亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理?xiàng)钅局苽涞途勰咎呛蛦翁?/h1>
2021-11-18 10:56:14文沛瑤張軍華
林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè) 2021年5期
方 鑫,文沛瑤,徐 勇,張軍華,2*
(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,江蘇 南京210037;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西 楊凌712100)
隨著人們生活品質(zhì)的提高,以低聚木糖為主的益生性功能食品受到廣泛關(guān)注。低聚木糖(XOS)具有降低血液膽固醇、維持腸胃健康、降低結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)等功效[1]。酶解法是定向酶解木聚糖制備低聚木糖的主要方法,該法清潔、溫和,生產(chǎn)的低聚木糖純度高、副產(chǎn)物少,可以減輕后續(xù)分離純化的負(fù)擔(dān)。預(yù)處理是酶解前的一個(gè)重要步驟,其目的是破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的酶解法是首先通過預(yù)處理從生物質(zhì)原料中提取木聚糖后再采用木聚糖酶水解制備低聚木糖。近年來,采用木聚糖酶直接水解預(yù)處理后的生物質(zhì)原料制備低聚木糖逐漸成為熱點(diǎn)。Wu等[2]研究了一種熱穩(wěn)定型重組木聚糖酶用于水解經(jīng)過水熱處理后的玉米芯,最終低聚木糖的產(chǎn)率最高為26.4%。Chang等[3]在超高壓條件下預(yù)處理玉米芯后,再添加木聚糖酶水解,獲得的低聚木糖得率較未處理原料提升了180.3%。但是,水熱預(yù)處理和超高壓預(yù)處理均需要在苛刻的條件下進(jìn)行,對儀器設(shè)備要求高。此外,木質(zhì)素還會通過物理阻礙和非生產(chǎn)性吸附作用降低酶對底物的可及度,抑制木質(zhì)纖維原料糖化。亞氯酸鈉預(yù)處理因反應(yīng)條件溫和、可選擇性脫除木質(zhì)素而被廣泛報(bào)道[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),楊木經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理后,木質(zhì)素脫除率高達(dá)70.3%,但底物中木聚糖的水解仍然受到限制。采用氫氧化鈉在溫和條件下進(jìn)行第二步處理可有效促進(jìn)木聚糖水解,提升木質(zhì)纖維原料單糖得率[6]。然而,基于亞氯酸鈉和堿預(yù)處理組合木聚糖酶法制備低聚木糖的相關(guān)研究較少。楊木作為一種生長快、分布廣泛的闊葉材,其半纖維素主要為木聚糖,可用于制備低聚木糖。本研究采用亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理?xiàng)钅?然后分別利用木聚糖酶和纖維素酶水解預(yù)處理后的楊木制備低聚木糖和單糖,考察不同預(yù)處理?xiàng)l件下楊木化學(xué)組分及結(jié)構(gòu)特性的變化,探究兩步預(yù)處理?xiàng)l件對低聚木糖和單糖得率的影響,以期為楊木的高價(jià)值化利用奠定理論基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料、試劑與儀器
楊木來自于江蘇宿遷,經(jīng)粉碎后全部過篩,取粒徑≤0.25 mm的部分經(jīng)自然風(fēng)干后儲存在密封袋中備用。亞氯酸鈉(純度80%)和氫氧化鈉(分析純)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。纖維素酶CTec2和內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶X2753(Aspergillusoryzae)均購自上海的Sigma-Aldrich公司,酶活分別為120.4 FPU/mL(每毫升170.8 mg酶蛋白)和2 500.0 U/g。木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖標(biāo)準(zhǔn)樣品購自Megazyme公司(愛爾蘭)。
HC 800Y粉碎機(jī);Agilent 1260高效液相色譜,Aminex Bio-Rad HPX-87H色譜柱和示差折光檢測器,美國安捷倫科技有限公司;Dionex ICS-5000高效液相陰離子交換色譜,CarboPacTMPA-200色譜柱(250 mm×4 mm),美國賽默飛世爾科技公司;Quanta 200掃描電鏡(SEM),美國FEI公司;UltimaⅣX射線粉末衍射(XRD)儀,日本Rigaku公司;AXISUltra DLD X射線光電子能譜(XPS)儀,英國Kratos公司。
1.2 亞氯酸鈉預(yù)處理
取10 g(干質(zhì)量)楊木和配置好的100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的亞氯酸鈉水溶液,在250 mL的錐形瓶中混合后置于70℃的恒溫水浴鍋中分別反應(yīng)0.5、1和3 h(SC0.5、SC1和SC3)。反應(yīng)結(jié)束后,通過真空抽濾將固體殘?jiān)皖A(yù)處理液進(jìn)行分離。抽濾過程中用蒸餾水洗滌固體殘?jiān)林行?置于-18℃冰箱中備用。每個(gè)條件進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.3 氫氧化鈉后處理
將5 g亞氯酸鈉預(yù)處理后的楊木(SC0.5、SC1和SC3)和50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氫氧化鈉在100 mL的錐形瓶中混合,置于50℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h[6],對應(yīng)的預(yù)處理樣品標(biāo)記為SC0.5-SH、SC1-SH和SC3-SH。反應(yīng)結(jié)束后,通過真空抽濾分離固體殘?jiān)皖A(yù)處理液,用蒸餾水洗滌殘?jiān)料礈煲航咏行院笫占腆w殘?jiān)?風(fēng)干后置于-18℃冰箱中備用。每個(gè)條件進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.4 木聚糖酶水解
