楊宗政 趙曉宇 劉丹 許文帥 吳志國

（1. 天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；3. 天津市鹵水化工與資源生態(tài)化利用重點實驗室，天津 300457）

鉻被廣泛應(yīng)用于金屬電鍍、冶金、鉻酸鹽制造、印染等行業(yè)［1-2］，當工業(yè)生產(chǎn)中各類廢水流入土壤，就會造成嚴重的土壤鉻污染問題，尤其是Cr（VI）污染。Cr（VI）的毒性對土壤中的動植物以及微生物都會產(chǎn)生嚴重的影響［3-4］。土壤中的Cr（VI）不僅會造成植物減產(chǎn)，還會在植物中發(fā)生生物積累后進入食物鏈，進而影響動物及人類的健康。因此，對Cr（VI）污染農(nóng)田進行安全且有效地修復(fù)已成為亟待解決的難題［5］。

在眾多土壤修復(fù)方法中，微生物修復(fù)具有經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)勢，是重要的土壤修復(fù)手段之一。Srivastava等［6］通過實驗證明，Cr（VI）脅迫會對植物系統(tǒng)造成破壞，堆肥及黑曲霉的共同作用可去除土壤中Cr（VI）污染，從而顯著改善小麥植株的生長情況。陳土鳳等［7］利用Exiguobacterium sp.對土壤中的Cr（VI）進行還原，小白菜的生長情況及受到的氧化應(yīng)激情況明顯改善?？梢姡ㄟ^微生物修復(fù)Cr（VI）污染土壤，可緩解其對植物的毒性及氧化脅迫，并減少植株對Cr（VI）的吸收，對植物無公害化具有重大意義。微生物群落特征是表征土壤質(zhì)量變化的最敏感及最具潛力的指標之一。土壤中的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)會在受到重金屬脅迫后發(fā)生變化，因此，通過微生物多樣性的變化反映土壤污染程度被廣泛采用［8-10］。

由于土壤環(huán)境復(fù)雜，對微生物適應(yīng)能力要求較高，因此，利用微生物修復(fù)Cr（VI）污染土壤還大多處于研究階段。本研究嘗試將課題組前期分離篩選的具有較好Cr（VI）還原特性的菌株Microbacterium sp. BD6［11］用于 Cr（VI）污染土壤修復(fù)中，對菌株BD6去除土壤中Cr（VI）的影響因素進行了研究，并通過盆栽實驗及土壤微生物群落分析等試驗對Cr（VI）的毒性及菌株BD6對Cr（VI）污染土壤的修復(fù)效果進行表征，以期為實際修復(fù)Cr（VI）污染農(nóng)田土壤提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 菌株是本課題組分離自福建省廈門市某電鍍廠下水道的淤泥，菌株BD6 的16S rRNA 部分基因序列保存于GenBank，登陸號為MK611086。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸粉 5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0；在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂 2 g/100 mL 即成LB固體培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基121℃ 高壓濕熱滅菌 20 min 后使用。含Cr（VI）培養(yǎng)基是根據(jù)所需Cr（VI）濃度向LB培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的Cr（VI）標準溶液［11］。

1.1.3 供試土壤來源 供試農(nóng)田土取自河南省安陽市黃縣某農(nóng)田（北緯 35°95′，東經(jīng) 114°86′）。土壤有機質(zhì)含量為9.63 g/kg，pH值為7.2，全氮0.31 g/kg，總磷11.61 mg/kg，未檢測到Cr（VI）。土壤經(jīng)自然風(fēng)干后，過孔徑為2 mm的篩網(wǎng)，含水率為6.1%。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 挑取劃線純化后的BD6菌株單菌落接入LB培養(yǎng)基中，于180 r/min、30℃的恒溫搖床培養(yǎng)24 h后，離心后重懸于無菌水中制得濃度為3×108CFU/mL 的菌懸液備用。

1.2.2 配制Cr（VI）標準溶液 配制5 g/L Cr（VI）的標準溶液：將重鉻酸鉀在 120℃ 烘干 2 h，稱取14.1446 g 溶于1 L去離子水中，過 0.22 μm 濾膜以除菌，置于4℃冰箱中備用。

1.2.3 土壤中Cr（VI）含量測定 消解按照《危險廢物鑒定標準 浸出毒性鑒別》（GB 5085.3-2007）中《附錄D 固體廢物 六價鉻分析的樣品前處理 堿消解法》的方法進行。Cr（VI）測定按照文獻［12］進行。

