宋一諾，邱 楊，劉奎昊，趙伊然，趙 君，牛玉娟，李 寧，劉思當

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.山東省泰安第二中學，山東泰安 271001；3.青島大學生物醫(yī)學研究院，山東青島 266071）

禽腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）是全球流行的常見禽類病原，可感染雞、鴨等禽類，導致其出現(xiàn)不同的臨床癥狀[1]。根據(jù)FAdV特異性抗原的不同，可分為I、II和III 3個群。其中，I群FAdV根據(jù)病毒基因組特征可進一步分為5個種（A、B、C、D、E），根據(jù)血清中和試驗可分為12個血清型（1～7、8a、8b和9～11），各血清型之間交叉保護性較低或無交叉保護性。目前，我國流行的FAdV主要為I群，以血清4型（FAdV-4）、8a型（FAdV-8a）、8b型（FAdV-8b）和11型（FAdV-11）為主[2]。

FAdV-4引起的雞心包積液綜合征2015年在我國大規(guī)模暴發(fā)并廣泛流行，感染雞出現(xiàn)精神萎靡、低頭呆立等癥狀；剖檢可見心包內(nèi)有大量淡黃色液體或膠凍樣物質(zhì)，肝臟出現(xiàn)明顯壞死灶，伴有出血點或出血斑，肺、腎水腫，偶爾可見花斑腎[3-6]；組織學檢測發(fā)現(xiàn)，肝細胞內(nèi)形成明顯的核內(nèi)包涵體，具有特征性病變。臨床上，F(xiàn)AdV-4常與雞傳染性貧血、傳染性法氏囊病等免疫抑制性疾病病原發(fā)生混合感染[7]，導致其致病性增強，發(fā)病率和死亡率上升[8]。FAdV具有較強的水平傳播和垂直傳播能力，所以短時間內(nèi)給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失[9-10]。

FAdV-4為雙股線性DNA病毒，呈球形，無囊膜，外殼蛋白主要由六鄰體（Hexon）、五鄰體（Penton）和纖維蛋白（Fiber）構(gòu)成，其中Hexon蛋白是FAdV-4的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含主要抗原決定簇，能誘導產(chǎn)生中和抗體，并且該蛋白與FAdV-4的致病性密切相關(guān)[11]。研究顯示，F(xiàn)AdV不僅造成雞群大規(guī)模感染發(fā)病，鴨群也同樣受到嚴重威脅。早在2015年6月，有研究學者就在我國鴨群中發(fā)現(xiàn)了類似心包積液綜合征的病癥，感染鴨心包內(nèi)有淡黃色或無色積液，肝臟變性腫脹或表面有出血點[9]，后進一步研究證實為FAdV-4感染所致[5]。近年來，鴨場FAdV感染愈加頻繁，給養(yǎng)鴨場造成了較大經(jīng)濟損失，但具體發(fā)病原因尚不清楚，因此在鴨群中開展FAdV流行病學調(diào)查迫在眉睫。本研究于2019—2020年，針對山東省中西部地區(qū)鴨群進行FAdV病原學檢測，并針對分離病毒的關(guān)鍵蛋白Hexon進行遺傳進化和氨基酸位點分析，并將分離病毒進行純化和全基因組測序，以期進一步豐富鴨群中FAdV流行病學數(shù)據(jù)，從而對該病綜合防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SimplyP總病毒核酸提取試劑盒，購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；培養(yǎng)基DMEM，購自Gibco；胎牛血清，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；雞肝癌細胞系LMH，為本實驗室保存。

1.2 樣品采集及處理

2019年1月—2020年12月，定期收集山東省中西部泰安、濟寧、菏澤、棗莊、濟南、德州、臨沂、聊城等8個地市鴨場的疑似FAdV感染病例組織樣品237份。剖檢病死鴨，取適量肝、脾組織于潔凈的1.5 mL離心管內(nèi)，加適量PBS及滅菌小鋼珠，充分研磨，反復凍融3次后，于4 ℃，9 000 r/min離心3 min，取上清；經(jīng)0.22 μm濾器過濾后接種于LMH細胞，培養(yǎng)3 d后觀察細胞病變（CPE）；若沒有出現(xiàn)明顯CPE，則盲傳3代，繼續(xù)觀察；最后收取細胞及上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計及PCR檢測

參照GenBank發(fā)表的FAdV、鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、鴨流感病毒（AIV）、新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）以及I型、III型鴨肝炎病毒（DHV-I/III）設(shè)計檢測引物（表1），以提取的核酸為模板進行PCR檢測。DNA病毒反應(yīng)條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。RNA病毒反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4 分離毒株遺傳進化、氨基酸位點分析及全基因組測序

擴增分離毒株的Hexon蛋白基因（引物見表1），連接到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化、挑菌，將菌液PCR陽性產(chǎn)物送公司測序。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載不同類型FAdV參考病毒序列，用MEGA 7軟件通過最大似然法繪制遺傳進化樹。以當前雞FAdV-4流行毒株SDDM-15為參考毒株，分析本研究獲得的分離毒株氨基酸位點變異情況。將分離得到的16株FAdV-4毒株與下載的8株FAdV-4參考毒株使用在線服務(wù)器Adaptive Evolution Server，采用3種方法（SLAC、FEL、MEME）分析其氨基酸位點受到的免疫選擇壓力。選取本研究分離的CHSD-2毒株進行蝕斑純化，提取病毒核酸送上海生工生物工程有限公司進行全基因組測序分析。

