劉守贊　葉建豐　王江銘　饒盈　馬丹丹　夏國(guó)華

摘要：為了更好地保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用堇葉紫金牛（Ardisia violacea W.Z.Fang et K.Yao）這一優(yōu)良的珍稀瀕危野生植物，采用帶葉莖段和不帶葉莖段進(jìn)行扦插繁殖，建立組培快繁體系，重點(diǎn)研究TDZ、6-BA和KT對(duì)莖段增殖培養(yǎng)的影響，優(yōu)化增殖培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，堇葉紫金牛帶葉莖段扦插成活率及后期生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于不帶葉莖段，成活率、開(kāi)花植株率、結(jié)實(shí)植株率分別為93.8%、76.12%和73.17%，結(jié)實(shí)植株平均果實(shí)數(shù)為3.63粒。建立了堇葉紫金牛組培快繁體系，優(yōu)化了不定芽增殖的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)TDZ增殖培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，當(dāng)TDZ濃度到達(dá)0.5 mg/L時(shí)，莖節(jié)部膨大增粗至原來(lái)的2倍以上，腋芽也明顯膨大，增殖倍率達(dá)314。堇葉紫金牛扦插和組培繁殖有效地解決了繁殖材料稀缺的問(wèn)題，對(duì)保護(hù)珍稀瀕危種質(zhì)資源提供了一條新途徑，同時(shí)為產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供技術(shù)儲(chǔ)備。

關(guān)鍵詞：堇葉紫金牛;扦插繁殖;組培繁殖;細(xì)胞分裂素

中圖分類(lèi)號(hào)： S793.905文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2021）19-0084-05

生物多樣性是人類(lèi)賴(lài)以生存的生物資源，是經(jīng)濟(jì)得以持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。珍稀瀕危植物是生物多樣性的重要組成部分，也是生物多樣性中最為脆弱、最容易消失的物種。我國(guó)是世界上植物物種多樣性最豐富的國(guó)家之一，現(xiàn)有高等植物3.1萬(wàn)種，約占世界總數(shù)的10%，但我國(guó)高等植物受威脅物種已達(dá)4 000～5 000種，占總種數(shù)的15%～20%，高于世界10%～15%的水平[1]。浙江省有5%～8%的植物不同程度地遭受到生存的威脅。為此，浙江省陸續(xù)開(kāi)展了珍稀瀕危植物調(diào)查[2-3]、致瀕機(jī)理[4]、繁育和解瀕技術(shù)[5]以及遺傳多樣性研究[6-8]，并取得了顯著成效。

堇葉紫金牛（Ardisia violacea W.Z.Fang et K.Yao）屬于紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia Swartz），產(chǎn)于我國(guó)的浙江、臺(tái)灣[9-10]和安徽[11]，其株型緊湊，葉脈紋理清晰，葉綠果艷，果期長(zhǎng)，具有極高的觀賞價(jià)值。目前對(duì)堇葉紫金牛的研究主要集中在分類(lèi)學(xué)[12-13]和生物生態(tài)學(xué)特性[14]方面。劉博文等調(diào)查了舟山本島的堇葉紫金牛所在群落的物種組成并分析其群落特征[15]。馬凱等用標(biāo)準(zhǔn)樣地法和每木調(diào)查法調(diào)查了堇葉紫金牛群落和結(jié)構(gòu)特征，并且研究了各個(gè)樣地內(nèi)的物種多樣性[16]。而堇葉紫金牛的繁殖技術(shù)方面研究較少[17-18]。本試驗(yàn)研究了堇葉紫金牛扦插繁殖和組培繁殖的相關(guān)情況，旨在為堇葉紫金牛的繁育提供技術(shù)儲(chǔ)備，有利于該物種脫離瀕危的現(xiàn)狀，為珍稀瀕危植物多樣性保護(hù)提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

堇葉紫金牛植株引自浙江省建德綠河塘林場(chǎng)。試驗(yàn)時(shí)間為2018年10月至2019年10月，試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在浙江農(nóng)林大學(xué)珍稀瀕危植物專(zhuān)類(lèi)園。臨安地處浙江省西北部天目山區(qū)，氣候溫暖濕潤(rùn)，光照充足，雨量充沛，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候。年平均氣溫16.4? ℃，1月平均氣溫為3.4 ℃，7月平均氣溫28.1 ℃，年降水量1 613.9 mm，年平均相對(duì)濕度82%，年日照時(shí)數(shù)1 847.3 h，平均無(wú)霜期237 d。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1扦插繁殖以54 cm×28 cm育苗盤(pán)為扦插容器，下部鋪設(shè)泥炭約6 cm、上部覆蓋珍珠巖約 4 cm 作為扦插基質(zhì)，插條設(shè)2個(gè)處理：帶葉莖段和不帶葉莖段，插穗具2節(jié)，長(zhǎng)約0.8 cm，插條基部 1/3 用NAA 300 mg/L浸泡5 min。處理30根插條，重復(fù)3次。在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照度約為250 μmol/（m2·s），光照時(shí)間為16 h/d。扦插60 d后，統(tǒng)計(jì)成活率，并移栽到一加侖塑料盆（口徑16 cm，底徑13 cm，高度 175 cm）中，栽培基質(zhì)配比為田園土 ∶泥炭 ∶珍珠巖=1 ∶1 ∶1（體積比）。2015年5月統(tǒng)計(jì)開(kāi)花植株比例，8月統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)植株比例和結(jié)實(shí)植株果實(shí)數(shù)，統(tǒng)計(jì)平均值。