1.2.4 Cr（VI）還原率計算方法：

式中，η：Cr（VI）還原率%；C0：土壤中Cr（VI）初始濃度，mg/kg；C1：Cr（VI）還原后，按照1.2.3步驟測定得到的土壤中Cr（VI）濃度，mg/kg。

1.2.5 土壤條件對菌株BD6還原Cr（VI）的影響

1.2.5.1 土壤含水率的影響 按16%的接種量（16 mL菌液/100 g土，將菌液于土壤表面多點投加后進行攪拌使其與土樣充分混合，下同）向Cr（VI）濃度為100 mg/kg的土壤（100 mg Cr（VI）/ kg含水率6.1%的自然風(fēng)干土，下同）中接種制備的菌液，向土壤中補充去離子水使土壤含水率分別為25%、30%、40%和50%，每組設(shè)置3平行，將樣品置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時測定其中Cr（VI）含量，考察土壤含水率對修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.2 溫度的影響 同1.2.5.1步驟和接種量接種菌液，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣分別置于15、20、25、30、35和40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行，定時測定土壤中Cr（VI）含量，考察溫度對修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.3 老化時間的影響 同1.2.5.1步驟和接種量接種菌液，其中Cr（VI）老化土壤時間分別為新鮮制備土壤（0 h）、老化20 d土壤、老化60 d土壤，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行，定時測定土壤中Cr（VI）含量，考察Cr（VI）老化土壤時間對修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.4 其它重金屬離子的影響 向含 Cr（VI）100 mg/kg 的土壤中分別投加氯化銅、氯化鋅、氯化錳、氯化鎘、氯化鎳配制的溶液，使Cu2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+、Ni2+在土壤中的濃度分別達到 50 mg/kg土。同1.2.5.1步驟和接種量接種菌液，以只含 Cr（VI）100 mg/kg 的土壤作為對照，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置 3個平行，定時測定土壤中Cr（VI）含量，考察重金屬離子對修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.5 接種量的影響 將制備的菌液分別按6%、12%、16%和26%的接種量向Cr（VI）濃度為100 mg/kg的土壤中接種，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行，定時測定土壤中Cr（VI）含量，考察接種量對修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.5.6 Cr（VI）初始濃度的影響 同1.2.5.1向Cr（VI）濃度分別為50、100、150和300 mg/kg土壤中接種菌株BD6，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行，定時測定Cr（VI）含量，考察Cr（VI）初始濃度對修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.6 電子供體的選擇以及菌株還原能力的測定 向 Cr（VI）濃度為100 mg/kg 的土壤中分別投加果糖、乳糖、葡萄糖、丙三醇和丙酮酸鈉（20 g電子供體/kg土）。將菌液同1.2.5.1步驟和接種量接種于以上土壤中，以不投加電子供體的Cr（VI）濃度為100 mg/kg 的土壤作為對照，設(shè)置土壤含水率為30%，將土樣置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行，定時測定土壤中Cr（VI）含量，考察不同電子供體對修復(fù)Cr（VI）污染土壤的影響。

1.2.7 盆栽實驗 按照1.2.5.1步驟和接種量向含Cr（VI）100 mg/kg土壤中接種菌株BD6，設(shè)置土壤含水率為30%，置于30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。將處理96 h的土壤含水率調(diào)節(jié)為20%，與Cr（VI）含量分別為 0、5、10、20、30、50、80和 100 mg/kg土 壤，含水率為20%的土壤一起進行盆栽實驗。挑選顆粒飽滿、形狀、質(zhì)量、大小均勻的黃豆播種于花盆中。每盆裝土30 g（含水率20%），播種2粒黃豆，每個土樣6盆平行，定時澆水，25 d 后收獲。觀察植株生長形態(tài)，計算種子發(fā)芽率方法同文獻［13］，測定植株鮮重方法同文獻［14］，株高及植株內(nèi)總鉻含量測定方法同文獻［15］。

