沈鎮(zhèn)揚(yáng)，王俊俊，陸倫根，蔡曉波

慢性肝病時(shí)，肝祖細(xì)胞的增殖形式主要表現(xiàn)為膽管反應(yīng)[1-3]。Hippo信號(hào)通路與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)作為其核心效應(yīng)分子在其中起到了重要的作用[4-9]。本研究構(gòu)建了膽堿缺乏、乙硫氨酸補(bǔ)充(choline-deficient、 ethionine-supplemented， CDE)飲食小鼠模型，并采用免疫組化染色觀察到模型組肝組織膽管反應(yīng)增多，經(jīng)Western blot和qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組肝組織YAP表達(dá)增高，免疫熒光染色進(jìn)一步確定模型組肝祖細(xì)胞YAP表達(dá)增強(qiáng)。本研究在體外通過(guò)YAP過(guò)表達(dá)和敲減慢病毒感染肝祖細(xì)胞，并采用EdU和CCK8檢測(cè)證明肝祖細(xì)胞YAP過(guò)表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，而敲減YAP后細(xì)胞增殖減弱，以上研究為慢性肝病肝再生的調(diào)控機(jī)制和治療研究提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、病毒與試劑 6～8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，飼養(yǎng)在上海市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；過(guò)表達(dá)慢病毒和敲減慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司；William’E培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等細(xì)胞培養(yǎng)液均購(gòu)自美國(guó) Gibico公司；蛋白提取試劑，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑等購(gòu)自上海雅酶生物公司；RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑和qPCR試劑均購(gòu)自日本TAKARA公司；抗YAP抗體、熒光標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；抗GAPDH抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自上海生工生物公司；抗CK19抗體購(gòu)自武漢塞維爾公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8-CCK8(日本Dojinto公司)；EdU增殖檢測(cè)試劑盒(廣州銳博生物公司)；免疫組化試劑盒(上?；蚩萍脊?；HE染色試劑盒(武漢賽維爾公司)。

1.2 CDE飲食小鼠模型制備 將15只小鼠隨機(jī)分成3組，每組5只。給予第一組小鼠正常飲食和飲水(wild type, WT組)；給予第二組CDE飲食(CDE組)；給予第三組相同CDE飲食，用于提取原代肝祖細(xì)胞(原代細(xì)胞提取組)。在造模3 w后，處死各組小鼠，取出肝臟，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 原代肝祖細(xì)胞分離與培養(yǎng) 參照先前文獻(xiàn)報(bào)道的方法[10]，在原代細(xì)胞提取組小鼠，取肝臟，采用兩步灌注法和密度梯度離心法分離肝祖細(xì)胞。以1×106cell/ml密度接種于含William’s E完全培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素溶液(美國(guó) Gibico公司)、10 μg/ml胰島素(上海翊圣公司)、30 ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子II和20 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(美國(guó)PeproTech公司)]的培養(yǎng)皿中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后，用克隆環(huán)挑取單克隆細(xì)胞集落，傳代培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定的肝祖細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 肝組織蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，在肝組織中加入小鋼珠和含PMSF的RIPA裂解液，在組織振蕩裂解儀和超聲裂解儀裂解組織，離心取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白含量并調(diào)整濃度使其均一。在100℃金屬浴煮沸10 min，充分變性，上樣蛋白并行SDS-PAGE電泳。然后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，用TBST洗滌5 min，3次。加抗YAP抗體或抗GAPDH抗體，4℃孵育過(guò)夜；用TBST洗滌5 min，3次；再加山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；用TBST洗滌5 min，3次；用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯影、拍照。

