劉軍 韓世坤 馬艷 陳小紅 何玉敏 孫曉敏

1 西安體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康科學(xué)學(xué)院（西安710068）

2 西安體育學(xué)院研究生部（西安710068）

3 西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（西安710061）

4 西安交通大學(xué)全球健康研究院（西安710061）

糖尿病是一組因胰島素分泌不足和/或生理作用受損而導(dǎo)致的以長(zhǎng)期高血糖為主要特征的代謝性疾病，其中，2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）與體力活動(dòng)和飲食習(xí)慣等生活方式關(guān)系最為密切[1]。研究已經(jīng)證實(shí)，包括有氧運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)或者二者組合均能夠通過(guò)降低體脂，改善體成分、血脂和血壓，提高胰島素敏感性，降低糖化血紅蛋白（haemoglobin A1c ，HbA1c）等途徑對(duì)糖尿病防治產(chǎn)生積極影響，但也有一些文獻(xiàn)質(zhì)疑，認(rèn)為僅靠運(yùn)動(dòng)鍛煉而沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)方面的綜合干預(yù)并不容易使病情得到有效緩解[2]。多項(xiàng)研究表明，維生素D 除了傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中調(diào)節(jié)血清鈣和磷酸鹽水平、維持骨骼健康功能之外，還與免疫系統(tǒng)、肌肉功能、心血管疾病、癌癥進(jìn)程、炎癥和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)等密切相關(guān)[3]。實(shí)驗(yàn)研究和流行病學(xué)調(diào)查均提示，維生素D 缺乏與胰島素釋放降低、胰島素抵抗和T2DM 有關(guān)，特別是血清25（OH）D 的濃度較低，會(huì)直接增加代謝綜合征和T2DM風(fēng)險(xiǎn)[4]。

體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)失調(diào)是T2DM 的主要致病機(jī)制之一[5]。T2DM發(fā)病時(shí)，患者體內(nèi)糖、脂代謝紊亂引起的慢性高血糖可引起過(guò)量自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的失衡，過(guò)多活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致體內(nèi)急性和慢性炎癥。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）既是炎癥的主要調(diào)節(jié)器，又是體內(nèi)氧化應(yīng)激的監(jiān)測(cè)器，在體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激共同調(diào)節(jié)途徑中具有重要作用[6]。肝臟處于調(diào)節(jié)體內(nèi)糖、脂代謝的核心位置，在T2DM 中，肝臟的糖和脂肪生物合成能力升高，從而導(dǎo)致高血糖和高甘油三脂血癥。db/db小鼠是4號(hào)染色體的瘦素受體基因發(fā)生突變所誘發(fā)的自發(fā)型肥胖型2 型糖尿病動(dòng)物模型，具有明顯的高糖血癥，出生4周左右血糖開(kāi)始升高，表現(xiàn)出高胰島素、高血糖、多飲、多食、多尿、肥胖和脂代謝異常等與人類T2DM 極為相似的癥狀，是公認(rèn)且研究T2DM 時(shí)廣泛應(yīng)用的理想動(dòng)物模型。因此，本研究通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D 注射干預(yù)db/db小鼠，探討其聯(lián)合干預(yù)效果及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康、雄性db/db小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：SCXK（蘇）2016-0010，32只，7周齡，由南京君科生物有限公司提供，每籠2只，分籠飼養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)室為西安體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，濕度保持在40%～70%，溫度為20℃～25℃?；\具清潔衛(wèi)生，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝取食物和水，小鼠飼料為實(shí)驗(yàn)鼠生長(zhǎng)繁殖飼料（協(xié)同生物），取自來(lái)水。

小鼠購(gòu)回后先適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天，后被隨機(jī)分為對(duì)照組（CG）、有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)組（EG）、維生素D 注射干預(yù)組（VG）和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D 注射干預(yù)組（EVG），每組8只，進(jìn)行為期8周的有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D注射干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 運(yùn)動(dòng)及維生素D干預(yù)方案