1.2.8 土壤微生物群落分析

1.2.8.1 土壤取樣及方法 取原土、100 mg/kg C（rVI）老化12 h土壤、菌株BD6修復(fù)100 mg/kg Cr（VI）污染土壤的修復(fù)組土壤及投加20 g丙三醇/kg土壤的菌株BD6修復(fù)100 mg/kg Cr（VI）污染土壤的修復(fù)組土壤（修復(fù)組土壤取修復(fù)時間為96 h、10 d、15 d的土壤）進行高通量測序。取樣方法：（1）去除土壤表面覆蓋物。（2）用酒精棉擦拭采樣器，待酒精揮發(fā)完全后，使用采樣樣方處土壤浸潤采樣器。后續(xù)每次更換樣方均需重復(fù)此步驟。（3）采用梅花型五點取樣法進行混合取樣。（4）將混合好的土壤樣本分裝多份，每份5-10 g，置于-80℃冰箱保存，用于高通量測序。

1.2.8.2 高通量測序及數(shù)據(jù)分析 以土壤樣本DNA為模板，采用包含“CTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC” 序列的下游引物擴增原核生物16S rDNA的V3和V4高變區(qū)，進行Illumina MiSeq測序。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列進行OTU聚類（序列相似性設(shè)為97%）。然后對OTU的代表性序列進行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。基于OTU得到分析結(jié)果，采用對樣本序列進行隨機抽平的方法，分別計算Ace、Chao1、Simpson、Shannon等α多樣性指數(shù)，反映群落的物種豐度和多樣性。通過RDP分類鑒定OUT代表性序列的微生物分類相對豐度。

1.2.9 菌株BD6在土壤中的定殖情況

1.2.9.1 土壤取樣及方法 取修復(fù)時間為0 h、96 h、10 d及15 d的含100 mg/kg C（rVI）的修復(fù)組土壤（與高通量測序土樣修復(fù)組取自同一處），采用熒光定量PCR法，考察菌株BD6在土壤中的定殖情況。取樣方法同1.2.8.1。

1.2.9.2 熒光定量PCR 以提取的土壤樣品的總DNA為模板，擴增的目標基因為菌株BD6的16S rRNA基因部分序列。所使用的引物為16S-F（5′-AAGTGACGGTACCTGCAGAA-3′）及 16S-R（5′-GTTGAGCCTCGGGATTTCAC-3′）。于 ABI 7900 Real-time PCR system（Applied Biosystems）擴增儀上進行絕對定量PCR 分析。每個樣品設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)不加模板的反應(yīng)管為陰性對照。反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 12.8 μL，10×Buffer 2 μL，Template 3 μL，正反 向 引 物 各 0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，DMSO 0.5 μL，TransStart Taq Polymerase 0.2 μL。反應(yīng)程序為 ：95℃5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃ 5 min。稀釋相應(yīng)的質(zhì)粒濃度從10-1到10-8，并繪制標準曲線。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0 軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同條件對菌株BD6還原Cr（VI）的影響

不同土壤條件對菌株BD6還原Cr（VI）的影響如圖1所示。菌株BD6對土壤中Cr（VI）的還原率隨著含水率的升高而增加，當含水率達到30%及以上，菌株BD6對Cr（VI）還原效果較好。菌株BD6在不同溫度下對Cr（VI）的還原實驗中，96 h時菌株BD6在25-40℃范圍內(nèi)對土壤中Cr（VI）的還原率均可達到90%以上，且去除效率隨著溫度的升高而提升，當溫度低于25℃，菌株BD6對土壤中Cr（VI）的還原率則明顯降低。Cr（VI）老化土壤時間對菌株BD6還原土壤中Cr（VI）的影響并不顯著，如圖1所示，菌株BD6對新制Cr（VI）污染土壤及Cr（VI）老化20 d、60 d的土壤的Cr（VI）還原率分別為90.8%、92.7%和91.5%。菌株BD6在分別含 50 mg/kg 土 的 Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+的 土壤中均可以對Cr（VI）進行還原，但是還原效率會受到不同程度的抑制。與對照組相比，Cu2+、Cd2+、Ni2+較明顯抑制了還原效果，Zn2+的抑制作用較輕，Mn2+影響最小。接種量對菌株BD6還原土壤中Cr（VI）的影響如圖1所示，隨著接種量增加，BD6對土壤中Cr（VI）還原率提高。綜合考慮修復(fù)效果及經(jīng)濟成本，選擇16 mL菌液/100 g土為最佳接種量。Cr（VI）初始濃度對菌株BD6還原Cr（VI）的影響如圖1所示，菌株BD6在48 h內(nèi)即可對初始濃度為50 mg/kg的土壤中Cr（VI）還原90%以上。96 h，菌株BD6可對初始濃度為100 mg/kg土壤中Cr（VI）還原90%以上。菌株BD6對Cr（VI）的96 h去除率隨著Cr（VI）初始濃度增加而降低。菌株BD6對土壤中濃度為100 mg/kg及以下的Cr（VI）有著較好還原效果。

