糾敏 李晶晶 李偉山 馮輝 劉瑞顯 魏利輝 周冬梅

摘要：?? 為了開發(fā)對大豆疫霉病病菌具有拮抗作用的放線菌資源，從健康大豆根際土壤中分離篩選獲得2株對大豆疫病具有顯著抑制效果的生防放線菌菌株JAX-13和JAX-14。經(jīng)生理生化和分子生物學鑒定，菌株JAX-13和JAX-14分別為放線菌屬細菌（ Actinomycetales bacterium ）和鏈霉菌（ Streptomyces ）。平板拮抗試驗結(jié)果表明，2種菌株對大豆疫霉病病菌的抑制率分別為56.26%和50.06%;光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株JAX-13和JAX-14發(fā)酵液處理的大豆疫霉病病菌菌絲排列雜亂無章，菌絲生長受到抑制并且菌絲內(nèi)部出現(xiàn)原生質(zhì)聚集成塊現(xiàn)象。盆栽試驗結(jié)果表明，經(jīng)菌株JAX-13和JAX-14發(fā)酵液處理的大豆對大豆疫霉病病菌的防效分別達56.56%和72.22%，且菌株發(fā)酵液對大豆植株具有一定的促生作用。總體來看，菌株JAX-13和JAX-14生防效果優(yōu)良，是2種具有潛在應用價值的放線菌。

關(guān)鍵詞：? 放線菌; 鏈霉菌; 生物防治; 大豆疫病; 大豆疫霉病病菌

中圖分類號：? S482.2 +92??? 文獻標識碼： A??? 文章編號：? 1000-4440（2021）05-1137-06

Screening， identification and biocontrol effect of actinomycetes against ?Phytophthora sojae

JIU Min? 1 ， LI Jing-jing? 1，2 ， LI Wei-shan? 1，2 ， FENG Hui? 2 ， LIU Rui-xian? 3 ， WEI Li-hui? 2 ， ZHOU Dong-mei? 2

（1.College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China; 2.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China; 3.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：? To develop actinomycete resources with antagonistic effect on ?Phytophthora sojae ， two strains of biocontrol actinomycetes JAX-13 and JAX-14 were isolated and screened from healthy soybean rhizosphere soil， which had significant inhibitory effect on soybean ?Phytophthora ?blight. Through physiological， biochemical analysis and molecular biology identification， strains JAX-13 and JAX-14 were identified as ?Actinomycetales bacterium ?and ?Streptomyces ， respectively. The results of plate confrontation test showed that， the inhibition rates of two strains to ?P. sojae ?were 56.26% and 50.06%， respectively. Through optical microscope observation， it was found that the hyphae of ?P. sojae ?treated by the fermentation broth of JAX-13 and JAX-14 strains arranged disorderly， the growth of hyphae was inhibited and the protoplasm in hyphae gathered into lumps. The results of pot experiment showed that， after treated with fermentation broth of JAX-13 or JAX-14 strain， the control effects of soybeans against ?P. sojae ?were 56.56% and 72.22%， respectively， and the fermentation broth showed some promoting effects on the growth of soybean plants. In general， strains JAX-13 and JAX-14 are two kinds of actinomycete with good biocontrol effect and show potential application value.

Key words：? actinomycete; ?Streptomyces ; biological control; soybean blight; ?Phytophthora sojae

大豆疫病是由大豆疫霉菌（ Phytophthora sojae ）感染引起的一種分布范圍廣、危害極其嚴重的全球性土傳病害，防治十分困難? [1-2] 。大豆疫霉病病菌在大豆的整個生育期內(nèi)都可以進行侵染，造成種子、根、莖等腐爛，植株枯死，大豆產(chǎn)量嚴重損失? [3] 。大豆疫病防治的最有效方法是選育抗病品種，但是其抗病資源極為有限? [4] 。目前，預防和控制疫病主要依賴化學防治方法，但化學防治方法的長期使用會造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、危害人類及動物健康等問題? [5] 。生物防治方法利用微生物資源來防治植物病害，具有綠色、安全、無污染等特點，是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒? [6] 。因此，開發(fā)具有防病抗病、綠色無污染的生物防治方法是一種大豆疫病防控的良好途徑。