分別以SC和SC-SH預(yù)處理后楊木為底物,在50℃、150 r/min的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行木聚糖酶水解,分別以亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后楊木為底物,底物質(zhì)量濃度為20 g/L,酶用量為600 U/g(以底物質(zhì)量計(jì),下同),水解體系體積為5 mL,用50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液維持體系pH值為4.8,反應(yīng)時(shí)間48 h。酶水解結(jié)束后,離心(10 000 r/min,10 min)分離固體殘?jiān)退庖?。采用高效液相陰離子交換色譜測定水解液中的低聚木糖(XOS)含量,每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.5 纖維素酶水解
纖維素酶水解實(shí)驗(yàn)在50℃、150 r/min的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行,底物為亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后且被木聚糖酶水解后的楊木固體殘?jiān)?底物質(zhì)量濃度為20 g/L,酶蛋白用量為10、30和60 mg/g(以底物質(zhì)量計(jì),下同),水解體系體積為3 mL,用50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液維持體系pH值為4.8,反應(yīng)時(shí)間72 h。酶水解結(jié)束后,離心(10 000 r/min,10 min)分離固體殘?jiān)退庖?采用高效液相色譜測定水解液中的單糖含量。每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.6 分析方法
1.6.1化學(xué)成分分析原料和預(yù)處理后的固形物化學(xué)組成按照美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室提供的分析方法進(jìn)行分析[7]。預(yù)處理后固形物的回收率、固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)的移除率以及低聚木糖得率的計(jì)算公式見式(1)～(3):
式中:R—預(yù)處理后固形物的回收率,%;M1—預(yù)處理后固形物的質(zhì)量,g;M2—預(yù)處理前固形物的質(zhì)量,g;r—固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)移除率,%;m1—預(yù)處理前固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)的質(zhì)量,g;m2—預(yù)處理后固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)的質(zhì)量,g;Y—低聚木糖得率,%;m3—酶水解液中聚合度2～6的低聚木糖的質(zhì)量,g;m4—預(yù)處理?xiàng)钅緲悠分心揪厶堑馁|(zhì)量,g。
單糖的水解得率計(jì)算參照Hao等[1]的報(bào)道。其中葡萄糖和木糖的測定采用Agilent 1260高效液相色譜測定,流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸,流速為0.6 mL/min。酶水解液中低聚木糖(聚合度2～6)采用Dionex ICS-5000高效液相陰離子交換色譜檢測,使用CarboPacTMPA-200色譜柱。
1.6.2SEM分析 采用Quanta 200掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)樣品的表面形貌。樣品在成像前進(jìn)行噴金處理,以增強(qiáng)其導(dǎo)電性。儀器的工作電壓為25 kV。
1.6.3XRD分析 采用UltimaⅣX射線粉末衍射儀,以銅靶為X射線源,進(jìn)行XRD分析并測定了樣品結(jié)晶度(ICr)。掃描速率5(°)/min,并根據(jù)ICr=(I002-Iam)/I002×100%計(jì)算ICr。其中I002和Iam分別是最大(約22.5°)和最小(約18°)衍射峰強(qiáng)度。
1.6.4XPS分析 采用AXISUltra DLD X射線光電子能譜儀分析樣品表面的元素組成和化學(xué)鍵分布。
1.6.5可及性分析采用剛果紅染料(DR 28)吸附法,用Langmuir吸附等溫線計(jì)算得到最大吸附容量(Γmax)代表樣品對酶的可及性。將DR 28溶液(0.00、0.05、0.10、1.00、2.00、3.00和4.00 g/L)與10 g/L樣品(0.06 g)在10 mL離心管中混合,混合物在150 r/min,50℃下吸附24 h。吸附反應(yīng)結(jié)束后,離心分離上清液,在498 nm下測定吸光度并計(jì)算上清液中游離染料的濃度,以及底物對染料的吸附量。每個(gè)樣品的吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。
2 結(jié)果與討論
2.1 亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜姆治雠c表征
2.1.1化學(xué)組成未經(jīng)預(yù)處理的楊木和亞氯酸鈉(SC)預(yù)處理后的楊木組分如表1所示。
表1 亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜幕瘜W(xué)組成Table 1 Chemical composition of poplar after sodium chlorite pretreatment
原料楊木的葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40.0%、17.8%和28.0%。亞氯酸鈉預(yù)處理3 h后,木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則由初始的28.0%下降到SC3的11.3%,木質(zhì)素的去除使葡聚糖和木聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高至42.9%和19.4%。雖然固形物的回收率分別在84.6%～89.0%之間,但葡聚糖和木聚糖的回收率均超過90%和88%。類似的結(jié)果也在之前的研究中報(bào)道過,Nan等[8]采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的亞氯酸鈉在80℃處理荻草0.5～24 h后,其葡聚糖和木聚糖的回收率也均超過80%。由此表明,亞氯酸鈉預(yù)處理可以選擇性脫除楊木中的木質(zhì)素,同時(shí)保留大量的碳水化合物組分。此外,經(jīng)過預(yù)處理后,楊木中的乙?；坑兴仙?這可能是預(yù)處理后乙酰化纖維素或木聚糖的含量有所增加導(dǎo)致的[9]。