圖1 不同條件對菌株BD6還原Cr（VI）的影響Fig.1 Effects of factors on the Cr（VI）reduction by strain BD6

2.2 不同電子供體對土壤修復(fù)的影響

添加電子供體能加快菌株BD6在液體培養(yǎng)基中還原Cr（VI）的速率，因此本研究對土壤修復(fù)中電子供體利用情況也進行了測試。如圖2所示，投加果糖、乳糖、葡萄糖、丙三醇、丙酮酸鈉等均會對菌株BD6還原土壤中Cr（VI）有促進作用。其中添加丙酮酸鈉作為電子供體的促進效果最好，36 h對Cr（VI）的還原率即可達到90%；其次為添加丙三醇作為電子供體，48 h對 Cr（VI）的還原率可達到90%。綜合考慮經(jīng)濟和實際使用因素，本研究依然使用丙三醇作為土壤修復(fù)中的外加電子供體。

圖2 不同電子供體對菌株BD6還原土壤中Cr（VI）的影響Fig.2 Effect of different electron donors on Cr（VI）reduction in soil by strain BD6

2.3 Cr（VI）污染土壤修復(fù)前后對植株的影響

含不同濃度Cr（VI）土壤中種植大豆25 d后大豆植株的生長情況，從圖3可以看出，對照組大豆生長良好，株高較高，根部較為發(fā)達。隨著Cr（VI）濃度增大，植株高度、根系發(fā)達程度及發(fā)芽率明顯受到越來越嚴重的抑制，葉莖發(fā)黃且葉片稀少，當Cr（VI）濃度達到100 mg/kg時大豆在土壤中發(fā)芽率也受到較大影響，而Cr（VI）濃度為100 mg/kg土壤經(jīng)菌株BD6修復(fù)的處理組中生長的大豆植株則生長情況良好。

圖3 大豆盆栽實驗Fig.3 Soybean pot experiments

表1數(shù)據(jù)反映了植株各項生長指標受土壤中Cr（VI）的影響。雖然當Cr（VI）濃度達到100 mg/kg時，才會對發(fā)芽率產(chǎn)生一定影響，但較低Cr（VI）濃度已經(jīng)會對植株生長產(chǎn)生抑制作用，Cr（VI）含量分別為5、10、20、30、50、80和100 mg/kg的土壤中生長的大豆植株相較于不含Cr（VI）的土壤中生長的大豆植株，植株高度和重量隨Cr（VI）濃度升高而逐漸降低。本研究還對植株體內(nèi)吸收的鉻含量進行了測定，隨著土壤中Cr（VI）濃度增大，植株內(nèi)的鉻含量也顯著增加。未經(jīng)處理的含Cr（VI）100 mg/kg土壤中生長的大豆植株體內(nèi)鉻含量為5 mg/kg，含Cr（VI）100 mg/kg的土壤經(jīng)BD6處理后，植株中并未檢出鉻。以上結(jié)果表明，Cr（VI）對大豆植株生長會產(chǎn)生明顯的毒性作用，菌株BD6對土壤的修復(fù)極大緩解了Cr（VI）對大豆植株的植物毒性，也降低了植株對鉻的吸收。

表1 植株各項生長指標Table 1 Growth indicators of plants

2.4 Cr（VI）污染土壤修復(fù)對土壤微生物群落的影響

2.4.1 菌株BD6修復(fù)Cr（VI）污染土壤對微生物群落影響 通過16S rRNA基因V3+V4區(qū)域高通量測序分析土壤樣品，能夠反映樣品中細菌群落的種類和結(jié)構(gòu)的變化?？瞻淄寥溃╕）、含Cr（VI）100 mg/kg土壤（Cr）、菌株 BD6修復(fù)含 Cr（VI）100 mg/kg 96 h土壤（未加丙三醇A-96 h，添加丙三醇G-96 h）、修復(fù)10 d土壤（未加丙三醇A-10 d，添加丙三醇G-10 d）、修復(fù)15 d土壤（未加丙三醇A-15 d，添加丙三醇G-15 d）等樣品的微生物α多樣性如表2所示。在所有多樣性指數(shù)中，Ace與Chao1指數(shù)反映出無Cr對照組微生物豐度最高，含Cr組較低，在投加菌株BD6修復(fù)后微生物豐度指數(shù)普遍呈增大趨勢；Shannon和Simpson指數(shù)反映了微生物群落的多樣性，多樣性96 h時降到最低，而后又呈增大趨勢，且外加丙三醇組在微生物豐度和多樣性方面在同等條件下略大于未添加組或基本持平。表2中數(shù)據(jù)反映出Cr（VI）對微生物的毒性作用使土壤中微生物多樣性顯著降低，隨著菌株BD6對Cr（VI）污染土壤修復(fù)的時間增加，微生物豐度和多樣性相對于污染土壤有了顯著恢復(fù)。

