邱慧珍 黃鳳妹 何孝金 江建麗

摘 要：目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測動物源性食品中磺胺類藥物殘留。方法：用含0.1%甲酸乙腈提取，均質(zhì)離心，上清液減壓蒸干，2.0 mL的20%甲醇水溶解，2.0 mL正己烷除酯，流動相0.1%甲酸水（含6%乙腈）-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測?？瞻谆|(zhì)加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制工作曲線，外標(biāo)法定量。結(jié)果：20種化合物在2.0～40 ng/mL線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，在3個加標(biāo)水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg和10.0 μg/kg上，平均回收率在70.4%～118.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～10.0%，定量限為2.0 μg/kg。結(jié)論：該方法高效、快速、靈敏度高，可用于動物源性食品中磺胺類藥物殘留的日常分析。

關(guān)鍵詞：質(zhì)譜;磺胺;獸藥殘留;動物源性食品

磺胺類藥物是二氫葉酸合成酶抑制劑，對氨基苯磺酰胺是此類藥物產(chǎn)生藥效的基本結(jié)構(gòu)，甲氧芐啶是磺胺類藥物的抗菌增效劑，抑制二氫葉酸還原酶，與磺胺類藥物合用，對細(xì)菌的生長起到雙重抑制作用?；前奉愃幬锸菓?yīng)用廣泛的抗生素之一，被用于治療動物感染，因為它們價格低廉、毒性低，并且對常見細(xì)菌感染具有出色的抗菌活性，這些抗生素若不加控制地使用，以及不遵守停藥期指南，會導(dǎo)致抗生素耐藥性的發(fā)展。藥物的原形及其代謝產(chǎn)物可蓄積于動物的組織器官或可食性產(chǎn)品中（如蛋、奶）中，從而危及人們的健康。

目前獸藥殘留的檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法等，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對復(fù)雜樣品具有高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點，是獸藥殘留分析的重要手段[1-2]?！秶沂称钒踩O(jiān)督抽檢實施細(xì)則（2021年版）》中規(guī)定磺胺類藥物檢驗的指定方法有《動物源性食品中磺胺類藥物殘留檢測 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（GB/T 21316—2007）、農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部1025號公告-23-2008《動物源食品中磺胺類藥物殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，判定依據(jù)有農(nóng)業(yè)部公告第235號、GB 31650—2019。實施細(xì)則中規(guī)定動物源性食品中磺胺類項目以磺胺類（總量）計，如豬肉中磺胺類（總量）項目至少應(yīng)包含磺胺甲基嘧啶（磺胺甲嘧啶）、磺胺甲惡唑（磺胺甲鯻唑）、磺胺二甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶（磺胺地索辛）、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉（磺胺喹沙啉）和磺胺嘧啶，如檢出其他磺胺藥物殘留，一并計入磺胺類（總量）并判定。

本文著重探討建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中20種磺胺類（甲氧芐啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺苯酰、磺胺苯吡唑、磺胺間二甲氧嘧啶及磺胺喹噁啉）藥物的檢測的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

TSQ Quantis熱電液相質(zhì)譜儀;Milli-Q超純水機(jī)（美國密理博）;冷凍離心機(jī)（德國sigma）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA）;均質(zhì)器（德國IKA）。

1.2 試劑與材料

甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，美國Thermo Fisher公司）;20種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液單標(biāo)（100 μg/mL），購于北京壇墨有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

菲羅門kinetex色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）;流動相：A：0.1%甲酸水（含6%乙腈），B：甲醇;梯度洗脫程序：0～6 min，25%～45%B;6～9 min，45%～85%B;9～10 min，100% B;10～12min，100%B;12～15min，100%～25%B;流速：0.3 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式（ESI+）;多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）;離子噴霧電壓3 500V、霧化器溫度325 ℃、傳輸管溫度325 ℃、碰撞氣N2、輔助器Ar。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制

將20種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液單標(biāo)分別配成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，冷凍保存6個月;吸取各標(biāo)準(zhǔn)貯備液配成1.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷凍保存3個月。吸取0.4 mL 1.0 μg/mL的20種磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL容量瓶中，乙腈定容，濃度為0.04 μg/mL（該溶液臨用現(xiàn)配）。稱取5份與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品2.0 g，分別加入0.04 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.1、0.25、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL，按照2.6項下處理，最終得到2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取2.0 g試樣于50 mL離心管內(nèi)，加入5 g無水硫酸鈉和20 mL酸化乙腈（含1%甲酸），用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min的速度均質(zhì)30 s，振搖，將離心管置于離心機(jī)內(nèi)以3500 r/min的速度離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至150 mL梨形瓶中，加入10 mL異丙醇，40 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，后用2 mL的20%甲醇水溶液溶解，再加2 mL乙腈飽和正己烷渦旋洗脫，于高速離心機(jī)中15 000 r/min離心5 min分層，取下層清液用0.25 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，上機(jī)測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相方法優(yōu)化與典型圖譜

水相中加入適量的甲酸，能明顯提高色譜的分離效果[3]，綜合考慮色譜柱耐酸性和分離效果，添加濃度0.1%甲酸能達(dá)到滿意效果，水相中加入6%乙腈可抑制霉菌生長，減少流動相更換頻率。比較使用甲醇和乙腈作為有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)使用甲醇為有機(jī)相時，色譜峰型對稱性和效果優(yōu)于乙腈，最終確定0.1%甲酸水（含6%乙腈）-甲醇的組合[2]。在該色譜條件下豬肉基質(zhì)陰性樣品色譜圖顯示無明顯干擾[3]，空白基質(zhì)中加入磺胺類物質(zhì)分離效果與質(zhì)控樣圖譜疊加后如圖1所示。