1.2.1 有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

EG和EVG組小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行3天的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，然后開(kāi)始8 周的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案參照文獻(xiàn)[7，8]設(shè)計(jì)，跑速控制在8～12 m/min（運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度保持在72%～76%VO2max），每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間為30 或60 min。EG 和EVG 組每周運(yùn)動(dòng)5天，周末休息，CG和VG組小鼠在運(yùn)動(dòng)日靜置跑臺(tái)相同時(shí)間作為對(duì)照。

具體方案：第1周跑速8 m/min，強(qiáng)度72%VO2max，時(shí)間30 min；第2周跑速、強(qiáng)度同第1周，時(shí)間為60 min；第3～6周跑速10 m/min，強(qiáng)度74%VO2max；第6～8周為跑速12 m/min，強(qiáng)度76%VO2max；第3～8周運(yùn)動(dòng)時(shí)間均為60 min。

1.2.2 維生素D注射干預(yù)方案

VG 及EVG 組小鼠用1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]進(jìn)行腹腔注射。用大豆油（250 mL，Acmec）將1，25（OH）2D3（2 mg，MCE試劑）溶解，配制成所需濃度溶液，具體干預(yù)劑量為每日7 μg/kg[9]，每周注射3次，連續(xù)干預(yù)8 周。CG 與EG 組小鼠以等量大豆油腹腔注射作為對(duì)照。

1.3 動(dòng)物取材

干預(yù)實(shí)驗(yàn)期間每周周日早8 點(diǎn)小鼠尾部采血，用于各組小鼠空腹血糖（采樣前禁食16 h）測(cè)定；8 周干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食至次日晨，20%烏拉坦腹腔注射麻醉（0.5 mL/100 g），摘取眼球取血并分離血清備用；保持低溫開(kāi)胸，摘取肝臟分別于液氮或4%多聚甲醛進(jìn)行保存，用于相關(guān)蛋白表達(dá)水平和組織切片HE染色的檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)試

1.4.1 血液指標(biāo)測(cè)試

采用德國(guó)EKF乳酸鹽分析儀的葡萄糖傳感器及測(cè)定試劑（購(gòu)自北京德福康科貿(mào)有限公司）測(cè)定血糖；采用ELISA試劑盒（購(gòu)自上海西唐生物科技公司）測(cè)試血清胰島素（insulin）；采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterin，HDLC）等血脂四項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.2 肝臟指標(biāo)測(cè)試1.4.2.1 肝臟糖原含量、炎癥因子和抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

將液氮保存肝組織經(jīng)勻漿后收上清液，采用試劑盒測(cè)試肝糖原（glycogen）含量，采用ELISA 測(cè)定肝臟C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子，試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；采用試劑盒測(cè)定肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化指標(biāo)，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.2.2 肝臟核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（Glut-4）表達(dá)的測(cè)定

稱取液氮保存的大鼠肝臟組織50 mg 剪碎，加入提前配制好的裂解液（6 μL/mg），經(jīng)過(guò)低溫勻漿，離心后提取蛋白上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛有限公司，兔多克隆抗體Glut4、NF-κB p65購(gòu)自Abcam公司。

常規(guī)Western Blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Glut4 和NF-κB p65，一抗稀釋濃度為1∶1000，經(jīng)過(guò)上樣、SDS-PAGE凝膠電泳分離、濕法轉(zhuǎn)膜、室溫封閉、4℃一抗孵育過(guò)夜，次日漂洗，室溫二抗孵育，洗膜，ECL 發(fā)光等過(guò)程，利用凝膠成像系統(tǒng)成像，采用灰度值進(jìn)行量化分析。

