target proteins JcAPX1，PsPtxD，and EcMetA in E. coli

2.3 融合Rub可提高重組靶蛋白的熱穩(wěn)定性

靶蛋白及其Rub融合蛋白表達菌裂解液離心后的上清經(jīng)系列設定溫度點熱處理后，進行SDS-PAGE分析和估算目標蛋白的可溶性。結果顯示，JcAPX1蛋白的可溶性隨著溫度升高而逐漸降低，它在45℃時就有近50%以不溶的沉淀形式存在，當溫度升至55℃左右時就幾乎不可溶；與之相比，JcAPX1-Rub融合蛋白的可溶性隨溫度升高并沒有明顯變化，幾乎都以可溶的形式存在（圖3-A、B）。PsPtxD蛋白在低于35℃的處理溫度下大部分還在上清中，接近40℃時可溶性就急劇下降到30%左右，到45℃左右就變得基本不可溶；相比較，PsPtxD-Rub融合蛋白的可溶性在40℃左右還保持很高（接近90%），雖然隨溫度緩慢下降，但在50℃高溫仍有70%的可溶性（圖3-C、D）。類似地，EcMetA可溶性在35℃之前受處理溫度影響較小，但升至38℃左右時就急劇下降至50%，在超過41℃以后基本變得不可溶；相比較，EcMetA-Rub融合蛋白的可溶性隨溫度升高并沒有明顯下降，在45℃時仍然保留高達90%的可溶性（圖3-E、F）。這些結果一致表明融合Rub可顯著提高重組靶蛋白的熱穩(wěn)定性。

圖3 融合Rub可增強靶蛋白JcAPX1、PsPtxD、EcMetA的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Rub fusion improves the thermostability of target proteins JcAPX1，PsPtxD，and EcMetA

2.4 融合Rub可提高重組JcAPX1、PsPtxD酶活的耐熱性

由于大腸桿菌缺乏內源性APX酶，因而重組表達的JcAPX1及其Rub融合蛋白無需純化可直接進行酶活耐熱性分析。將表達菌裂解液離心后的上清經(jīng)系列溫度點熱處理后，先通過直觀的膠活性染色來檢測酶活變化。由圖4-A可以看出，JcAPX1酶活在45℃以下隨溫度升高而逐漸輕微下降，但在47.7℃時就頃刻完全失活；與之相比較，JcAPX1-Rub融合蛋白的酶活性在溫度低于47.7℃之前基本沒有太大變化，只有當溫度升到50.5℃時才明顯下降，但仍保留約40%的水平。進一步通過靈敏的分光光度法進行酶活測定，發(fā)現(xiàn)在所有低于44.5℃的溫度處理點上，JcAPX1的酶活性與CK（未經(jīng)處理）相比隨溫度逐步上升但較緩慢，而JcAPX1-Rub融合蛋白的酶活上升趨勢較快，甚至延伸至47.5℃達到最高（2倍多）。JcAPX1酶活性在44.5℃以后就開始急劇下降，到47.5℃僅保留約50%，當溫度升至52℃時就基本喪失，而此時JcAPX1-Rub仍然保留有70%左右的活性。到53.5℃時，兩者的活性均趨同為無（圖4-B）。該結果與前面膠活性染色結果大體一致，表明融合Rub標簽能夠有效保護酶蛋白JcAPX1免受熱失活，使其耐熱性提高了近5℃。

為了避免大腸桿菌內源性干擾，重組表達的PsPtxD及其Rub融合蛋白需要先經(jīng)His標簽親和層析純化（洗脫在無磷緩沖液中）后才進行酶活耐熱性分析。樣品經(jīng)系列溫度點熱處理后通過分光光度法檢測其酶活性。結果顯示，PsPtxD酶活性對溫度較敏感，除了25℃比CK略高，之后就持續(xù)下降，到37℃就完全失活，其半失活溫度接近32.5℃。相比較，PsPtxD-Rub融合蛋白的酶活性在34℃前隨溫度升高都持續(xù)上升，之后開始下降，但在43℃前仍高出CK，直到53.5℃才完全失去活性，其半失活溫度約為47.5℃（圖4-C），這表明Rub標簽的添加能夠大幅（約15℃）提高PsPtxD酶活的耐熱能力。

圖4 融合Rub可提高JcAPX1、PsPtxD體外酶活的耐熱性Fig. 4 Rub fusion improves the heat tolerance of the in vitro enzymatic activities of JcAPX1 and PsPtxD