放線菌屬于一類能夠產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物且分布廣泛的細菌類微生物。目前，研究人員開發(fā)出來的抗生素種類中70%以上均由放線菌產(chǎn)生? [7-8] 。鏈霉菌是一種在土壤中含量較多的放線菌，能夠在土壤中產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，具有促生和抗病等多種功能? [9-10] ，具有潛在的研究和應用價值。劉婷婷等? [11] 從白山市的人參根圍篩選到1株對多種病原真菌都具有較強抑菌作用的放線菌TL-007，并鑒定出其為黑胡桃鏈霉菌（ Streptomyces nogalater ），該菌株對銹腐病的抑菌率為85.93%，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有應用價值。林睿等? [12] 從內(nèi)蒙古土壤樣品中分離到2株鏈霉菌屬（ Streptomyces ?sp.）放線菌WH4-57和WH4-58，其對大腸桿菌（ Escherichia coli ）、釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）等都具有較強的廣譜抗性。黃軍等? [13] 從多年連作的健康辣椒植株根中分離到1株鯉鏈霉菌（ S. carpaticus ）PES-A23，其對辣椒疫霉病病菌（ Phytophthora capsici ）、辣椒鐮刀枯萎病病菌（ Fusarium ?spp.）、辣椒炭疽病病菌（ Colletotrichum ?spp.）、辣椒金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）等均具有顯著的抑制效果。

目前，已有芽孢桿菌（ Bacillus ）和假單胞菌（ Pseudomonas ）用于防治大豆疫病的廣泛報道? [14-18] ，但關(guān)于放線菌防治大豆疫病的相關(guān)報道較少? [19-21] 。為進一步開發(fā)對大豆疫霉病病菌具有拮抗作用的放線菌資源，本研究從江蘇省大豆田未發(fā)病大豆根際土壤中分離得到對大豆疫霉病病菌具有抑制作用的放線菌JAX-13和放線菌JAX-14。本研究發(fā)現(xiàn)的生防放線菌為大豆疫病的控制提供有效資源，并為下一步分離其中的有效成分提供基礎，對利用放線菌開展大豆疫病的生物防治具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采自江蘇省宿遷市未發(fā)病的大豆根際土壤。供試病原菌菌株為大豆疫霉病病菌，由南京農(nóng)業(yè)大學王源超實驗室提供。

放線菌的篩選和抑菌活性測定參照牛紅杰? [22] 的方法進行，培養(yǎng)基分別為高氏一號培養(yǎng)基和馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。放線菌的蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性測定參照徐劉平? [23] 的方法進行，培養(yǎng)基分別為蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和以膠體狀幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基（Chi-Ayers）。放線菌的纖維素酶活性測定參照Ghose? [24] 的方法進行，培養(yǎng)基為纖維素酶活性測定培養(yǎng)基。嗜鐵素的產(chǎn)生參照Shin? [25] 等的方法進行測定，培養(yǎng)基為嗜鐵素檢測培養(yǎng)基（CAS）。