2.1.2SEM分析 未處理和亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜膾呙桦婄R圖片如圖1所示,由圖1可觀察到未進(jìn)行預(yù)處理的楊木表面纖維結(jié)構(gòu)完整且光滑。經(jīng)亞氯酸鈉預(yù)處理后,原料表面的剛性纖維結(jié)構(gòu)被不同程度地破壞,纖維表面出現(xiàn)裂紋、空腔,其中SC3的纖維結(jié)構(gòu)被破壞的最嚴(yán)重。在底物SC1的纖維結(jié)構(gòu)中,還觀察到不同孔徑大小的纖維孔隙。這一表面現(xiàn)象與之前報(bào)道相似,這是預(yù)處理過程中木質(zhì)素被脫除所致。據(jù)報(bào)道,亞氯酸鈉預(yù)處理初期去除的是細(xì)胞角隅區(qū)和復(fù)合胞間層的木質(zhì)素,中后期主要去除的是復(fù)合胞間層和次生壁的木質(zhì)素[10]。木質(zhì)素的去除可導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的坍塌和裂紋的出現(xiàn),從而增加樣品表面積,有利于后續(xù)酶水解的進(jìn)行,類似的結(jié)果也在其他研究中被報(bào)道[11]。
圖1 未處理?xiàng)钅竞蛠喡人徕c預(yù)處理?xiàng)钅镜膾呙桦婄R圖(×800)Fig.1 SEM images of unpretreated poplar and SC-pretreated poplar(×800)
2.1.3XPS、XRD和纖維素可及性分析 表2列舉了未經(jīng)過處理和經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜谋砻嬖亟M成。
表2 不同楊木樣品的表面元素組成、結(jié)晶度和纖維素可及性分析Table 2 Surface elemental compositions,crystallinity and cellulose accessibility analysis of different poplar samples
據(jù)報(bào)道,XPS光譜中的C—C/C—H結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰主要來源于木質(zhì)素和萃取物,該峰的面積越大,表明樣品表面的木質(zhì)素含量越高[12]。C—O和C==O/O—C—O結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰分別來源于纖維素和半纖維素。從表2中可以看出C—C/C—H結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積從原始的49.3%先減小再增加,C—O和C==O/O—C—O結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積先增加后減小。該現(xiàn)象可能是因?yàn)樵陬A(yù)處理的初始階段木質(zhì)素不斷脫除,使纖維素和半纖維素含量上升。經(jīng)過長時(shí)間處理后溶液中的木質(zhì)素和多糖降解產(chǎn)物形成了假木質(zhì)素并沉積到原料表面所致[13]。最終使C—C/C—H結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積上升,而C==O/O—C—O結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積下降。另外通過XRD技術(shù)檢測了樣品的結(jié)晶度,如表2所示,與未處理的楊木相比,預(yù)處理后的楊木樣品結(jié)晶度均有所上升,均達(dá)到或超過55%。結(jié)晶度的上升主要是由于木質(zhì)素和非結(jié)晶態(tài)半纖維素的去除所致[14]?？杉靶詫?shí)驗(yàn)中,4種底物對剛果紅的最大吸附量分別為240.4、259.3、355.1和566.5 mg/g,吸附量越大說明其可及性越高。隨著預(yù)處理時(shí)間的延長,最大吸附量逐漸增大,可及性增加。這是因?yàn)轭A(yù)處理時(shí)間越長,原有的纖維結(jié)構(gòu)被破壞的更加嚴(yán)重,有更多的木質(zhì)素被脫除而使底物孔隙率增大,即纖維素的可及性得到了更大的提高[15]。
2.2 氫氧化鈉處理
有文獻(xiàn)報(bào)道,采用堿對亞氯酸鈉處理后的楊木進(jìn)行第二步處理,可以極大地提升楊木的木聚糖水解得率,并且有效降低纖維素酶用量[6]。因此,本研究采用氫氧化鈉(SH)對亞氯酸鈉處理后的楊木進(jìn)行第二步預(yù)處理,以提高葡聚糖和木聚糖的可降解性能。亞氯酸鈉預(yù)處理的楊木經(jīng)過氫氧化鈉預(yù)處理后,木質(zhì)素的量分別從22.9%(SC0.5)、20.5%(SC1)、11.3%(SC3)降低到10.6%(SC0.5-SH)、4.7%(SC1-SH)、2.9%(SC2-SH),木質(zhì)素的移除率為67.9%～85.4%(表3),超過95%的葡聚糖和70%左右的木聚糖在預(yù)處理過程中被保留。此外,經(jīng)過氫氧化鈉進(jìn)一步預(yù)處理后,楊木的乙?；鶑?%左右(表1)降低至0%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,乙?；娜コ欣谠黾用笇w維素的可及性從而促進(jìn)酶水解[16]。
表3 亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理后楊木的化學(xué)組成1)Table 3 Chemical composition of poplar after SC and SH two-step pretreatment %
2.3 預(yù)處理后樣品的酶水解
2.3.1木聚糖酶水解以亞氯酸鈉處理的楊木為對照組,對兩步預(yù)處理后的楊木采用木聚糖酶水解制備低聚木糖。不同底物的低聚木糖得率如表4所示。
表4 兩步預(yù)處理對楊木木聚糖水解制備低聚木糖的影響Table 4 Effect of two-step pretreatment on enzymatic preparation of xylooligosaccharides
只經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理的楊木經(jīng)木聚糖酶水解得到的低聚木糖總得率分別為1.06%、1.60%和5.85%。經(jīng)過亞氯酸鈉-氫氧化鈉處理后,3種底物的低聚木糖得率分別提升至41.62%(SC0.5-SH)、43.74%(SC1-SH)和47.20%(SC3-SH),相對未經(jīng)堿處理的底物,低聚木糖的得率分別提高了38.3、26.5、7.1倍。堿處理有效地促進(jìn)了底物中木聚糖的水解,顯著地提高了低聚木糖的得率。此外,經(jīng)過堿處理后,SC3酶水解液中的木糖與低聚木糖質(zhì)量比值從0.33降低至0.20[1],這表明堿處理還減少了酶水解液中的木糖。這可能是因?yàn)閴A處理移除了楊木中大量木質(zhì)素之后,提高了楊木樣品中木聚糖對木聚糖酶的可及性,導(dǎo)致低聚木糖得率大幅度提高(表4),從而使木糖質(zhì)量/低聚木糖質(zhì)量的比值明顯降低。值得注意的是,經(jīng)過堿處理后,在楊木水解液中低聚木糖的主要組成為木二糖,3種底物所得的木二糖得率分別達(dá)到41.0%、43.19%和46.97%,占水解液中低聚木糖的組成98%以上。