表2 α多樣性指數(shù)Table 2 α diversity index

在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面，如圖4-A所示為門水平的物種分布柱狀圖，在菌株BD6修復(fù)Cr（VI）96 h后，優(yōu)勢菌門為Actinobacteria（放線菌門），次優(yōu)勢菌門為Firmicutes（厚壁菌門），與原土微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同，當修復(fù)時間達到10 d，已將Cr（VI）從土壤中基本去除的情況下，土壤中優(yōu)勢菌門為Proteobacteria（變形菌門），次優(yōu)勢菌門為Firmicutes（厚壁菌門），與原土優(yōu)勢菌門相同。

在門水平上，優(yōu)勢菌一直是Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes和Actinobacteria，但是相對豐度則是有較大變化；對比是否添加丙三醇，微生物群落結(jié)構(gòu)在10 d時有著較大差異。對比Y和Cr樣品，雖然門水平看不出顯著差異，但從屬水平的菌落結(jié)構(gòu)來看Ramlibacter相對豐度迅速上升，該菌屬也是在重金屬環(huán)境下報道較多的一個優(yōu)勢種屬。在修復(fù)組中，隨著Microbacterium sp. BD6的加入，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生較大變化，從圖4-B中可以看到隨著修復(fù)時間延長，菌屬Microbacterium的相對豐度是不斷下降的。

2.4.2 菌株BD6在Cr（VI）污染土壤修復(fù)中的定殖 通過對菌株BD6在土壤中的qPCR檢測顯示，在最初48 h內(nèi) BD6在土壤中的數(shù)量會急劇減少，之后一直處于持續(xù)下降狀態(tài)，到15 d時，降低為最初接種量的3%以下，說明菌株BD6在土壤中并不會成為優(yōu)勢菌。這與屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)（圖4-B）中顯示的微桿菌屬在群落中相對豐度持續(xù)下降的情況一致。

圖4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成Fig.4 Structure composition of soil microbial community

3 討論

Cr（VI）污染土壤的生物修復(fù)具有經(jīng)濟且環(huán)境友好等優(yōu)勢，多種微生物已被報道用于土壤Cr（VI）修復(fù)，如硫酸鹽還原菌［16］、黑曲霉［6］、蠟樣芽胞桿菌［17］等。本課題組通過前期實驗發(fā)現(xiàn)菌株BD6在液體培養(yǎng)基中具有高效Cr（VI）還原能力，于是本研究嘗試將該菌株用于土壤修復(fù)。菌株BD6為微桿菌屬，該菌屬應(yīng)用于Cr（VI）污染土壤修復(fù)還少見報道。由于土壤環(huán)境復(fù)雜，當使用微生物修復(fù)土壤時，各方面因素都會對微生物修復(fù)土壤的效果產(chǎn)生影響，如接種量、Cr（VI）初始濃度、溫度和金屬離子等［18-19］。本研究在考察菌株BD6在液體培養(yǎng)基中還原特性基礎(chǔ)上［11］，通過單因素實驗進一步確定了菌株在土壤中還原Cr（VI）的特性和條件，與菌株BD6在液體中的Cr（VI）還原條件相比，隨著溫度升高在液體或土壤中都有著還原率升高的趨勢，但40℃時土壤中還原率明顯好于液體還原；重金屬離子在液體還原中對還原的抑制大小排序為Mn2+＞Cd2+＞Zn2+＞Ni2+，Cu2+有促進還原的作用，而在土壤中對還原的抑制效果沒有液體中明顯且抑制大小順序為Cu2+＞Cd2+＞Ni2+＞Mn2+＞Zn2+。這可能與微生物所處的不同環(huán)境介質(zhì)有關(guān)。Cr（VI）在土壤中的老化時間也可能會影響鉻在土壤中的形態(tài)［20］，而微生物對不同形態(tài)的Cr（VI）去除效率可能不同［21］。本研究中菌株BD6對不同老化時間的土壤還原效率相近，由此可見，其適用于長時間受到Cr（VI）污染的場地中。