供試大豆種子：合豐35號。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌的分離純化? 將采集的3 g新鮮土壤樣品添加到含27 ml無菌水的玻璃三角瓶中，150 ?r/min 振蕩培養(yǎng)30 min。從三角瓶中取1 ml土壤懸浮液加入到含9 ml無菌水的試管中，混勻后，利用梯度稀釋法制成10? -1 、10? -2 、10? -3 、10? -4 、10? -5 、10? -6 的土壤稀釋液。用玻璃涂布棒在高氏一號培養(yǎng)基上均勻涂100 μl上述各濃度的稀釋液，每個濃度設3個重復，28 ℃連續(xù)培養(yǎng)3 d。選取菌落總數(shù)在 50～ 300 CFU的平板，計數(shù)并依次挑取長出的菌落，在高氏一號固體培養(yǎng)基上純化后，用接種環(huán)挑取單一菌落接種于盛有5 ml高氏一號液體培養(yǎng)基的試管中，28 ℃、200 ?r/min 振蕩培養(yǎng) 24～ 28 h，取懸浮液與等體積50%甘油溶液混勻，于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗性放線菌的篩選與鑒定? 平板對峙試驗：用打孔器從大豆疫霉病病菌平皿中打取大小為 6 mm× 6 mm的大豆疫霉病病菌瓊脂塊，倒置于PDA平板上，同時用接種環(huán)分別挑取待測菌，在距中心2 cm的邊緣劃線，并設置空白對照。28 ℃培養(yǎng) 5～ 7 d后，觀察是否有抑菌現(xiàn)象。挑選抑菌效果顯著的菌株進行保存，用于后續(xù)研究。分子鑒定：按照細菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品]說明書提取放線菌基因組DNA。16 S rDNA的PCR擴增使用通用引物：27 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和149 R（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGACA-3′）。25.0 μl PCR反應體系：dNTP Mix（10 ?mmol/L ）0.5 μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶0.5 μl，27 F 1.0 μl，149 R 1.0 μl，滅菌蒸餾水21.0 μl，提取的總DNA 1.0 μl。PCR反應程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，57 ℃ 55 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物電泳后測序，將測序結(jié)果用NCBI的BLAST進行同源性檢索，從而鑒定菌株。

1.2.3 是否具有蛋白酶活性的測定? 用接種針挑取生防菌接種在蛋白質(zhì)培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)3 d后觀察，如果菌落周圍有透明圈，則表示有蛋白酶活性，否則表示沒有蛋白酶活性。

1.2.4 能否產(chǎn)生嗜鐵素的測定? 用消毒滅菌針或牙簽挑取放線菌接種在CAS培養(yǎng)基中，25 ℃連續(xù)培養(yǎng)3 d，若放線菌菌落周圍出現(xiàn)橘黃色的小暈圈，則表明放線菌菌株具有產(chǎn)生嗜鐵素的能力，否則表示不具有產(chǎn)生嗜鐵素的能力。

1.2.5 能否產(chǎn)生纖維素酶的測定? 用消毒滅菌針或牙簽挑取放線菌，接種在纖維素酶活性測定培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)3 d后將其取出，用剛果紅（ 1 000 ??mg/L ）加水染色1 h后，用氯化鈉（1 ?mol/L ）加水浸泡1 h，若放線菌菌落周圍產(chǎn)生透明圈，則表明放線菌菌株具有產(chǎn)生纖維素酶的能力，否則表示不能直接產(chǎn)生纖維素酶。

1.2.6 能否產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的測定? 用消毒滅菌針或牙簽挑取放線菌菌落，接種在Chi-Ayers培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)5 d后，若放線菌菌落周圍有透明圈，則表明放線菌菌株能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，否則表示放線菌菌株不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

1.2.7 放線菌的液體培養(yǎng)? 在100 ml高氏一號液體培養(yǎng)基中接種100 μl放線菌菌液，28 ℃下連續(xù)培養(yǎng)5 d后，取20 ml菌液接種到含300 ml高氏一號液體培養(yǎng)基的玻璃三角瓶中，28 ℃、180 ?r/min 連續(xù)培養(yǎng)7 d后， 8 000 ??r/min 離心20 min，收集發(fā)酵液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 放線菌發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌的抑制效果? 將放線菌上清液和PDA培養(yǎng)基以 1∶ 5（體積比）混合制成培養(yǎng)基。將大豆疫霉病病菌菌碟菌絲朝下接種在平板（大小為 6 mm× 6 mm）中央，于25 ℃培養(yǎng)6 d后測量菌落半徑（對照組測量大豆疫霉病病菌的菌落半徑，處理組測量靠近生防菌的大豆疫霉病病菌的菌落半徑），以加無菌水處理的PDA平板作為對照，計算抑菌率? [26] ，計算公式：抑菌率=（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照組菌落半 徑× 100%。

1.2.9 放線菌發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌菌絲的影響? 為了準確檢測放線菌在體外對大豆疫霉病病菌菌絲的拮抗作用，分別取5 ml JAX-13和JAX-14發(fā)酵液，4 ℃、 10 000 ??r/min ?離心10 min，然后用0.22 μm細菌過濾器過濾發(fā)酵液，獲得無菌放線菌發(fā)酵液。用顯微鏡（型號：LEIGC DM2500）觀察JAX-13、JAX-14發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌菌絲的影響，以滅菌水作為對照，每組3次重復，觀察并拍照記錄。