2.3.2纖維素酶水解
2.3.2.1亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅久杆庑适窃u價(jià)預(yù)處理效果的重要指標(biāo)。以未處理的楊木為對照,對3種不同預(yù)處理時(shí)間的亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜孜镞M(jìn)行了纖維素酶水解實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2所示。當(dāng)酶用量為10 mg/g時(shí),經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理0.5 h后,楊木的葡萄糖和木糖得率分別從8.4%和4.8%提升至12.4%和8.4%;延長預(yù)處理時(shí)間至3 h后,葡萄糖和木糖得率分別提升至30.0%和24.3%。這是由于亞氯酸鈉預(yù)處理移除了楊木中的木質(zhì)素,從而增加了纖維素酶對纖維素的可及性,改善了楊木酶水解效果[5]。由于本研究所用的商品纖維素酶中含有木聚糖酶,所以它能將底物中的木聚糖水解而產(chǎn)生木糖。繼續(xù)增加酶用量至60 mg/g時(shí),SC3的葡萄糖和木糖得率最高,分別為85.2%和59.0%。本研究結(jié)果與Siqueira等[4]和Wen等[6]所報(bào)道的一致。
圖2 亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜睦w維素酶水解Fig.2 Cellulase hydrolysis of poplar after sodium chlorite pretreatment
2.3.2.2木聚糖酶水解殘?jiān)?jīng)過木聚糖酶水解后,將楊木水解殘?jiān)M(jìn)行纖維素酶水解制備單糖,結(jié)果見表5。在酶用量10 mg/g條件下,3種底物均呈現(xiàn)出較高的水解效率。SC0.5-SH、SC1-SH和SC3-SH的葡萄糖得率分別為41.1%、55.5%和64.7%。繼續(xù)增加酶用量至30 mg/g,葡萄糖得率分別提升至81.4%、84.0%和90.2%,比亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅驹?0 mg/g的纖維素酶用量下的得率更高。由此,證實(shí)堿處理不僅使底物中的木聚糖更容易水解,還促進(jìn)了纖維素的酶水解特性。值得注意的是,表5中各原料的木糖得率均低于葡萄糖得率,這是因?yàn)榈孜镏幸子谒獾哪揪厶且驯凰鉃榈途勰咎?表4),因此該商品纖維素酶中存在的木聚糖酶很難將楊木中殘留的木聚糖水解為木糖。
表5 木聚糖酶水解殘?jiān)睦w維素酶水解Table 5 Cellulase enzymatic hydrolysis of SC-SH-pretreated poplar
2.4 物料衡算
圖3是1 kg楊木經(jīng)亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后,經(jīng)木聚糖酶水解制備低聚木糖和纖維素酶水解制備單糖的物料衡算圖。如圖3所示,1 kg楊木在70℃下經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%亞氯酸鈉處理3 h后,可得到846.0 g的預(yù)處理?xiàng)钅尽Ｈ糁苯咏?jīng)纖維素酶水解后可獲得181.0 g的葡萄糖和62.1 g木糖。若將亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅驹?0℃下經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%氫氧化鈉處理1 h后,再經(jīng)木聚糖酶水解制備低聚木糖后,纖維素酶水解木聚糖酶水解的殘?jiān)苽鋯翁?。整個(gè)工藝流程可獲得52.5 g的低聚木糖、317.6 g葡萄糖和49.9 g木糖。Hao等[1]報(bào)道采用過氧化氫-乙酸預(yù)處理?xiàng)钅竞筮M(jìn)行兩步酶水解制備低聚木糖和單糖,1 kg楊木可獲得16.9 g低聚木糖和296.4 g葡萄糖。相比過氧化氫-乙酸預(yù)處理,楊木經(jīng)過亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理后有著更高的低聚木糖和葡萄糖產(chǎn)量。亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理均在較溫和的條件下進(jìn)行,亞氯酸鈉預(yù)處理后產(chǎn)生的氯氣可以回收后循環(huán)利用[17]。因此,本研究所采用的亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理酶法制備低聚木糖和單糖有著較好的應(yīng)用潛力。
圖3 楊木酶法水解制備低聚木糖和單糖的物料衡算Fig.3 Mass balance of xylooligosaccharides and monosaccharides production from poplar
3 結(jié) 論
3.1以楊木為原料,研究了亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理對楊木酶水解制備低聚木糖和單糖的影響,結(jié)果表明:經(jīng)亞氯酸鈉在70℃下預(yù)處理3 h后,楊木木質(zhì)素移除率達(dá)到65.8%,葡聚糖和木聚糖的保留率均在90%以上。預(yù)處理還能移除底物表面的木質(zhì)素,提高底物結(jié)晶度,改善纖維素酶對底物中纖維素的可及性。
3.2楊木經(jīng)亞氯酸鈉處理3 h和氫氧化鈉處理1 h后,經(jīng)木聚糖酶水解后獲得的低聚木糖得率達(dá)到47.2%,相比未經(jīng)氫氧化鈉預(yù)處理的楊木,低聚木糖得率提高了7.1倍。其中木二糖為主要成分,占98%以上。木聚糖酶水解后得到的固形物經(jīng)30 mg/g的纖維素酶水解后葡萄糖得率為90.2%,木糖得率為35.3%。
3.3物料衡算結(jié)果表明,1 kg楊木經(jīng)亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后,再經(jīng)木聚糖酶和纖維素酶兩步酶水解可獲得52.5 g低聚木糖、317.6 g葡萄糖和49.9 g木糖。亞氯酸鈉和氫氧化鈉的預(yù)處理溫度分別為70℃和50℃,反應(yīng)條件溫和,得到的低聚木糖和單糖得率較高,副產(chǎn)物少,具有較好的應(yīng)用潛力。