在Cr（VI）污染土壤生物修復(fù)方面，有研究表明外源電子供體類物質(zhì)添加會起到較好的促進Cr（VI）還原的作用［22-23］。各種電子供體存在情況下微生物對鉻還原活性不同，可能是因為還原酶對不同電子供體的電子接受能力不同［24］。微生物會對更有利于其生長的電子供體進行優(yōu)先利用，因此提高菌株Cr（VI）還原能力需選擇合適的電子供體［25-26］。本研究根據(jù)菌株BD6在液體培養(yǎng)基中可以通過添加電子供體來提升Cr（VI）還原效率的特點，在土壤修復(fù)中也嘗試了相應(yīng)的各種電子供體。通過比較發(fā)現(xiàn)在土壤中添加丙酮酸鈉作為電子供體效果最好，而在液體培養(yǎng)基中使用丙三醇作為電子供體效果更佳，這可能跟土壤環(huán)境中丙酮酸鈉更易被菌株利用有關(guān)。因此，應(yīng)選用易分散、溶解性較好的物質(zhì)作為微生物還原土壤中Cr（VI）的外源電子供體。但是考慮到修復(fù)成本等原因，本研究在土壤修復(fù)中依舊使用丙三醇作為電子供體。

在土壤修復(fù)中也要考慮外源物質(zhì)添加后對土壤長遠的影響，特別是對土著微生物群落的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在Cr（VI）污染土壤中添加菌株BD6的修復(fù)過程中，若添加丙三醇則會對土壤微生物群落產(chǎn)生一定影響，短時間內(nèi)能提高微生物豐度和多樣性，可能一方面作為電子供體加快了Cr（VI）的還原從而降低土壤毒性，另一方面丙三醇作為外加碳源也能夠促進微生物的生長。同時，從群落結(jié)構(gòu)角度看，是否添加電子供體也有著較大的影響，在門水平上10 d時有無電子供體添加顯示出較大差異，15 d兩者有趨向一致的趨勢；在屬水平上，96 h兩者群落結(jié)構(gòu)由于BD6作為優(yōu)勢菌存在，兩者差異不顯著，而當10 d后，隨著菌株BD6豐度逐漸減少，是否添加電子供體則對群落結(jié)構(gòu)有較大影響。由圖4-B可以看出菌株BD6在96 h左右的短期內(nèi)一直是優(yōu)勢菌群，起到了重要的修復(fù)作用，而隨著時間延長菌株BD6迅速減少變?yōu)榉莾?yōu)勢菌，通過qPCR也進一步證實了菌株BD6在土壤中的這種定殖規(guī)律和變化趨勢，說明利用菌BD6修復(fù)土壤并不會使菌株長期存活于土壤中并與土著微生物產(chǎn)生競爭。

盆栽實驗?zāi)軌虮容^直觀地反映出污染土壤的毒性，本研究以大豆這種常見的經(jīng)濟作物作為盆栽研究對象，發(fā)現(xiàn)不同濃度Cr（VI）污染土壤會對大豆生長產(chǎn)生影響，大豆植株會將鉻吸收入體內(nèi)，且與土壤的Cr（VI）濃度呈正相關(guān)，這一結(jié)果與文獻［15］得出的結(jié)論相似。本研究將BD6用于土壤污染修復(fù)，最終得到了良好的修復(fù)效果，即植株生長良好，體內(nèi)吸收鉻的量顯著降低，分析原因應(yīng)該是Cr（VI）被還原為低毒性的Cr（III），Cr（III）更易被沉淀和固化下來而不易被植物吸收。

4 結(jié)論

菌株Microbacterium sp. BD6修復(fù)Cr（VI）污染土壤可以明顯改善大豆植株生長情況，且降低植株體內(nèi)鉻含量，能夠提升土壤中微生物多樣性，對土壤質(zhì)量有明顯的改善作用。菌株BD6數(shù)量在修復(fù)土壤Cr（VI）污染過程中一直呈下降趨勢，不會一直成為土壤中的優(yōu)勢菌，對土著微生物群落造成持續(xù)影響。