1.5 肝組織基因水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，用Trizol法提取組織RNA，測(cè)定各組RNA含量。取RNA 1000 ng，在37℃ 15 min 和 85℃ 5 s行逆轉(zhuǎn)錄，采用PCR法檢測(cè)YAP mRNA水平，擴(kuò)增所用的引物由上海生工生物公司合成，其序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 肝組織蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化和免疫熒光法，取石蠟包埋組織切片，脫蠟、水化，用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑(武漢博士德公司)阻斷15 min，加5%BSA室溫封閉1 h，加抗CK19抗體，4℃過(guò)夜，再加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，加DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染核，封片后在光鏡下拍照；在免疫熒光檢測(cè)前，脫蠟水化抗原修復(fù)同前，加5%BSA室溫封閉1 h，加抗CK19或抗YAP，4℃過(guò)夜，加熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1 h，加DAPI染色10 min，用抗熒光淬滅封片劑(上海翊圣公司)封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 慢病毒轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)良好的肝祖細(xì)胞接種到24孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至50%融合度時(shí)，換新培養(yǎng)基。隨機(jī)將細(xì)胞分為四組：分別加入YAP過(guò)表達(dá)慢病毒(YAP-overexpression，YAP-OE)、過(guò)表達(dá)空載體慢病毒(overexpression-control，OE-control)、YAP敲減慢病毒(short hairpin RNA-YAP，shYAP)和敲減空載體慢病毒(short hairpin RNA-control，sh-control)原液各10 μl，混勻后，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行5 μg/ml的嘌呤霉素篩選，篩選完成后收集各組蛋白和RNA，進(jìn)行后續(xù)Western blot和qPCR驗(yàn)證。

1.8 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè) 將各組肝祖細(xì)胞以5×104/mL密度接種在24孔板中，24 h后，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)要求處理細(xì)胞，在熒光顯微鏡下拍照觀察，并計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。

1.9 細(xì)胞活力測(cè)定 將各組肝祖細(xì)胞以2.5×104/mL密度接種在96孔板中，使用細(xì)CCK-8試劑盒，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)在12 h、24 h、48 h和72 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD值)，即細(xì)胞活力檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 野生型小鼠經(jīng)CDE飲食喂養(yǎng)3 w后，肝組織炎癥和膽管樣增生反應(yīng)較對(duì)照組明顯；免疫組化檢測(cè)顯示，CDE組肝組織膽管反應(yīng)增強(qiáng)(圖1)。

圖1 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)A：WT組(HE，100×)；B：CDE組(HE，100×)；C：WT組(CK19染色，100×)；D：WT組(CK19染色，400×)；E：CDE組(CK19染色，100×)；F：CDE組(CK19染色，400×)

2.2 各組小鼠肝臟YAP表達(dá)比較 在CDE造模3 w后，經(jīng)Western blot和qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CDE造模組小鼠肝組織YAP蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組增強(qiáng)。與此同時(shí)，CDE造模組YAP mRNA水平較對(duì)照組提高了2.45倍(P<0.01)。免疫熒光檢測(cè)提示，CDE造模組肝組織CK19和YAP共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增加(圖2)。

2.3 各組肝祖細(xì)胞增殖能力比較 肝祖細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)YAP后，EdU檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下，YAP-OE組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例較OE-control組顯著增加[分別為(0.41±0.05)和(0.25±0.06)，P<0.01]；CCK8檢測(cè)提示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，YAP-OE組細(xì)胞增殖活性較OE-control組明顯提高，在培養(yǎng)72 h時(shí)較對(duì)照組提高了1.78倍(P<0.01)；在敲減YAP后，EdU檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下，shYAP組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例較sh-control組顯著減少[分別為(0.25±0.04)和(0.13±0.02),P<0.01]，CCK8檢測(cè)提示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，shYAP組細(xì)胞增殖活性較sh-control組明顯降低，在培養(yǎng)72 h時(shí)較對(duì)照組降低了1.92倍(P<0.01)。綜合以上可知，肝祖細(xì)胞YAP過(guò)表達(dá)后其增殖能力顯著高于YAP敲減組(圖3)。

圖3 各組肝祖細(xì)胞增殖能力比較A：各組YAP蛋白水平驗(yàn)證；B：EdU檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力變化(100×)；C：各組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例差異；D：CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力變化(與對(duì)照組比，**P<0.05，***P<0.01)

