(閩江學(xué)院海洋研究院，福建 福州 350108)

0 引言

多板綱(Polyplacophora)屬于軟體動(dòng)物門(mén)，本綱動(dòng)物統(tǒng)稱(chēng)石鱉，是廣泛存在于潮間帶的海洋動(dòng)物，從熱帶到極地的世界各大洋中均有分布，通常在巖石上營(yíng)底棲附著生活，對(duì)潮間帶的生態(tài)平衡和能量流動(dòng)起著重要作用[1]。石鱉背部通常有八片連續(xù)的殼板，殼板被文石鱗片或針狀體環(huán)帶包圍，俗稱(chēng)“八節(jié)毛”“石鐵板”“鐵角”等。我國(guó)東南沿海石鱉種類(lèi)較多，例如紅條毛膚石鱉(Acanthochitonarubrolineata)、日本花棘石鱉(Liolophuurajaponica)、日本寬板石鱉(Placiphorellajaponica)和平瀨錦石鱉(Onithochitonhirasei)等[2]，其中紅條毛膚石鱉屬于毛膚石鱉科，屬于廣溫廣布性種類(lèi)，數(shù)量較多，也有研究表明該物種對(duì)醫(yī)治淋巴結(jié)核和麻風(fēng)病有一定的療效；日本花棘石鱉屬于石鱉科，是亞熱帶、熱帶暖水性種類(lèi)，在福建分布較為廣泛，而且日本花棘石鱉個(gè)體相對(duì)更大，常被沿海居民采捕食用。此外，石鱉的齒舌因結(jié)構(gòu)和磁性的特殊性受到廣泛關(guān)注，其磁性物質(zhì)為納米顆粒結(jié)構(gòu)，是有潛力的未來(lái)磁性納米材料來(lái)源之一[3]。

在軟體動(dòng)物門(mén)中，多板綱獨(dú)特的殼板使其具有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)。研究表明Pax(Paired-box)基因家族與動(dòng)物發(fā)育形態(tài)密切有關(guān)，編碼的蛋白是一組極為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育的器官形成中扮演重要角色。Pax基因家族的主要特征是編碼含有128個(gè)氨基酸組成的成對(duì)域(paired domain，PD)[4]，Pax蛋白通過(guò)成對(duì)域與DNA或其他蛋白相互作用，其主要功能包括：調(diào)控細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞自我更新、誘導(dǎo)前體細(xì)胞定向轉(zhuǎn)移以及改變特異細(xì)胞系的分化方向等[5]。研究表明Pax因子的非正常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種器官組織發(fā)育畸形[6]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域組成的差異將其分為不同的亞族：Pax1/9、Pax2/5/8、Pax3/7、Pax4/6、Poxneuro、Paxα/β和Paxeyg[7]。多板綱形態(tài)獨(dú)特，但目前軟體動(dòng)物中關(guān)于Pax基因家族的研究較少，在多板綱動(dòng)物中的研究幾乎為空白。

石鱉除了具有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)之外，在研究軟體動(dòng)物的起源與進(jìn)化中也有著重要的地位，是軟體動(dòng)物門(mén)中的原始類(lèi)群[8]。目前，關(guān)于多板綱動(dòng)物的分子數(shù)據(jù)較少，僅有少量線(xiàn)粒體基因組及線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因(COⅠ)數(shù)據(jù)[9-11]，對(duì)其分類(lèi)仍然主要依賴(lài)形態(tài)觀(guān)察，包括殼板、齒舌、外套膜的形態(tài)差異[12]。目前，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)多板綱進(jìn)行進(jìn)化分析是發(fā)展趨勢(shì)。豐富多板綱的分子數(shù)據(jù)有利于明確多板綱分類(lèi)，加深對(duì)其進(jìn)化地位的了解。因此，本文采用二代Illumina Hi-seq測(cè)序技術(shù)對(duì)紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉兩種石鱉種類(lèi)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)Unigene進(jìn)行功能注釋?zhuān)S富基因數(shù)據(jù)庫(kù)，為以后明確多板綱動(dòng)物分類(lèi)積累數(shù)據(jù)，為解析多板綱進(jìn)化地位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集和總RNA提取

在福建省廈門(mén)市淺灘采集兩種石鱉，依據(jù)形態(tài)特征和18S RNA鑒定物種分別是紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉[12]，將整個(gè)個(gè)體組織迅速放入液氮中速凍，隨后放在-80℃冰箱中保存。每個(gè)物種選取3個(gè)個(gè)體，將其混合在一起組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品，通過(guò)TRIzol法提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分析樣品RNA濃度和完整性，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 cDNA文庫(kù)建庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

石鱉的轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)、測(cè)序和拼接組裝委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。建庫(kù)使用的試劑盒為Illumina的NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit，以mRNA為模板，構(gòu)建cDNA雙鏈，庫(kù)檢合格后，通過(guò)Illumina Hi-seq進(jìn)行測(cè)序。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除帶接頭、含N、低質(zhì)量reads，同時(shí)對(duì)Clean data進(jìn)行Q20、Q30和GC含量計(jì)算，后續(xù)所有分析均是基于Clean data。