1.4.2.3 肝臟HE染色

將肝臟組織切成1 cm×1 cm×0.5 cm 小塊，置于4%多聚甲醛中固定24 h，流水輕滌1 h后，以70%酒精為起始濃度，梯度脫水，兩次二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm 厚的切片，經(jīng)HE 染色后，置于目鏡10×、物鏡20×光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片用Image Lab 5.2進(jìn)行灰度分析統(tǒng)計(jì)，顯微鏡圖像用Image-Pro Plus 5.1軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組血糖隨著時(shí)間變化趨勢(shì)的差異，通過(guò)重復(fù)測(cè)量（repeated measures）方差分析計(jì)算時(shí)間與分組之間的交互效應(yīng)進(jìn)行比較。運(yùn)動(dòng)與維生素D在同一時(shí)間點(diǎn)上對(duì)血糖或其他指標(biāo)作用效果，以這兩個(gè)干預(yù)作為因子，通過(guò)雙因素方差分析（two-way ANOVA）的主效應(yīng)和交互效應(yīng)進(jìn)行分析，當(dāng)交互效應(yīng)不顯著時(shí)（P＞0.05），使用主效應(yīng)分析進(jìn)行組間比較，當(dāng)交互效應(yīng)顯著時(shí)（P＜0.05），進(jìn)行事后檢驗(yàn)的兩兩比較以明確其單獨(dú)效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)干預(yù)期間各組小鼠血糖變化

圖1 為干預(yù)期間小鼠血糖檢測(cè)結(jié)果，重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，組別與時(shí)間存在顯著交互效應(yīng)，即與CG組比較，EG、VG 和EVG 組血糖變化趨勢(shì)存在差異（P＜0.05）。雙因素方差分析顯示，運(yùn)動(dòng)與維生素D 對(duì)血糖的影響無(wú)顯著交互效應(yīng)（P＞0.05）；主效應(yīng)分析顯示，至第8周時(shí)，EG、VG和EVG組小鼠血糖均顯著低于CG組（P＜0.01），EVG組下降程度更明顯。

圖1 實(shí)驗(yàn)干預(yù)期間各組小鼠血糖變化結(jié)果比較

2.2 各組小鼠血脂、血胰島素及肝臟糖原、炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)變化

表1顯示，8周的有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D干預(yù)后小鼠血清胰島素、血脂、肝糖原、炎癥因子和抗氧化指標(biāo)存在組間差異，但運(yùn)動(dòng)與維生素D不存在交互效應(yīng)（P＞0.05），主效應(yīng)分析結(jié)果如下：

表1 干預(yù)后各組小鼠指標(biāo)變化比較（n=8）

小鼠血清胰島素檢測(cè)結(jié)果顯示，8周干預(yù)后，EG組和VG 組胰島素水平顯著低于CG 組（P＜0.05），EVG 組極顯著低于CG組（P＜0.01），表明聯(lián)合干預(yù)相比各單一干預(yù)對(duì)小鼠血清胰島素穩(wěn)定有更好的效果。肝糖原檢測(cè)結(jié)果顯示，EG 組和EVG 組肝糖原含量顯著高于CG組（P＜0.05，P＜0.01），表明干預(yù)后肝糖原合成增加或者分解減少。

小鼠血脂檢測(cè)結(jié)果顯示，8 周干預(yù)后，血清TG 結(jié)果，EG 組、VG 組和EVG 組均顯著低于CG 組（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01），干預(yù)后3 組小鼠血清TC 和LDL-C 下降趨勢(shì)和TG一致，表明運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D組對(duì)TG、TC 和LDL-C 干預(yù)效果更好；EG 組、VG 組和EVG組HDL-C 均高于CG 組，但只有EVG 組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。EVG組LDL-C顯著低于VG組（P＜0.05），HDL-C 顯著高于VG 組（P＜0.05），提示對(duì)于血脂而言，運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果更為明顯。

小鼠肝臟炎癥因子檢測(cè)結(jié)果顯示，8 周干預(yù)結(jié)束后，EG 組、VG 組和EVG 組小鼠肝臟IL-6 和CRP 含量均不同程度低于CG組，與CG組比較均有顯著差異（P＜0.05）；EVG組IL-6含量顯著低于VG組（P＜0.05），表明運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D 干預(yù)對(duì)IL-6 的抑制效果更好；小鼠肝臟CRP 各干預(yù)組之間相互比較無(wú)差異；EG組、VG 組和EVG 組小鼠肝臟TNF-α均顯著低于CG 組（P＜0.05）。