2.5 融合Rub可提高EcMetA重組大腸桿菌菌株的耐熱性

本工作還對靶蛋白EcMetA及其Rub融合蛋白采用了更方便的體內活性耐熱分析。由于EcMetA是大腸桿菌甲硫氨酸（必需氨基酸）合成途徑的關鍵酶，它的酶活耐熱性可以表觀地由高溫脅迫后的細菌菌落生長狀態(tài)反映出。通過M9基本培養(yǎng)基上的細菌梯度稀釋點板實驗可以發(fā)現(xiàn)，含表達載體pET（EcMetA）或融合表達載體pET（EcMetA-Rub）的重組大腸桿菌與含空載pET32a（+）的細菌相比，在未受溫度脅迫（CK）時的菌落生長狀況基本相似。經(jīng)42℃處理2 h后點板，含EcMetA表達載體的大腸桿菌生長狀況略好于含空載菌，而含EcMetA-Rub融合表達載體的大腸桿菌生長狀況明顯好于前兩者。將溫度升至48℃處理2 h后點板，各重組大腸桿菌生長狀況類似于42℃處理2 h，但含EcMetA-Rub載體的重組菌菌落生長優(yōu)勢凸顯出來。而經(jīng)過52℃高溫處理2 h后，能夠更明顯地看出含EcMetA-Rub融合表達載體的菌落在高溫脅迫下的生長優(yōu)勢，當稀釋至1 000倍點板仍有菌落生長，而另外兩者只有在未稀釋時點板才有少數(shù)的菌落生長（圖5）。這些結果表明融合Rub增強了EcMetA重組大腸桿菌菌株的耐熱性，推測是Rub作為熱穩(wěn)定融合標簽有效保護了靶酶蛋白EcMetA在菌體內免受熱失活。

圖5 細菌稀釋點板分析Rub融合對EcMetA重組大腸桿菌在高溫脅迫下的生長影響Fig. 5 Influence of Rub fusion on the growth of EcMetA recombinant E. coli strain under heat stress by bacterial dot plating test with serial dilution

3 討論

目前，蛋白質可溶性和熱穩(wěn)定性仍然是重組蛋白高效生產(chǎn)、功能應用和長久保存不可回避的問題，而使用融合表達策略已成為其重要解決手段，關鍵是找尋功效顯著的增溶/熱穩(wěn)定蛋白融合標簽。為此，本工作檢驗了超嗜熱菌Pyrococcus furiosus的紅素氧還蛋白（Rub）作為該類融合標簽的可行性。嗜熱微生物中的蛋白通常具有很高的熱穩(wěn)定性，Rub也不例外，事實上它是目前已知的最耐熱蛋白質之一，高溫下不易發(fā)生變性聚集，這得益于它分子高級結構中的特殊氫鍵和數(shù)量較多的β-折疊［17-19］。

本研究選取了3種熱不穩(wěn)定重要靶蛋白JcAPX1、PsPtxD和EcMetA，發(fā)現(xiàn)融合Rub確能一致顯著提高了它們的可溶性和熱穩(wěn)定性，并且在相當大程度上提高了JcAPX1、PsPtxD的體外酶活耐熱性以及增強了EcMetA重組大腸桿菌的耐高溫能力（即體內酶活耐熱性）。這些結果說明Rub如同其他嗜熱微生物蛋白［12-16］一樣，作為融合標簽能夠將自身超高熱穩(wěn)定性“順式”傳遞給靶蛋白。另外，Rub的這種增溶/熱穩(wěn)定作用還可能與它的酸性特質有關，靶蛋白與它融合能得到一定程度的酸化，類似于目前已鑒定的不少超酸性短肽標簽［4，9-11］。

另外，Rub分子量不大（53 aa），對靶蛋白折疊和功能的潛在影響較小，符合理想融合標簽的大小標準，可以認為這是它有別于其他嗜熱微生物蛋白標簽［12-16］的重要優(yōu)勢。

還有，Rub在大腸桿菌中重組表達能形成正確高級構象并與鐵硫簇結合呈現(xiàn)紅色［17］，在本研究中它與3種不同靶蛋白融合也能使各個表達菌裂解液呈現(xiàn)出暗紅色，并且顏色的深淺與其融合蛋白的可溶性呈正相關。這種特性可用于融合蛋白可溶性表達水平的判斷及后續(xù)純化過程的示蹤。

總之，從現(xiàn)有的文獻資料來看，本工作可能是首次從嗜熱微生物耐熱蛋白群體中鑒定出分子量小、效果明顯的增溶/熱穩(wěn)定融合標簽，為利用蛋白融合策略提高靶蛋白的可溶性、熱穩(wěn)定性及其抗熱失活能力甚至是其宿主（如工業(yè)微生物）的耐熱性提供了一個新的效應元件。特別提及的是，Rub融合若應用在熱不穩(wěn)定的光合作用相關酶（如Rubisco活化酶［8］）上，它對植物耐熱性和高溫下產(chǎn)量的提高將是可以期待的。另外，由于植物內源性rubredoxin還參與對逆境脅迫的響應，維持正常的電子轉移以減少活性氧（ROS）的積累，其過表達植株對鹽、堿等諸多脅迫的耐受性增強［21］，因而可以想象這種Rub融合還可能賦予目標轉基因植物額外的抗逆能力。顯然，Rub標簽無疑具有相當看好的廣闊應用前景。

4 結論

本研究驗證了超嗜熱菌Pyrococcus furiosus的紅素氧還蛋白可以作為熱穩(wěn)定融合標簽，顯著提高大腸桿菌重組蛋白的可溶性和熱穩(wěn)定性，并能對靶蛋白的體內或體外活性提供明顯的熱保護作用。