1.2.10 放線菌發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌拮抗作用的離體試驗? 分別將大豆葉片完全浸在JAX-13、JAX-14的發(fā)酵液或無菌水中1 min，然后從生長5 d的大豆疫霉病病菌菌落邊緣挑取1個菌碟接種于經(jīng)處理的葉片中心。接種48 h后，用75%乙醇對葉片進行脫色處理后，統(tǒng)計病斑直徑，定量評價2種放線菌對大豆疫霉病病菌的拮抗作用。每組處理6張葉片，重復3次。

1.2.11 放線菌發(fā)酵液防治大豆疫霉病病菌的溫室試驗? 大豆生長14 d后，取長勢一致的植株，每株大豆根圍接種2 ml放線菌發(fā)酵液（對照組接種2 ml滅菌水）。接種放線菌發(fā)酵液7 d后，采用下胚軸接種法? [27] 接種大豆疫霉病病菌，即在大豆植株的下胚軸1 cm處用手術(shù)刀劃取傷口后接種大豆疫霉病病菌菌餅（直 徑 為6 mm），將處理后的大豆植株放在25 ℃、濕度80%和16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計發(fā)病情況。每個處理18株大豆植株，重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和分析使用Microsoft Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防放線菌對大豆疫霉病病菌的拮抗作用與菌種鑒定

從大豆根際土壤中共獲得14株放線菌菌株。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，主要為放線菌屬細菌（ Actinomycetales bacterium ）、鏈霉菌（ Streptomyce ?sp.）和瘡痂鏈霉菌（ Streptomyces scabiei ）（表1）。平板拮抗試驗結(jié)果表明，對大豆疫霉病病菌有抑制作用的放線菌共有11株，其中JAX-13（ Actinomycetales bacterium ）和JAX-14（ Streptomyce ?sp.）對大豆疫霉病病菌具有顯著的抑制效果（圖1），抑菌率分別為56.26%和50.06%。

2.2 生防菌JAX-13和JAX-14的酶活性檢測

由圖2可知，菌株JAX-13可以分泌蛋白酶、嗜鐵素、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶，菌株JAX-14可以分泌纖維素酶、嗜鐵素和蛋白酶，但不能分泌幾丁質(zhì)酶。

2.3 放線菌發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌菌絲的影響

顯微鏡觀察結(jié)果表明，對照組生長正常，菌絲光滑、均勻，菌絲末端分枝近似直角，菌絲體不發(fā)生彎曲。放線菌菌株JAX-13和JAX-14發(fā)酵液處理過的大豆疫霉菌菌絲雜亂無章，菌絲的部分位置彎曲變粗，分枝的角度發(fā)生改變，分枝數(shù)量減少，且菌絲內(nèi)部原生質(zhì)集中成塊（圖3）。

2.4 放線菌發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌的離體防效

菌株JAX-13和JAX-14發(fā)酵液對大豆葉片中大豆疫霉病病菌的拮抗作用研究結(jié)果表明，在接種2 d后，相比經(jīng)H ?2 O處理過的對照組（CK），大豆疫霉病病菌能輕微侵染JAX-13和JAX-14發(fā)酵液處理的葉片，但病斑直徑較?。▓D4）。其中經(jīng)JAX-13發(fā)酵液處理過的病斑直徑為1.30 cm，經(jīng)JAX-14發(fā)酵液處理過的病斑直徑為1.60 cm，對照組病斑直徑為2.00 cm（圖5）。

2.5 放線菌發(fā)酵液對盆栽大豆疫霉病的防效

經(jīng)放線菌菌株JAX-13和JAX-14發(fā)酵液處理后的植株部分出現(xiàn)倒伏，沒有出現(xiàn)死亡植株;而對照組大豆植株全部倒伏，甚至枯萎死亡（圖6），表明放線菌能抵抗大豆疫霉病病菌的侵染。防病率和防效的統(tǒng)計結(jié)果表明，經(jīng)菌株JAX-13處理后的大豆發(fā)病率為44.44%，防效可達56.56%;經(jīng)菌株JAX-14處理后的大豆發(fā)病率為27.78%，防效可達72.22%。相比對照組有顯著差異，防治效果明顯。