小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，EG、VG 和EVG組肝臟SOD和GSH-Px水平均顯著高于CG組（P＜0.05）；EVG 組SOD 水平顯著高于VG 組（P＜0.05）；EG、VG 和EVG 組肝臟MDA 水平均顯著低于CG 組（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01）。

2.3 各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果

8 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠肝組織HE 染色后病理變化見(jiàn)圖2。CG 組大鼠肝組織呈現(xiàn)彌漫性的脂肪變性，肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積比較明顯，出現(xiàn)較多的大小不一的空泡；EG 組和VG 組小鼠有所改善，空泡變性減少，EVG組肝細(xì)胞排列整齊，脂質(zhì)沉積和空泡明顯減少，聯(lián)合干預(yù)效果明顯優(yōu)于單一干預(yù)組。

圖2 實(shí)驗(yàn)干預(yù)后小鼠肝組織HE染色病理改變（×200）

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D 干預(yù)調(diào)節(jié)小鼠肝組織中NF-κB和Glut4蛋白表達(dá)

圖3結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合維生素D干預(yù)后小鼠肝組織NF-κB 和Glut4 蛋白表達(dá)存在組間差異，但“運(yùn)動(dòng)”與“維生素D”不存在交互效應(yīng)（P＞0.05）。主效應(yīng)分析顯示，8周干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，EG組、VG組和EVG組小鼠肝臟NF-κB蛋白表達(dá)顯著低于CG組（P＜0.01），EVG組表達(dá)顯著低于VG 組（P＜0.05）；EG、VG 和EVG 組肝臟Glut4 蛋白表達(dá)顯著高于CG 組（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）。

圖3 實(shí)驗(yàn)干預(yù)后小鼠肝臟NF-κB和Glut4蛋白表達(dá)結(jié)果（n=8）

3 討論

對(duì)于新確診的糖尿病患者或者是為預(yù)防糖尿病發(fā)生，運(yùn)動(dòng)都是首先推薦的干預(yù)方式，但運(yùn)動(dòng)效益與運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度、量等高度相關(guān)，因?yàn)樵诼约膊』颊咧?，劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)增加健康風(fēng)險(xiǎn)[10]。通過(guò)每周進(jìn)行5～6次持續(xù)時(shí)間為30～60 min的有氧運(yùn)動(dòng)（其中2～3次結(jié)合抗阻訓(xùn)練）結(jié)合飲食的生活方式干預(yù)可以降低患者血清HbA1c，減少治療用降糖藥物用量[11]。

通常體內(nèi)維生素D 是否缺乏需要根據(jù)血清中25（OH）D 的濃度來(lái)確定，歐洲內(nèi)分泌協(xié)會(huì)將維生素D 缺乏、不足和充足分別定義為血清25（OH）D＜20.0 ng/mL（＜50 nmol/L）、20～29.9 ng/mL（50～75 mmol/L）和≥30 ng/mL（＞75 nmol/L）[12]。對(duì)中國(guó)不同地區(qū)不同人群的調(diào)查文獻(xiàn)顯示，血清中25（OH）D 處于缺乏狀態(tài)（＜50 nmol/L）的比例分布在30%～96.8%之間，盡管數(shù)值范圍差異較大，但多數(shù)文獻(xiàn)顯示，中國(guó)維生素D不足人口在70%左右[13]。維生素D 的缺乏會(huì)增加T2DM 的發(fā)病率，Afzal等的meta分析研究發(fā)現(xiàn)血中25（OH）D的低水平會(huì)增加未來(lái)T2DM 的患病率[14]。2016年Sun 等發(fā)表的以日本成年人為研究對(duì)象的為期1年的維生素D干預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血清25（OH）D 水平升高的同時(shí)胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的水平也被顯著降低[15]。上述研究提示，在攝取維生素D 或者保持高水平的血中25（OH）D濃度可以預(yù)防IR和T2DM的發(fā)生，但是在T2DM 人群中卻沒(méi)有得到一致的結(jié)論。肝臟是體內(nèi)糖調(diào)節(jié)的核心器官，肝臟功能受損會(huì)導(dǎo)致空腹或餐后高血糖。有研究證實(shí)在糖尿病確診前18 個(gè)月肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）和TG 就穩(wěn)定升高[16]。而肝臟脂肪變性是最常見(jiàn)引起ALT中度升高的原因，因此，研究肝臟對(duì)胰島素的敏感性和肝臟脂肪的儲(chǔ)存程度對(duì)于認(rèn)識(shí)糖尿病十分重要。