1.3 基因注釋和基因富集分析

鑒于石鱉無(wú)參考基因組，采用Trinity對(duì)Clean reads進(jìn)行拼接，將拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列作為后續(xù)分析的參考序列，取每條基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，進(jìn)行后續(xù)的分析。對(duì)轉(zhuǎn)錄本及Unigene的長(zhǎng)度分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。為獲得全面的基因功能信息，進(jìn)行了7大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋?zhuān)ǎ篘r、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG和GO。對(duì)基因進(jìn)行GO注釋之后，將注釋成功的基因按照GO的3個(gè)大類(lèi)(生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞組分，分子功能)的下一層級(jí)進(jìn)行分類(lèi)。

1.4 SSR分析

簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeats，SSR)的搜索與篩選采用MISA軟件，對(duì)應(yīng)的各個(gè)unit size(1-6)的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5，例如以二堿基重復(fù)單位計(jì)，最少重復(fù)數(shù)為6。對(duì)Unigene進(jìn)行SSR檢測(cè)。根據(jù)SSR兩端序列，采用Primer 3進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)。

1.5 Pax基因家族分析

通過(guò)對(duì)石鱉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行序列分析，得到部分或完整的Pax基因序列。通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域(http://smart.embl.de/)，選擇具有Pax結(jié)構(gòu)域的基因，同時(shí)下載已公布的軟體動(dòng)物Pax序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)，用MEGA 7.0自帶的ClustalW程序進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)，將兩端進(jìn)行人工修齊后，采用NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，同時(shí)采用1 000次bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)。將系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)導(dǎo)入iTOL網(wǎng)站(http://itol.embl.de/)進(jìn)行圖片處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 石鱉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量和基因統(tǒng)計(jì)

經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查、GC含量分布檢查等，獲得后續(xù)分析使用的Clean reads，數(shù)據(jù)匯總?cè)绫?所示。紅條毛膚石鱉樣品(AP)測(cè)序后得到60 666 664條原始reads數(shù)，數(shù)據(jù)過(guò)濾后得到50 109 686條reads數(shù)，Q20值和Q30值為96.20%和90.35%，GC含量為47.41%。日本花棘石鱉樣品(LJ)測(cè)序后得到48 856 746條原始reads數(shù)，過(guò)濾后得到48 052 466條reads數(shù)，Q20值和Q30值為97.08%和92.25%，GC含量為45.13%。

表1 石鱉的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基本信息

組裝獲得Unigene后，將所有Unigene在NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO和KOG 7大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白功能基本注釋?zhuān)⑨尳Y(jié)果見(jiàn)表2。紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉轉(zhuǎn)錄組共有121 892和83 776個(gè)Unigene。NR注釋到的Unigene所占比例最高，分別有30 299和22 827個(gè)Unigene被注釋?zhuān)辉贜T數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的Unigene所占比例最低，分別是5.03%和5.96%；綜合7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果，分別有3 111個(gè)和2 682個(gè)Unigene在7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均被注釋?zhuān)?9 908和29 528個(gè)Unigene至少在其中一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中有被注釋。

表2 在數(shù)據(jù)庫(kù)中基因注釋數(shù)目與注釋成功率

2.2 基因注釋和數(shù)據(jù)基本分析

GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)石鱉轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的基因富集的結(jié)果無(wú)顯著差異。富集最高的5個(gè)GO條目均是“生物學(xué)過(guò)程”的“Cellular process”“Metabolic process”“Single-organism process”和“分子功能”的“Binding”和“Catalytic activity”(圖1)。在KEGG分類(lèi)中，富集到基因數(shù)目最多的5個(gè)類(lèi)群依次是“Signal transduction”“Transport and catabolism”“Endocrine system”“Folding, sorting and degradation”和“Translation”(圖2)。

對(duì)紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉轉(zhuǎn)錄組的Unigene進(jìn)行SSR檢測(cè)，分別篩選到14 602個(gè)和15 531個(gè)SSR，單堿基重復(fù)單位SSR的重復(fù)次數(shù)主要集中在9～12次，其次是13～16次，2～5堿基重復(fù)單位SSR的重復(fù)次數(shù)主要集中5～8次(圖3)。

2.3 Pax分析

在紅條毛膚石鱉轉(zhuǎn)錄本中鑒定到5條Pax基因，包含3條Pax2/5/8，1條Pax1/9和1條Pax6，在日本花棘石鱉轉(zhuǎn)錄本中鑒定到3條Pax基因，分別是Pax1、Pax2/5/8和Pax2(表3)。根據(jù)已發(fā)表的軟體動(dòng)物Pax序列，整理歸納的Pax2/5/8基因及其剪切體有38條，Pax3/7基因及其剪切體有12條，Pax1/9基因及其剪切體有8條，Pax-α/β基因及其剪切體有2條，Pax6基因及其剪切體有20條(表4)。將以上公布的80條Pax基因和來(lái)自?xún)蓚€(gè)石鱉轉(zhuǎn)錄組的8條Pax序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果顯示軟體動(dòng)物Pax基因家族明顯聚為5類(lèi)(圖4)：Pax1/9、Pax2/5/8、Pax3/7、Pax-α/β和Pax6，石鱉的Pax基因與相同的基因亞族聚為一支，具有較高的同源性。