1.2.2組培繁殖將種子用洗滌劑漂洗30 min，流水沖洗10 min，然后在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇浸泡15 s，0.1% HgCl2滅菌10～15 min，無(wú)菌水漂洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干材料上的水分，放入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以種子無(wú)菌萌發(fā)獲得的莖段建立組培體系。研究6-BA、KT和TDZ對(duì)莖段增殖培養(yǎng)的影響，6-BA和KT的濃度分別為0.5、1.0、20、4.0 mg/L，TDZ的濃度分別為0.1、0.2、0.5、10 mg/L，以不添加細(xì)胞分裂素為對(duì)照（CK），以上培養(yǎng)基均添加IBA 0.5 mg/L。MS基本培養(yǎng)基由 30 g/L 蔗糖和6.8 g/L瓊脂組成。每個(gè)處理10瓶，每瓶接種3個(gè)莖段，重復(fù)3次，比較不同細(xì)胞分裂素在不同濃度下對(duì)不同外植體的影響。所有增殖培養(yǎng)基中，pH值均為5.8，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃;光照度約為30μmol/（m2·s），光照時(shí)間為16 h/d。

1.2.3生根培養(yǎng)與煉苗移栽叢生芽長(zhǎng)至4～5 cm 時(shí)，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+IBA 0.25 mg/L +NAA 0.25 mg/L中進(jìn)行培養(yǎng)，每株苗具5～7張葉時(shí)即可移栽。待苗高約6 cm時(shí)，植株具有2～4條健壯根，將培養(yǎng)瓶蓋打開(kāi)，放到全天自然光照、溫度 25 ℃ 的通風(fēng)條件下煉苗7～10 d，移栽時(shí)用鑷子將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽入已滅過(guò)菌的營(yíng)養(yǎng)土中，基質(zhì)配比為泥炭 ∶蛭石=1 ∶1，移栽后7～10 d用塑料薄膜保濕，保持空氣濕度85%以上，噴霧頻率為1～2次/d。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2016和SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1堇葉紫金牛扦插繁殖

由表1、圖1可知，堇葉紫金牛帶葉莖段和不帶葉莖段扦插成活及生長(zhǎng)結(jié)實(shí)均具有顯著性差異。帶葉莖段扦插成活率、次年開(kāi)花結(jié)實(shí)植株率顯著高于不帶葉莖段。帶葉莖段插穗生根早、植株健壯，扦插成活率高達(dá)93.80%，次年開(kāi)花植株、結(jié)實(shí)植株率分別達(dá)到76.12%、73.17%，結(jié)實(shí)植株平均果實(shí)數(shù)3.63粒。扦插后15 d左右開(kāi)始在切口基部發(fā)生2～3條白色新根，25 d后新芽萌發(fā)，根系生長(zhǎng)迅速，此后根系植株生長(zhǎng)健壯。不帶葉莖段插穗生根、萌芽均較遲，植株細(xì)弱，成活率較低，為8560%，次年開(kāi)花植株、結(jié)實(shí)植株率和結(jié)實(shí)植株平均果實(shí)數(shù)明顯較低，分別為18.42%、1333%和1.17粒。

2.2堇葉紫金牛組培繁殖

2.2.1堇葉紫金牛組培繁殖體系建立將由種子萌發(fā)和腋芽生長(zhǎng)形成的莖段剪成帶2～3個(gè)芽的莖段，接入MS+6-BA 0.1～3.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)莖段僅頂端1個(gè)腋（頂）芽萌發(fā)。待芽長(zhǎng)至4～6 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+IBA 025 mg/L+NAA 0.25 mg/L中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)約15 d開(kāi)始出現(xiàn)新根，生根率達(dá)95%以上，待苗長(zhǎng)出 2～4條/株長(zhǎng)約5 cm的健壯新根，苗高約6 cm，具葉5～7張/株時(shí)移栽（圖2）。

2.2.2不同細(xì)胞分裂素對(duì)堇葉紫金牛莖段增殖培養(yǎng)的影響由于堇葉紫金牛莖段增殖較為困難，因此采用不同細(xì)胞分裂素種類(lèi)和濃度對(duì)堇葉紫金牛進(jìn)行培養(yǎng)，研究對(duì)其增殖培養(yǎng)的影響。由圖3、表2可知，細(xì)胞分裂素種類(lèi)對(duì)堇葉紫金牛莖段增殖培養(yǎng)存在顯著性差異。在增殖培養(yǎng)后59 d時(shí)，TDZ對(duì)堇葉紫金牛莖段增殖的作用效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，在0.1～0.5 mg/L 的濃度范圍內(nèi)，隨著TDZ濃度的升高，莖段的增殖倍率增大，當(dāng)濃度到達(dá) 0.5 mg/L 時(shí)，增殖倍率最高，達(dá)到3.14，同時(shí)莖節(jié)部