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D干預(yù)對(duì)db/db小鼠糖、脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)及可能機(jī)制

正常餐后血清高胰島素-高血糖可促使肝糖原最大程度合成，但T2DM 時(shí)此通路受阻，肝臟胰島素抵抗導(dǎo)致二酯酰甘油依賴的蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）被激活，抑制胰島素受體（insulin receptor，InsR）Thr1160 位點(diǎn)磷酸化，使胰島素刺激的肝糖原合成受阻[17]，導(dǎo)致空腹或餐后高血糖。因此，糖尿病患者或者糖尿病模型的動(dòng)物，肝糖原貯量較正常人均明顯降低。

在本研究中，有氧運(yùn)動(dòng)、維生素D以及有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合維生素D干預(yù)8周后，實(shí)驗(yàn)小鼠高血糖和高胰島素血癥得到有效緩解，肝臟糖原貯存增加，血漿TG、TC 下降，LDL-C 下降，HDL-C 升高。運(yùn)動(dòng)或/和維生素D 干預(yù)通過(guò)糾正T2DM 時(shí)的激素以及底物調(diào)控功能失衡，使肝糖生成的兩個(gè)主要過(guò)程重新進(jìn)入有序調(diào)控。究其原因，無(wú)論有氧運(yùn)動(dòng)或抗阻運(yùn)動(dòng)，均可通過(guò)調(diào)節(jié)HbA1c、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、TC、TG、LDL-C、HDL-C來(lái)改善胰島素抵抗、促進(jìn)胰島素分泌，還可降低T2DM發(fā)生心血管相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[18]。

雖然補(bǔ)充維生素D 的效果有不一致的結(jié)論，但高血清25（OH）D濃度與HDL-C呈正相關(guān)，與TG呈負(fù)相關(guān)，可使LDL-C/HDL-C 或TC/HDL-C 比值降低，這已經(jīng)在諸多研究中被證實(shí)[19]。有研究發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)充維生素D后，糖尿病患者血清25（OH）D水平顯著升高，空腹血糖和HbA1c顯著下降，而且下降程度與25（OH）D水平呈正相關(guān)，對(duì)LDL-C 和TC 也有顯著改善[20-21]。但同時(shí)有研究認(rèn)為血清高25（OH）D 水平（＞61 ng/mL）時(shí)，相比血清中25（OH）D（35～61 ng/mL）、低（＜35 ng/mL）水平對(duì)TC 和LDL-C 降低趨勢(shì)更顯著，高25（OH）D 水平時(shí)HDL-C也呈現(xiàn)較高水平，分析認(rèn)為這可能與血清載脂蛋白A1濃度升高有關(guān)[22]。Patel等用4個(gè)月時(shí)間把受試對(duì)象血清25（OH）D水平分別從17.6 ± 1.5 ng/mL和15.6 ± 1.4 ng/mL 提高到25.5 ± 1.8 ng/mL 和27.4 ±2.4 ng/mL 后，受試者空腹血糖、HbA1c、血脂水平相比之前并沒(méi)有顯著差異，該項(xiàng)研究者提出血清25（OH）D濃度至少要大于32 ng/mL 后可能才會(huì)有顯著改善效果[23]。這基本與本研究的結(jié)果一致，本研究中，干預(yù)組血清25（OH）D 濃度均較高，最低的EG 組為47.45 ±9.28 ng/mL，為取得干預(yù)效果奠定了量效基礎(chǔ)。