注：橫坐標(biāo)為GO3個(gè)大類(lèi)的下一層級(jí)的GO term，縱坐標(biāo)為注釋term下的基因個(gè)數(shù)。 Biological Pathway：生物學(xué)過(guò)程；Molecular Function：分子功能；Cellular Component：細(xì)胞組分。圖1 紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因的GO富集分類(lèi)圖Fig.1 The enriched GO terms of expression genes in the transcriptome of A. rubrolineata and L. japonica

注：圖中縱坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名稱(chēng)，橫坐標(biāo)為注釋到該通路下的基因個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋上的基因總數(shù)的比例。將基因根據(jù)參與的KEGG代謝通路分為5個(gè)分支：細(xì)胞過(guò)程(A，Cellular Processes)，環(huán)境信息處理(B，Environmental Information Processing)，遺傳信息處理(C，Genetic Information Processing)，代謝(D，Metabolism)，有機(jī)系統(tǒng)(E，Organismal Systems)。圖2 紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 Diagram of KEGG metabolic pathway enrichment of expression genes in the transcriptome of A. rubrolineata and L. japonica

圖3 SSR在紅條毛膚石鱉(a)和日本花棘石鱉(b)轉(zhuǎn)錄本中的密度分布Fig.3 Distribution of SSR in the transcriptome of A. rubrolineata(a) and L. japonica(b)

表3 紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉轉(zhuǎn)錄本中鑒定的Pax基因

表4 軟體動(dòng)物的Pax蛋白結(jié)構(gòu)域

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

注：箭頭表示在紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉轉(zhuǎn)錄本中鑒定的Pax基因。圖4 軟體動(dòng)物的Pax基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.4 The neighbour-joining phylogenetic tree of Pax in mollusca

3 討論

本研究通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)紅條毛膚石鱉和日本花棘石鱉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)組裝分別獲得了個(gè)121 892和83 776個(gè)Unigene，豐富了多板綱分子數(shù)據(jù)庫(kù)，為生物學(xué)性狀的解析奠定了基礎(chǔ)；通過(guò)對(duì)Unigene進(jìn)行SSR檢測(cè)，分別篩選到14 602個(gè)和15 531個(gè)SSR，可以用于開(kāi)發(fā)SSR位點(diǎn)，為多板綱的遺傳標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供資源。

Pax基因家族編碼一組發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)組織和器官特化起關(guān)鍵的調(diào)控作用。Pax基因通過(guò)選擇性的剪切方式產(chǎn)生多種亞型，這些亞型的蛋白產(chǎn)物單獨(dú)或形成多聚體或與其他蛋白結(jié)合形成復(fù)合體參與細(xì)胞的調(diào)控。在本研究中，在2個(gè)轉(zhuǎn)錄本中共鑒定到8條Pax基因，包含5條Pax2/5/8，2條Pax1/9和1條Pax6。不同的Pax亞家族各司其職，例如，Pax1/9在動(dòng)物的骨骼和胸腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]；Pax2/5/8參與軟體動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和排泄器官的發(fā)育過(guò)程[14]；Pax6在頭足類(lèi)的眼睛、腦、感覺(jué)器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用[15]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，多板綱的Pax基因是非常保守的轉(zhuǎn)錄因子，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中均與相對(duì)應(yīng)的軟體動(dòng)物Pax基因亞族聚為一支，同時(shí)也驗(yàn)證了基因注釋的準(zhǔn)確性。本文篩選的Pax基因不僅補(bǔ)充了對(duì)多板綱Pax基因家族的研究，同時(shí)也有利于將來(lái)解析多板綱獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)特性。

近年來(lái)，基于石鱉在生態(tài)學(xué)、古生物學(xué)、材料學(xué)、醫(yī)藥和食品等方面的研究和利用價(jià)值，多板綱這一重要海洋生物類(lèi)群日益受到關(guān)注。無(wú)論是其食用、藥用價(jià)值，還是其齒舌磁性納米材料開(kāi)發(fā)等方面，石鱉都是值得進(jìn)一步深入研究和發(fā)展的水產(chǎn)增養(yǎng)殖品種[16]。然而目前，我國(guó)對(duì)石鱉的研究才剛剛起步，也尚未對(duì)其進(jìn)行增養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)。相對(duì)于其他軟體動(dòng)物，人們對(duì)石鱉知之甚少，今后應(yīng)提高對(duì)該物種的重視，加強(qiáng)對(duì)該物種的理論基礎(chǔ)研究，豐富其綜合利用途徑。本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可為將來(lái)多板綱動(dòng)物的進(jìn)一步研究提供有用的基礎(chǔ)和資源。