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方 鑫,文沛瑤,徐 勇,張軍華,2*
(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,江蘇 南京210037;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西 楊凌712100)
隨著人們生活品質(zhì)的提高,以低聚木糖為主的益生性功能食品受到廣泛關(guān)注。低聚木糖(XOS)具有降低血液膽固醇、維持腸胃健康、降低結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)等功效[1]。酶解法是定向酶解木聚糖制備低聚木糖的主要方法,該法清潔、溫和,生產(chǎn)的低聚木糖純度高、副產(chǎn)物少,可以減輕后續(xù)分離純化的負(fù)擔(dān)。預(yù)處理是酶解前的一個(gè)重要步驟,其目的是破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的酶解法是首先通過預(yù)處理從生物質(zhì)原料中提取木聚糖后再采用木聚糖酶水解制備低聚木糖。近年來,采用木聚糖酶直接水解預(yù)處理后的生物質(zhì)原料制備低聚木糖逐漸成為熱點(diǎn)。Wu等[2]研究了一種熱穩(wěn)定型重組木聚糖酶用于水解經(jīng)過水熱處理后的玉米芯,最終低聚木糖的產(chǎn)率最高為26.4%。Chang等[3]在超高壓條件下預(yù)處理玉米芯后,再添加木聚糖酶水解,獲得的低聚木糖得率較未處理原料提升了180.3%。但是,水熱預(yù)處理和超高壓預(yù)處理均需要在苛刻的條件下進(jìn)行,對儀器設(shè)備要求高。此外,木質(zhì)素還會通過物理阻礙和非生產(chǎn)性吸附作用降低酶對底物的可及度,抑制木質(zhì)纖維原料糖化。亞氯酸鈉預(yù)處理因反應(yīng)條件溫和、可選擇性脫除木質(zhì)素而被廣泛報(bào)道[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),楊木經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理后,木質(zhì)素脫除率高達(dá)70.3%,但底物中木聚糖的水解仍然受到限制。采用氫氧化鈉在溫和條件下進(jìn)行第二步處理可有效促進(jìn)木聚糖水解,提升木質(zhì)纖維原料單糖得率[6]。然而,基于亞氯酸鈉和堿預(yù)處理組合木聚糖酶法制備低聚木糖的相關(guān)研究較少。楊木作為一種生長快、分布廣泛的闊葉材,其半纖維素主要為木聚糖,可用于制備低聚木糖。本研究采用亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理?xiàng)钅?然后分別利用木聚糖酶和纖維素酶水解預(yù)處理后的楊木制備低聚木糖和單糖,考察不同預(yù)處理?xiàng)l件下楊木化學(xué)組分及結(jié)構(gòu)特性的變化,探究兩步預(yù)處理?xiàng)l件對低聚木糖和單糖得率的影響,以期為楊木的高價(jià)值化利用奠定理論基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料、試劑與儀器
楊木來自于江蘇宿遷,經(jīng)粉碎后全部過篩,取粒徑≤0.25 mm的部分經(jīng)自然風(fēng)干后儲存在密封袋中備用。亞氯酸鈉(純度80%)和氫氧化鈉(分析純)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。纖維素酶CTec2和內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶X2753(Aspergillusoryzae)均購自上海的Sigma-Aldrich公司,酶活分別為120.4 FPU/mL(每毫升170.8 mg酶蛋白)和2 500.0 U/g。木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖標(biāo)準(zhǔn)樣品購自Megazyme公司(愛爾蘭)。
HC 800Y粉碎機(jī);Agilent 1260高效液相色譜,Aminex Bio-Rad HPX-87H色譜柱和示差折光檢測器,美國安捷倫科技有限公司;Dionex ICS-5000高效液相陰離子交換色譜,CarboPacTMPA-200色譜柱(250 mm×4 mm),美國賽默飛世爾科技公司;Quanta 200掃描電鏡(SEM),美國FEI公司;UltimaⅣX射線粉末衍射(XRD)儀,日本Rigaku公司;AXISUltra DLD X射線光電子能譜(XPS)儀,英國Kratos公司。
1.2 亞氯酸鈉預(yù)處理
取10 g(干質(zhì)量)楊木和配置好的100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的亞氯酸鈉水溶液,在250 mL的錐形瓶中混合后置于70℃的恒溫水浴鍋中分別反應(yīng)0.5、1和3 h(SC0.5、SC1和SC3)。反應(yīng)結(jié)束后,通過真空抽濾將固體殘?jiān)皖A(yù)處理液進(jìn)行分離。抽濾過程中用蒸餾水洗滌固體殘?jiān)林行?置于-18℃冰箱中備用。每個(gè)條件進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.3 氫氧化鈉后處理
將5 g亞氯酸鈉預(yù)處理后的楊木(SC0.5、SC1和SC3)和50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氫氧化鈉在100 mL的錐形瓶中混合,置于50℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h[6],對應(yīng)的預(yù)處理樣品標(biāo)記為SC0.5-SH、SC1-SH和SC3-SH。反應(yīng)結(jié)束后,通過真空抽濾分離固體殘?jiān)皖A(yù)處理液,用蒸餾水洗滌殘?jiān)料礈煲航咏行院笫占腆w殘?jiān)?風(fēng)干后置于-18℃冰箱中備用。每個(gè)條件進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.4 木聚糖酶水解