3 討 論

本研究分離到2株對大豆疫霉病病菌均具有抑制效果的放線菌菌株JAX-13和JAX-14，經(jīng)鑒定JAX-13和JAX-14分別為放線菌屬細菌和鏈霉菌。

鏈霉菌主要通過拮抗性、競爭性、重寄生性、誘因性和耐受性作用機制來防治各種動植物病害，且鏈霉菌不僅僅通過一種作用發(fā)揮其生防功能，通常是由多種作用共同發(fā)揮其生防功能? [28] 。研究結(jié)果表明，鏈霉菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)能夠抑制病原菌的生長? [29] 。楊紅旗? [30] 從菜豆中發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶能夠抑制真菌生長，而且水稻、煙草、馬鈴薯、大麥、玉米產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶也能有效抑制多種病原菌的生長? [31-32] 。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株JAX-13和JAX-14均能產(chǎn)生蛋白酶、嗜鐵素、纖維素酶，其中JAX-13還可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。推測菌株JAX-13和JAX-14的抑菌機制可能是通過溶菌作用或競爭作用來抑制大豆疫霉菌生長，具體如何發(fā)揮作用還需進一步探究。

黃敏敏? [33] 從福建的土壤樣品中分離到1株生防放線菌Z-16，可使大豆疫霉菌菌絲出現(xiàn)大量分枝、歪曲、變粗變短，孢子及菌絲出現(xiàn)不同程度的緊縮、干癟，一些孢子還出現(xiàn)不正常破裂、孢子內(nèi)含物外泄等。本研究還發(fā)現(xiàn)，菌株JAX-13和JAX-14的發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌菌絲生長具有明顯的影響，通過顯微鏡觀察，對照組菌絲纖細光滑，生長正常，而經(jīng)菌株JAX-13和JAX-14發(fā)酵液處理的大豆疫霉病病菌菌絲排列雜亂無章，分枝減少，且菌絲內(nèi)部原生質(zhì)聚集成塊。由此可見，菌株JAX-13和JAX-14發(fā)酵液可以較好地抑制大豆疫霉病病菌菌絲的生長。

鏈霉菌可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，對病原菌細胞壁、蛋白質(zhì)和核酸的合成等具有抑制作用? [34-38] 。在葉片離體試驗中，菌株JAX-13和JAX-14的發(fā)酵液對大豆疫霉病病菌有顯著防效。在盆栽試驗中，用菌株JAX-13和JAX-14的發(fā)酵液處理后的大豆發(fā)病率均有明顯降低，防治效果明顯，菌株JAX-14的防效更為顯著。由于菌株JAX-13和JAX-14的發(fā)酵液通過細菌過濾器過濾除去了其中的活菌，說明菌株的防治作用不一定來自菌種之間活菌的相互競爭，可能與發(fā)酵液中的一些化學產(chǎn)物相關(guān)，具體機制有待進一步研究。

此外，菌株JAX-13和JAX-14還可能通過誘導植物抗性從而防治大豆疫病。金娜等? [39] 研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液處理感染紅灰鏈霉菌的番茄后，能有效提高番茄表皮中多酚氧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的活性，進而提高番茄抗性。因此，菌株JAX-13和JAX-14的生防機制可能通過多種作用相互結(jié)合進而具有穩(wěn)定的效果，這種生防菌機制能夠在各種復雜多變的條件和環(huán)境中較好地抑制疫霉病病菌的繁殖和生長。本研究后續(xù)將對菌株JAX-13和JAX-14產(chǎn)生的活性物質(zhì)進行分離、純化和鑒定，對其是否引起植物誘導抗性進行驗證，對其在田間的應用進行評估，以期更好地開發(fā)其生防功能，為大豆疫病的防治提供新的方法。

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（責任編輯：陳海霞）