膨大增粗至原來(lái)的2倍以上，腋芽也明顯膨大;當(dāng)濃度到達(dá)1.0 mg/L時(shí)，增殖倍率下降到3.10。而在未添加任何細(xì)胞分裂素的CK中，增殖倍率僅為060，植株較矮小，腋芽不明顯。

由圖3、表2還可知，6-BA、KT的培養(yǎng)基中頂端1芽萌發(fā)，其他腋芽極少萌發(fā)，增殖倍率均未達(dá)到1。在0.5～1.0 mg/L濃度范圍中，增殖倍率隨著6-BA濃度的增大而增加，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，增殖倍率開(kāi)始下降，且下降幅度較大，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4.0 mg/L以上，增殖倍率僅為0.1，腋芽成為極度縮短的莖，莖節(jié)部明顯膨大增粗，且植株不伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。隨著KT濃度的升高（0.5～1.0 mg/L范圍），莖段的增殖倍率反而減小，當(dāng)濃度達(dá)到 1.0 mg/L 后，增殖倍率又略微增加。

3討論與結(jié)論

堇葉紫金牛扦插繁殖以帶葉莖段插穗成活率較高，達(dá)到93.80%，不帶葉莖段較低，為85.60%，均能滿(mǎn)足生產(chǎn)上的應(yīng)用。葉才華等對(duì)矮紫金牛進(jìn)行不同留葉量扦插繁殖的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)帶葉莖段和不帶葉莖段的扦插成活率均在85%左右[19]，低于本試驗(yàn)結(jié)果，這可能是受不同紫金牛物種和不同扦插條件影響。因此，在繁殖材料較少的條件下，不帶葉的堇葉紫金牛莖段也能用作插穗，但扦插成活后生長(zhǎng)較差，開(kāi)花結(jié)實(shí)推遲。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度是植物組織培養(yǎng)中芽誘導(dǎo)、增殖以及生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素，細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素能明顯促進(jìn)腋芽啟動(dòng)和增殖生長(zhǎng)，常用的細(xì)胞分裂素有6-BA、NAA、TDZ等[20]。研究表明，6-BA 對(duì)不定芽誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，添加適量的6-BA有利于不定芽的形成[21-22]。本試驗(yàn)建立了堇葉紫金牛組培快繁技術(shù)體系，發(fā)現(xiàn)堇葉紫金牛添加 6-BA 誘導(dǎo)芽增殖困難，重點(diǎn)研究了不同細(xì)胞分裂素種類(lèi)和濃度對(duì)堇葉紫金牛莖段增殖培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，3種不同種類(lèi)和濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)堇葉紫金牛培養(yǎng)影響差異較大，在含有TDZ細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，莖節(jié)部和腋芽明顯膨大，增殖倍率均在2以上，增殖效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，而 6-BA 在一定濃度范圍內(nèi)的增殖效果要顯著優(yōu)于KT，這與孫駿威等的研究結(jié)果[23]類(lèi)似。孫英坤等對(duì)堇葉紫金牛組培快繁研究發(fā)現(xiàn)，最佳叢生芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基為改良MS（硝酸鉀含量1 200 mg/L，其他組分不變）+ TDZ 0.50 mg/L + NAA 0.10 mg/L[18]，這與本研究結(jié)果一致，也與前人在元寶楓、藍(lán)莓等增殖培養(yǎng)中TDZ的應(yīng)用效果[24-26]一致。

堇葉紫金牛帶葉莖段和不帶葉莖段存在顯著性差異，帶葉莖段扦插成活率及后期生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于不帶葉莖段，成活率、開(kāi)花植株率、結(jié)實(shí)植株率分別為93.8%、76.12%和73.17%，結(jié)實(shí)植株平均果實(shí)數(shù)為3.63粒。建立了堇葉紫金牛組培快繁體系，并且優(yōu)化了不定芽增殖的培養(yǎng)條件，TDZ是堇葉紫金牛莖段增殖效果最佳的細(xì)胞分裂素，當(dāng)TDZ濃度到達(dá)0.5 mg/L時(shí)，增殖效果最佳，增殖倍率達(dá)到3.14。

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基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：LY16C030004、LQ17C160005）;浙江省林業(yè)局林業(yè)發(fā)展和資源保護(hù)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：浙林規(guī)〔2019〕90號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：劉守贊（1979—），男，河北武強(qiáng)人，碩士，講師，主要從事植物資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：szliu@zafu.edu.cn。

通信作者：夏國(guó)華，碩士，副教授，主要從事植物資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：zjfc_ghxia@126.com。