分別以SC和SC-SH預(yù)處理后楊木為底物,在50℃、150 r/min的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行木聚糖酶水解,分別以亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后楊木為底物,底物質(zhì)量濃度為20 g/L,酶用量為600 U/g(以底物質(zhì)量計(jì),下同),水解體系體積為5 mL,用50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液維持體系pH值為4.8,反應(yīng)時(shí)間48 h。酶水解結(jié)束后,離心(10 000 r/min,10 min)分離固體殘?jiān)退庖?。采用高效液相陰離子交換色譜測定水解液中的低聚木糖(XOS)含量,每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.5 纖維素酶水解
纖維素酶水解實(shí)驗(yàn)在50℃、150 r/min的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行,底物為亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后且被木聚糖酶水解后的楊木固體殘?jiān)?底物質(zhì)量濃度為20 g/L,酶蛋白用量為10、30和60 mg/g(以底物質(zhì)量計(jì),下同),水解體系體積為3 mL,用50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液維持體系pH值為4.8,反應(yīng)時(shí)間72 h。酶水解結(jié)束后,離心(10 000 r/min,10 min)分離固體殘?jiān)退庖?采用高效液相色譜測定水解液中的單糖含量。每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)。
1.6 分析方法
1.6.1化學(xué)成分分析原料和預(yù)處理后的固形物化學(xué)組成按照美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室提供的分析方法進(jìn)行分析[7]。預(yù)處理后固形物的回收率、固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)的移除率以及低聚木糖得率的計(jì)算公式見式(1)～(3):
式中:R—預(yù)處理后固形物的回收率,%;M1—預(yù)處理后固形物的質(zhì)量,g;M2—預(yù)處理前固形物的質(zhì)量,g;r—固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)移除率,%;m1—預(yù)處理前固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)的質(zhì)量,g;m2—預(yù)處理后固形物中各組分(葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素)的質(zhì)量,g;Y—低聚木糖得率,%;m3—酶水解液中聚合度2～6的低聚木糖的質(zhì)量,g;m4—預(yù)處理?xiàng)钅緲悠分心揪厶堑馁|(zhì)量,g。
單糖的水解得率計(jì)算參照Hao等[1]的報(bào)道。其中葡萄糖和木糖的測定采用Agilent 1260高效液相色譜測定,流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸,流速為0.6 mL/min。酶水解液中低聚木糖(聚合度2～6)采用Dionex ICS-5000高效液相陰離子交換色譜檢測,使用CarboPacTMPA-200色譜柱。
1.6.2SEM分析 采用Quanta 200掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)樣品的表面形貌。樣品在成像前進(jìn)行噴金處理,以增強(qiáng)其導(dǎo)電性。儀器的工作電壓為25 kV。
1.6.3XRD分析 采用UltimaⅣX射線粉末衍射儀,以銅靶為X射線源,進(jìn)行XRD分析并測定了樣品結(jié)晶度(ICr)。掃描速率5(°)/min,并根據(jù)ICr=(I002-Iam)/I002×100%計(jì)算ICr。其中I002和Iam分別是最大(約22.5°)和最小(約18°)衍射峰強(qiáng)度。
1.6.4XPS分析 采用AXISUltra DLD X射線光電子能譜儀分析樣品表面的元素組成和化學(xué)鍵分布。
1.6.5可及性分析采用剛果紅染料(DR 28)吸附法,用Langmuir吸附等溫線計(jì)算得到最大吸附容量(Γmax)代表樣品對酶的可及性。將DR 28溶液(0.00、0.05、0.10、1.00、2.00、3.00和4.00 g/L)與10 g/L樣品(0.06 g)在10 mL離心管中混合,混合物在150 r/min,50℃下吸附24 h。吸附反應(yīng)結(jié)束后,離心分離上清液,在498 nm下測定吸光度并計(jì)算上清液中游離染料的濃度,以及底物對染料的吸附量。每個(gè)樣品的吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。
2 結(jié)果與討論
2.1 亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜姆治雠c表征
2.1.1化學(xué)組成未經(jīng)預(yù)處理的楊木和亞氯酸鈉(SC)預(yù)處理后的楊木組分如表1所示。
表1 亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜幕瘜W(xué)組成Table 1 Chemical composition of poplar after sodium chlorite pretreatment
原料楊木的葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40.0%、17.8%和28.0%。亞氯酸鈉預(yù)處理3 h后,木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則由初始的28.0%下降到SC3的11.3%,木質(zhì)素的去除使葡聚糖和木聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高至42.9%和19.4%。雖然固形物的回收率分別在84.6%～89.0%之間,但葡聚糖和木聚糖的回收率均超過90%和88%。類似的結(jié)果也在之前的研究中報(bào)道過,Nan等[8]采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的亞氯酸鈉在80℃處理荻草0.5～24 h后,其葡聚糖和木聚糖的回收率也均超過80%。由此表明,亞氯酸鈉預(yù)處理可以選擇性脫除楊木中的木質(zhì)素,同時(shí)保留大量的碳水化合物組分。此外,經(jīng)過預(yù)處理后,楊木中的乙?；坑兴仙?這可能是預(yù)處理后乙酰化纖維素或木聚糖的含量有所增加導(dǎo)致的[9]。