2.2 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化與離子信息

在電噴霧正離子模式（ESI+）下，分別對20種（1 μg/mL）磺胺類獸藥進(jìn)行全掃（SCAN），找出母離子參數(shù);在單離子掃描模式下（SIM）找出最佳的碎裂電壓，使母離子響應(yīng)達(dá)到最大;在產(chǎn)生子離子模式（Product Ion）下找出一對定量和定性離子，后在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下優(yōu)化碎裂電壓，使子離子的響應(yīng)達(dá)到最大值，優(yōu)化后的參數(shù)見表1，帶*為定量離子[3-4]。

2.3 前處理方法優(yōu)化

本實驗比較幾種國標(biāo)方法中使用的提取液乙腈-水（1 000+30）、乙酸乙酯、酸化乙腈（含1%甲酸），實驗發(fā)現(xiàn)乙腈在提取高脂肪高蛋白基質(zhì)時有較好的沉淀效果[3-4];乙腈中加入適量甲酸有助于目標(biāo)物與基質(zhì)中蛋白分離，提高回收率[5]，故選擇酸化乙腈（含1%甲酸）作為提取液。動物源性食品基質(zhì)中脂肪含量普遍較高，現(xiàn)有凈化方法有過HLB小柱[6]、MCX小柱除脂肪或經(jīng)過正己烷液液分配法除脂肪，考慮到上樣、洗脫等一系列操作煩瑣，經(jīng)考察，樣品經(jīng)旋蒸后加入正己烷渦旋除脂肪，離心過濾后即可得到澄清透明的液體。

2.4 溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)考查

比較分別使用純有機(jī)相和初始流動相作為上機(jī)液進(jìn)行分析，用純有機(jī)相上機(jī)分析得到前沿峰，峰型較寬;使用初始流動相定容上機(jī)分析，峰型正常，對稱性好，故最后上機(jī)液應(yīng)使用初始流動相定容?；|(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect）是基質(zhì)的存在導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)產(chǎn)生變化的現(xiàn)象?；|(zhì)常常對分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以通過同等濃度的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與溶劑配制工作曲線之比，即離子抑制（IS）評價基質(zhì)效應(yīng)，離子抑制率（IS）的計算公式如下：

式中：K2-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率;K1-溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率。IS>0，基質(zhì)增強(qiáng);IS<0，基質(zhì)抑制;IS絕對值越大基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)[7-9]。

2.5 校正曲線和相關(guān)系數(shù)

取豬肉陰性基質(zhì)，分別加入20種磺胺混合標(biāo)液（0.1 μg/mL）40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、800 μL，按照1.3.4項處理得到2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、40.0 ng/mL濃度水平。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間為橫坐標(biāo)，被測組分的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體結(jié)果見表2。

2.6 方法的回收率、精密度

取豬肉樣品，做3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)加入回收實驗，稱取樣品后分別加入20種磺胺類混合標(biāo)液使樣品加標(biāo)水平為2.0 μg/kg、4.0 μg/kg和10.0 μg/kg均按本方法做3次平行測定，回收率及精密度見表3。

2.7 方法的定量限

取豬肉陰性基質(zhì)樣品，加標(biāo)水平2.0 μg/kg，按上述方法處理，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定信噪比，20種磺胺類藥物均能滿足S/N≥10.0，故本方法的定量限為2.0 μg/kg。

2.8 測定質(zhì)控樣

取雞肉中磺胺質(zhì)控樣（含3種磺胺類藥物）2份，按照1.3.4樣品前處理方法進(jìn)行測定，測定值在標(biāo)準(zhǔn)值區(qū)間范圍內(nèi)，結(jié)果如表4。

2.9 測定實際樣品

按照上述實驗條件測定監(jiān)督抽檢35批雞蛋、46批禽畜肉、35批水產(chǎn)品，其中1批烏雞樣品磺胺類（總量）160 μg/kg（GB 31650—2019規(guī)定應(yīng)≤100 μg/kg），為不合格樣品;1批雞肉樣品甲氧芐啶45 μg/kg（GB 31650—2019規(guī)定應(yīng)≤50 μg/kg），雖有檢出但未超出限量值;其余樣品磺胺類（總量）與甲氧芐啶項目均為未檢出。

3 結(jié)論與討論

（1）農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008中試樣采用酸化乙腈提取，經(jīng)正己烷液液萃取凈化，內(nèi)標(biāo)法定量。內(nèi)標(biāo)定量是消除基質(zhì)效應(yīng)的常用方法，考慮到內(nèi)標(biāo)物價格較貴，同時多個化合物物僅有一兩個同位素進(jìn)行校正，可能造成回收不理想。同一物質(zhì)在不同基質(zhì)所造成的基質(zhì)效應(yīng)不盡相同，按樣品類別選擇相適應(yīng)的空白基質(zhì)可以有效消除基質(zhì)效應(yīng)，提高回收率。

（2）本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定動物源性食品中20種磺胺類藥物殘留方法，樣品經(jīng)過酸化乙腈均質(zhì)提取，無水硫酸鈉除水，正己烷除油脂后上機(jī)分析，回收率在70%～120%，加標(biāo)回收的RSD在10.0%。同時采用基質(zhì)配工作曲線，以扣除基質(zhì)效應(yīng)帶來的損失。本方法與國標(biāo)及其他現(xiàn)有方法相比，無需內(nèi)標(biāo)物，省去過柱等一系列煩瑣操作，具有準(zhǔn)確、便捷、高效、靈敏的特點，可用于動物源性食品中磺胺類藥物殘留的日常分析。

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