在經(jīng)雙因素方差分析后，并沒(méi)得出補(bǔ)充維生素D和有氧運(yùn)動(dòng)的顯著交互效應(yīng)，但聯(lián)合干預(yù)還是出現(xiàn)了更好的干預(yù)趨勢(shì)，推測(cè)可能與維生素D 對(duì)運(yùn)動(dòng)特別是有氧運(yùn)動(dòng)能力有促進(jìn)作用，增加了機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)的良好適應(yīng)有關(guān)。業(yè)已證實(shí)，維持胰腺β細(xì)胞中維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）的水平，可以保護(hù)β細(xì)胞的數(shù)量和功能，防治糖尿病[24]。8周骨化三醇治療可通過(guò)增加胞質(zhì)鈣濃度，激活鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β/腺苷酸活化蛋白激酶（Ca2+/CaMKKβ/AMPK）信號(hào)通路降低T2DM 胰島素抵抗條件下的肝臟甘油三酯積累和葡萄糖輸出，改善db/db 小鼠的肝臟異常的糖、脂代謝[25]。此外，有研究認(rèn)為維生素D 對(duì)耐力性項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)有促進(jìn)作用，血清25（OH）D每增加1 nmol/L，受試者1.5 英里的跑步時(shí)間就會(huì)提高0.5 s，最佳耐力也出現(xiàn)在血清25（OH）D 濃度大于30 ng/mL的受試者上[26]。本研究中，補(bǔ)充維生素D雖然不是以提高運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)為目的，但其背后機(jī)制仍然是維生素D 有助于身體對(duì)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生適應(yīng)，使運(yùn)動(dòng)效益最大化。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D 干預(yù)對(duì)db/db 小鼠肝臟炎癥和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)及可能機(jī)制

T2DM時(shí)長(zhǎng)期糖、脂代謝紊亂引起的血管并發(fā)癥是糖尿病致死的主要原因，這可能與T2DM 時(shí)血管氧化應(yīng)激增強(qiáng)引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)，而LDL 的載脂蛋白成分脂質(zhì)過(guò)氧化可能是其主要誘因[27]。正常生理狀態(tài)時(shí)，胰島素與受體發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）活化，使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（Glut4）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，血漿中葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞，通過(guò)糖酵解生成乳酸，或進(jìn)入呼吸鏈徹底氧化后釋放能量；T2DM 時(shí)，細(xì)胞氧化磷酸化功能受損，NADH 氧化還原酶和檸檬酸合成酶活性降低，過(guò)高的葡萄糖發(fā)生自氧化生成酮醛和超氧化物，損害線粒體生物功能，產(chǎn)生過(guò)量活性氧（reactive oxygen，ROS）[28]，誘導(dǎo)NF-κB等蛋白過(guò)表達(dá)，抑制磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路，Glut4 表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和后期并發(fā)癥[29]。T2DM患者體內(nèi)糖化蛋白、葡萄糖氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化等非酶因素表達(dá)過(guò)高，或過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等酶類物質(zhì)表達(dá)過(guò)低均可打破體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除之間的穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生過(guò)量自由基[30]。因此，體內(nèi)充足的SOD 和GSH-Px 可以幫助維持自由基穩(wěn)態(tài)，降低線粒體內(nèi)膜超極化和ROS 的形成，阻斷葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，維持糖、脂代謝正常。糖、脂代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致炎癥，脂肪累積后可通過(guò)增加巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、導(dǎo)致NF-κB活化等途徑增加炎癥反應(yīng)[31]，導(dǎo)致胰島素抵抗。