2.1.2SEM分析 未處理和亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜膾呙桦婄R圖片如圖1所示,由圖1可觀察到未進(jìn)行預(yù)處理的楊木表面纖維結(jié)構(gòu)完整且光滑。經(jīng)亞氯酸鈉預(yù)處理后,原料表面的剛性纖維結(jié)構(gòu)被不同程度地破壞,纖維表面出現(xiàn)裂紋、空腔,其中SC3的纖維結(jié)構(gòu)被破壞的最嚴(yán)重。在底物SC1的纖維結(jié)構(gòu)中,還觀察到不同孔徑大小的纖維孔隙。這一表面現(xiàn)象與之前報(bào)道相似,這是預(yù)處理過程中木質(zhì)素被脫除所致。據(jù)報(bào)道,亞氯酸鈉預(yù)處理初期去除的是細(xì)胞角隅區(qū)和復(fù)合胞間層的木質(zhì)素,中后期主要去除的是復(fù)合胞間層和次生壁的木質(zhì)素[10]。木質(zhì)素的去除可導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的坍塌和裂紋的出現(xiàn),從而增加樣品表面積,有利于后續(xù)酶水解的進(jìn)行,類似的結(jié)果也在其他研究中被報(bào)道[11]。
圖1 未處理?xiàng)钅竞蛠喡人徕c預(yù)處理?xiàng)钅镜膾呙桦婄R圖(×800)Fig.1 SEM images of unpretreated poplar and SC-pretreated poplar(×800)
2.1.3XPS、XRD和纖維素可及性分析 表2列舉了未經(jīng)過處理和經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜谋砻嬖亟M成。
表2 不同楊木樣品的表面元素組成、結(jié)晶度和纖維素可及性分析Table 2 Surface elemental compositions,crystallinity and cellulose accessibility analysis of different poplar samples
據(jù)報(bào)道,XPS光譜中的C—C/C—H結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰主要來源于木質(zhì)素和萃取物,該峰的面積越大,表明樣品表面的木質(zhì)素含量越高[12]。C—O和C==O/O—C—O結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰分別來源于纖維素和半纖維素。從表2中可以看出C—C/C—H結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積從原始的49.3%先減小再增加,C—O和C==O/O—C—O結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積先增加后減小。該現(xiàn)象可能是因?yàn)樵陬A(yù)處理的初始階段木質(zhì)素不斷脫除,使纖維素和半纖維素含量上升。經(jīng)過長時(shí)間處理后溶液中的木質(zhì)素和多糖降解產(chǎn)物形成了假木質(zhì)素并沉積到原料表面所致[13]。最終使C—C/C—H結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積上升,而C==O/O—C—O結(jié)構(gòu)的碳原子對應(yīng)的峰的相對面積下降。另外通過XRD技術(shù)檢測了樣品的結(jié)晶度,如表2所示,與未處理的楊木相比,預(yù)處理后的楊木樣品結(jié)晶度均有所上升,均達(dá)到或超過55%。結(jié)晶度的上升主要是由于木質(zhì)素和非結(jié)晶態(tài)半纖維素的去除所致[14]?？杉靶詫?shí)驗(yàn)中,4種底物對剛果紅的最大吸附量分別為240.4、259.3、355.1和566.5 mg/g,吸附量越大說明其可及性越高。隨著預(yù)處理時(shí)間的延長,最大吸附量逐漸增大,可及性增加。這是因?yàn)轭A(yù)處理時(shí)間越長,原有的纖維結(jié)構(gòu)被破壞的更加嚴(yán)重,有更多的木質(zhì)素被脫除而使底物孔隙率增大,即纖維素的可及性得到了更大的提高[15]。
2.2 氫氧化鈉處理
有文獻(xiàn)報(bào)道,采用堿對亞氯酸鈉處理后的楊木進(jìn)行第二步處理,可以極大地提升楊木的木聚糖水解得率,并且有效降低纖維素酶用量[6]。因此,本研究采用氫氧化鈉(SH)對亞氯酸鈉處理后的楊木進(jìn)行第二步預(yù)處理,以提高葡聚糖和木聚糖的可降解性能。亞氯酸鈉預(yù)處理的楊木經(jīng)過氫氧化鈉預(yù)處理后,木質(zhì)素的量分別從22.9%(SC0.5)、20.5%(SC1)、11.3%(SC3)降低到10.6%(SC0.5-SH)、4.7%(SC1-SH)、2.9%(SC2-SH),木質(zhì)素的移除率為67.9%～85.4%(表3),超過95%的葡聚糖和70%左右的木聚糖在預(yù)處理過程中被保留。此外,經(jīng)過氫氧化鈉進(jìn)一步預(yù)處理后,楊木的乙?；鶑?%左右(表1)降低至0%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,乙?；娜コ欣谠黾用笇w維素的可及性從而促進(jìn)酶水解[16]。
表3 亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理后楊木的化學(xué)組成1)Table 3 Chemical composition of poplar after SC and SH two-step pretreatment %
2.3 預(yù)處理后樣品的酶水解
2.3.1木聚糖酶水解以亞氯酸鈉處理的楊木為對照組,對兩步預(yù)處理后的楊木采用木聚糖酶水解制備低聚木糖。不同底物的低聚木糖得率如表4所示。
表4 兩步預(yù)處理對楊木木聚糖水解制備低聚木糖的影響Table 4 Effect of two-step pretreatment on enzymatic preparation of xylooligosaccharides
只經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理的楊木經(jīng)木聚糖酶水解得到的低聚木糖總得率分別為1.06%、1.60%和5.85%。經(jīng)過亞氯酸鈉-氫氧化鈉處理后,3種底物的低聚木糖得率分別提升至41.62%(SC0.5-SH)、43.74%(SC1-SH)和47.20%(SC3-SH),相對未經(jīng)堿處理的底物,低聚木糖的得率分別提高了38.3、26.5、7.1倍。堿處理有效地促進(jìn)了底物中木聚糖的水解,顯著地提高了低聚木糖的得率。此外,經(jīng)過堿處理后,SC3酶水解液中的木糖與低聚木糖質(zhì)量比值從0.33降低至0.20[1],這表明堿處理還減少了酶水解液中的木糖。這可能是因?yàn)閴A處理移除了楊木中大量木質(zhì)素之后,提高了楊木樣品中木聚糖對木聚糖酶的可及性,導(dǎo)致低聚木糖得率大幅度提高(表4),從而使木糖質(zhì)量/低聚木糖質(zhì)量的比值明顯降低。值得注意的是,經(jīng)過堿處理后,在楊木水解液中低聚木糖的主要組成為木二糖,3種底物所得的木二糖得率分別達(dá)到41.0%、43.19%和46.97%,占水解液中低聚木糖的組成98%以上。