3 討論

肝祖細(xì)胞是一種卵圓形、高核質(zhì)比的細(xì)胞，位于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與匯管區(qū)交界的Hering’s 管，從形態(tài)和體積上類似于膽管上皮細(xì)胞。肝祖細(xì)胞具有肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞雙向分化潛能，同時(shí)表達(dá)膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK7、CK19 和肝細(xì)胞標(biāo)志物白蛋白、CK8、AFP，也表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物 CD133、OV6和NCAM 等。最近一個(gè)對(duì)人胚胎肝臟單細(xì)胞分析的研究進(jìn)一步確認(rèn)其存在[5,11]。在慢性肝損傷狀態(tài)下，當(dāng)正常肝細(xì)胞衰老或增殖被抑制時(shí)，肝祖細(xì)胞可分化成為成熟的肝細(xì)胞。由于在病理而非生理?xiàng)l件下參與肝臟的更新，因此被稱為肝臟再生的次要機(jī)制或病理性再生[4,12]。因此，在慢性肝損傷時(shí)，肝祖細(xì)胞的有效增殖和分化或許是決定這些肝病患者預(yù)后的關(guān)鍵。

多種信號(hào)通路參與肝祖細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，如HGF/c-Met、FGF17、Hedgehog等[4]。Hippo信號(hào)通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和干細(xì)胞自我更新來(lái)控制器官組織再生，該通路失調(diào)會(huì)導(dǎo)致器官持續(xù)性增生和腫瘤的發(fā)生等重大疾病。YAP轉(zhuǎn)錄共激活因子是Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵效應(yīng)分子，在該通路被激活時(shí)，YAP發(fā)生磷酸化修飾而滯留在胞質(zhì)無(wú)法行使轉(zhuǎn)錄激活功能。相反，該通路被抑制后，非磷酸化修飾的YAP能夠進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TEAD等結(jié)合進(jìn)而啟動(dòng)下游一系列促增殖、抗凋亡和細(xì)胞干性相關(guān)基因的表達(dá)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示YAP也參與肝臟炎癥、纖維化和再生。在非酒精性脂肪性肝病，YAP活化的活性膽管細(xì)胞數(shù)量與肝纖維化進(jìn)展相關(guān)。在化學(xué)損傷誘導(dǎo)的小鼠模型，肝細(xì)胞中上調(diào)的YAP水平被認(rèn)為能促進(jìn)肝臟炎癥和纖維化。使用MST1/MST2抑制劑激活YAP，能增強(qiáng)對(duì)乙酰氨基酚和四氯化碳中毒或膽管結(jié)扎引起的急慢性損傷后的肝臟修復(fù)，并減輕肝纖維化。另一項(xiàng)研究表明，成年小鼠肝細(xì)胞活化的YAP過(guò)表達(dá)可觸發(fā)其轉(zhuǎn)分化為祖細(xì)胞樣細(xì)胞，該細(xì)胞可能分化為膽管上皮細(xì)胞或再分化為肝細(xì)胞?？傊琘AP 的激活可能通過(guò)兩種不同的機(jī)制來(lái)促進(jìn)肝臟再生：肝細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化為祖細(xì)胞樣細(xì)胞。

為進(jìn)一步明確YAP對(duì)肝祖細(xì)胞的增殖是否有影響，本研究構(gòu)建了慢性肝損傷模型來(lái)觀察損傷情況下肝臟膽管反應(yīng)程度與YAP表達(dá)之間的關(guān)系，研究結(jié)果顯示損傷組肝臟YAP蛋白和基因水平明顯增加，肝祖細(xì)胞YAP表達(dá)也顯著高于對(duì)照組，表明肝組織特別是肝祖細(xì)胞YAP表達(dá)與慢性肝損傷時(shí)膽管反應(yīng)相關(guān)。在體外，我們分離了原代肝祖細(xì)胞，并構(gòu)建過(guò)表達(dá)和敲減YAP慢病毒載體感染的肝祖細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝祖細(xì)胞過(guò)表達(dá)YAP后細(xì)胞增殖能力得到了顯著的提升，而敲減YAP后肝祖細(xì)胞的增殖受到了顯著的抑制。