在本研究中，運(yùn)動(dòng)、維生素D 及二者聯(lián)合干預(yù)后，肝細(xì)胞脂肪變性被明顯抑制，脂質(zhì)沉積和空泡減少，肝臟促炎因子IL-6、TNF-α顯著降低，CRP 降低，說(shuō)明不同干預(yù)手段均有效抑制了肝臟的炎癥反應(yīng)；而抗氧化酶SOD 和GSH-Px 表達(dá)顯著升高，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA顯著降低，說(shuō)明干預(yù)糾正了肝臟氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的失衡；炎癥途徑主要調(diào)控因子NF-κB表達(dá)降低，而Glut4則顯著升高，說(shuō)明無(wú)論是8 周的有氧運(yùn)動(dòng)還是維生素D 注射，或者二者聯(lián)合干預(yù)，都能夠通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟氧化應(yīng)激和炎癥水平，恢復(fù)生理穩(wěn)態(tài)，糾正胰島素分泌不足或者胰島素抵抗，通過(guò)Glut4 促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[32]，恢復(fù)能量供應(yīng)穩(wěn)態(tài)而對(duì)db/db 小鼠的糖、脂代謝紊亂起到調(diào)節(jié)作用。其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)或/和維生素D能夠通過(guò)提高抗氧化酶活性幫助機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)線粒體自噬糾正氧化應(yīng)激損傷[33]，降低脂肪分泌的炎性細(xì)胞因子抵抗素[34]，抑制M1 巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，下調(diào)下游通路NF-κB 表達(dá)，降低IL-1 表達(dá)等有關(guān)[29]，刺激IL-1ra 產(chǎn)生直接抗炎作用，改善葡萄糖耐量，從而對(duì)T2DM和心血管疾病產(chǎn)生益處[35]。

其他研究也證實(shí)，通過(guò)隔天腹腔注射25（OH）D（5 μg/kg）可降低db/db 小鼠細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（Suppressors of cytokine signaling，SOCS3）的表達(dá)，從而抑制NF-κB 促炎信號(hào)通路，進(jìn)一步減少衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）的分泌[36]，這也提示，25（OH）D 對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的干預(yù)有多種效果，但對(duì)體內(nèi)炎癥改善是共同作用機(jī)制。維生素D還可通過(guò)激活肝巨噬細(xì)胞VDR可改善肝臟炎癥、脂肪變性，顯著提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，使肝臟葡萄糖產(chǎn)出顯著降低[37]。其他研究也證實(shí)，維生素D 具有間接的抗氧化特性，可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)的VDR 保護(hù)細(xì)胞免受ROS 導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，從而減緩氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗[38]。Sinha等證明，經(jīng)補(bǔ)充維生素D提高血清25（OH）D濃度后，可提高機(jī)體氧化磷酸化能力，減少磷酸肌酸恢復(fù)一半的時(shí)間[39]。運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D表現(xiàn)出了更好的改善趨勢(shì)，也可能與維生素D 幫助糾正運(yùn)動(dòng)過(guò)程中穩(wěn)態(tài)失調(diào)，通過(guò)VDR 修復(fù)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)生微損傷的肌肉組織，誘導(dǎo)肌細(xì)胞分化和肌肉蛋白質(zhì)合成等因素有關(guān)[40]。

此外，在25（OH）D3向1，25（OH）2D3的轉(zhuǎn)化過(guò)程，可通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞分化和對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇的攝取下調(diào)CRP、TNF-α、IL-1等促炎因子，上調(diào)IL-10等抗炎細(xì)胞因子，防止炎癥造成的β細(xì)胞破壞[41]。

4 結(jié)論

8周有氧運(yùn)動(dòng)、維生素D注射和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D 注射干預(yù)可改善db/db 小鼠糖、脂代謝紊亂，降低血清胰島素和空腹血糖水平、改善血清脂質(zhì)水平，降低肝臟脂質(zhì)沉積和肝細(xì)胞脂肪變性，肝糖原貯量增加；機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)或/和維生素D通過(guò)提高肝臟抗氧化酶活性，降低肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥水平，進(jìn)而改善胰島素抵抗，促進(jìn)葡萄糖利用和糖原貯存有關(guān)。