2.3.2纖維素酶水解
2.3.2.1亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅久杆庑适窃u價(jià)預(yù)處理效果的重要指標(biāo)。以未處理的楊木為對照,對3種不同預(yù)處理時(shí)間的亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜孜镞M(jìn)行了纖維素酶水解實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2所示。當(dāng)酶用量為10 mg/g時(shí),經(jīng)過亞氯酸鈉預(yù)處理0.5 h后,楊木的葡萄糖和木糖得率分別從8.4%和4.8%提升至12.4%和8.4%;延長預(yù)處理時(shí)間至3 h后,葡萄糖和木糖得率分別提升至30.0%和24.3%。這是由于亞氯酸鈉預(yù)處理移除了楊木中的木質(zhì)素,從而增加了纖維素酶對纖維素的可及性,改善了楊木酶水解效果[5]。由于本研究所用的商品纖維素酶中含有木聚糖酶,所以它能將底物中的木聚糖水解而產(chǎn)生木糖。繼續(xù)增加酶用量至60 mg/g時(shí),SC3的葡萄糖和木糖得率最高,分別為85.2%和59.0%。本研究結(jié)果與Siqueira等[4]和Wen等[6]所報(bào)道的一致。
圖2 亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅镜睦w維素酶水解Fig.2 Cellulase hydrolysis of poplar after sodium chlorite pretreatment
2.3.2.2木聚糖酶水解殘?jiān)?jīng)過木聚糖酶水解后,將楊木水解殘?jiān)M(jìn)行纖維素酶水解制備單糖,結(jié)果見表5。在酶用量10 mg/g條件下,3種底物均呈現(xiàn)出較高的水解效率。SC0.5-SH、SC1-SH和SC3-SH的葡萄糖得率分別為41.1%、55.5%和64.7%。繼續(xù)增加酶用量至30 mg/g,葡萄糖得率分別提升至81.4%、84.0%和90.2%,比亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅驹?0 mg/g的纖維素酶用量下的得率更高。由此,證實(shí)堿處理不僅使底物中的木聚糖更容易水解,還促進(jìn)了纖維素的酶水解特性。值得注意的是,表5中各原料的木糖得率均低于葡萄糖得率,這是因?yàn)榈孜镏幸子谒獾哪揪厶且驯凰鉃榈途勰咎?表4),因此該商品纖維素酶中存在的木聚糖酶很難將楊木中殘留的木聚糖水解為木糖。
表5 木聚糖酶水解殘?jiān)睦w維素酶水解Table 5 Cellulase enzymatic hydrolysis of SC-SH-pretreated poplar
2.4 物料衡算
圖3是1 kg楊木經(jīng)亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后,經(jīng)木聚糖酶水解制備低聚木糖和纖維素酶水解制備單糖的物料衡算圖。如圖3所示,1 kg楊木在70℃下經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%亞氯酸鈉處理3 h后,可得到846.0 g的預(yù)處理?xiàng)钅尽Ｈ糁苯咏?jīng)纖維素酶水解后可獲得181.0 g的葡萄糖和62.1 g木糖。若將亞氯酸鈉預(yù)處理?xiàng)钅驹?0℃下經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%氫氧化鈉處理1 h后,再經(jīng)木聚糖酶水解制備低聚木糖后,纖維素酶水解木聚糖酶水解的殘?jiān)苽鋯翁?。整個(gè)工藝流程可獲得52.5 g的低聚木糖、317.6 g葡萄糖和49.9 g木糖。Hao等[1]報(bào)道采用過氧化氫-乙酸預(yù)處理?xiàng)钅竞筮M(jìn)行兩步酶水解制備低聚木糖和單糖,1 kg楊木可獲得16.9 g低聚木糖和296.4 g葡萄糖。相比過氧化氫-乙酸預(yù)處理,楊木經(jīng)過亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理后有著更高的低聚木糖和葡萄糖產(chǎn)量。亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理均在較溫和的條件下進(jìn)行,亞氯酸鈉預(yù)處理后產(chǎn)生的氯氣可以回收后循環(huán)利用[17]。因此,本研究所采用的亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理酶法制備低聚木糖和單糖有著較好的應(yīng)用潛力。
圖3 楊木酶法水解制備低聚木糖和單糖的物料衡算Fig.3 Mass balance of xylooligosaccharides and monosaccharides production from poplar
3 結(jié) 論
3.1以楊木為原料,研究了亞氯酸鈉和氫氧化鈉兩步預(yù)處理對楊木酶水解制備低聚木糖和單糖的影響,結(jié)果表明:經(jīng)亞氯酸鈉在70℃下預(yù)處理3 h后,楊木木質(zhì)素移除率達(dá)到65.8%,葡聚糖和木聚糖的保留率均在90%以上。預(yù)處理還能移除底物表面的木質(zhì)素,提高底物結(jié)晶度,改善纖維素酶對底物中纖維素的可及性。
3.2楊木經(jīng)亞氯酸鈉處理3 h和氫氧化鈉處理1 h后,經(jīng)木聚糖酶水解后獲得的低聚木糖得率達(dá)到47.2%,相比未經(jīng)氫氧化鈉預(yù)處理的楊木,低聚木糖得率提高了7.1倍。其中木二糖為主要成分,占98%以上。木聚糖酶水解后得到的固形物經(jīng)30 mg/g的纖維素酶水解后葡萄糖得率為90.2%,木糖得率為35.3%。
3.3物料衡算結(jié)果表明,1 kg楊木經(jīng)亞氯酸鈉和氫氧化鈉預(yù)處理后,再經(jīng)木聚糖酶和纖維素酶兩步酶水解可獲得52.5 g低聚木糖、317.6 g葡萄糖和49.9 g木糖。亞氯酸鈉和氫氧化鈉的預(yù)處理溫度分別為70℃和50℃,反應(yīng)條件溫和,得到的低聚木糖和單糖得率較高,副產(chǎn)物少,具有較好的應(yīng)用潛力。
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