表1 本研究中使用的檢測引物

2 結(jié)果與分析

2.1 病原學檢測

2019—2020年，在山東省中西部的泰安、濟寧、菏澤和棗莊等地市（圖1）共采集疑似腺病毒感染鴨病料237份，其中68份檢出FAdV病原學陽性，陽性檢出率為28.69%；鴨群全年四季均有FAdV陽性檢出，其中6—8月份的炎熱夏季和12月—次年2月的寒冷冬季陽性檢出最多（圖2），說明該病在冬季和夏季發(fā)病率較高。

圖1 陽性樣品地市分布

圖2 FAdV不同月份陽性檢出率變化

2.2 病毒分離及其遺傳進化和氨基酸突變分析

將檢測的陽性樣品處理后接種LMH細胞，進行病毒分離。結(jié)果顯示，樣品接種72 h或盲傳3代后，部分接毒組可觀察到明顯的CPE，如細胞聚集、變圓等（圖3）。收集細胞及其上清，再次通過PCR檢測FAdV，可見明亮的目的條帶，說明成功分離到該病毒。本研究中，共分離到16株鴨源FAdV。

圖3 接種腺病毒36 h后LMH細胞病變

為進一步了解目前鴨群中流行的鴨源與雞源FAdV的差異性，將本研究獲得的16株病毒Hexon蛋白基因進行克隆、測序，然后與其他22株參考毒株進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有鴨源FAdV分離株與雞源I群FAdV-4的親緣關(guān)系最近，處在同一個分支，而與鴨源FAdV-1、FAdV-2型親緣關(guān)系較遠（圖4）。

圖4 基于Hexon蛋白基因序列的鴨源FAdV遺傳進化分析結(jié)果

將所有鴨源FAdV分離株的Hexon蛋白與目前流行的雞源FAdV-4參考毒株SDDM-15（登錄號KU877426.1）進行同源性比對和氨基酸位點分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16株分離病毒與參考毒株的氨基酸同源性極高（99.1%～99.9%），分離毒株彼此之間的氨基酸同源性也為98.6%～100%。分離毒株有1～7個數(shù)量不等的氨基酸突變位點，包括23、93、145、201、207、243等。值得注意的是，與雞源SDDM-15相比，所有鴨源FAdV分離株第243位氨基酸均由絲氨酸突變?yōu)樘於０罚ū?），且通過SLAC、FEL、MEME算法分析，發(fā)現(xiàn)243位點至少在兩種方法的顯著值內(nèi)（表3），表明其受到了正向免疫選擇壓力。

表2 鴨源分離株和參考毒株SDDM-15 Hexon蛋白氨基酸突變位點分析結(jié)果

表3 FAdV-4 Hexon蛋白氨基酸受到正向免疫選擇壓力位點的不同算法分析結(jié)果

由于16株鴨源FAdV之間的同源性極高，因此隨機選取1株，將其命名為CHSD-2，通過蝕斑純化后，利用高通量測序獲得其全基因組序列，發(fā)現(xiàn)該分離株全基因長43 724 bp（登錄號MW349185）；進一步將其與雞源FAdV-4代表毒株GDMZ（MG856954.1）、AH-F18（MN781665.1）和CH/AHWH/2018（MN606302.1）進行全基因組序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個毒株的同源性為100%，進一步證實本研究分離的鴨源FAdV與當前流行的雞FAdV-4為同一種病毒。

3 討論

I群FAdV具有廣泛的自然宿主，不僅導致雞、鴨、鵝等家禽發(fā)病，也感染鴿、稚雞、鸚鵡等野生禽類[12]。自2015年FAdV-4在雞群中引起的心包積液綜合征暴發(fā)流行后，鴨群腺病毒的檢出率越來越高。本研究對山東省中西部地區(qū)疑似腺病毒感染的237份病鴨樣品進行病原學檢測，發(fā)現(xiàn)FAdV陽性檢出率為28.69%。呂恒欣等[13]對山東省部分地區(qū)的鴨胚、雛鴨等樣品進行腺病毒PCR檢測，發(fā)現(xiàn)陽性檢出率從23.00%到57.40%不等，表明腺病毒在山東省部分地區(qū)鴨群中普遍存在。該病全年均可發(fā)生，但以冬、夏兩季的發(fā)病率較高，分析原因可能是腺病毒對外界環(huán)境抵抗能力強，可耐高溫和嚴寒，在冬、夏兩季環(huán)境應(yīng)激影響下鴨更易發(fā)病[14]。

整個試驗中，共分離到16株鴨源FAdV。通過遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，這16株鴨源FAdV與雞源FAdV-4的親緣關(guān)系最近，處于同一進化分支?；贔AdV主要毒力蛋白Hexon的氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)：分離的鴨源FAdV與雞源FAdV-4代表毒株SDDM-15具有極高的同源性，為99.1%～99.9%；每個毒株有1～7個數(shù)量不等的氨基酸突變位點，但僅243位點受到了正向免疫選擇壓。因此認為，此次分離到的16株鴨源FAdV和引起雞心包積液綜合征的FAdV-4屬于同一種病毒。同時，進一步將分離的鴨源FAdV分離株CHSD-2全基因組（43 724 bp）與雞源FAdV-4參考毒株GDMZ（MG856954.1）、AH-F18（MN781665.1）和CH/AHWH/2018（MN606302.1）進行全序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHSD-2毒株與雞源FAdV-4參考毒株核苷酸同源性均為100%，也進一步佐證了上述論點。

據(jù)報道[13-14]，多數(shù)FAdV可以在健康禽體內(nèi)存在，使感染禽不表現(xiàn)臨床癥狀或僅表現(xiàn)輕微癥狀，但當與其他病原發(fā)生混合感染或機體抵抗力下降時，F(xiàn)AdV會引起相關(guān)疾病。關(guān)于鴨源FAdV-4對鴨的致病性報道不一，同一血清型不同分離株的致病性也存在不同[15]。粟元文等[16]使用鴨源FAdV-4 SC株感染雛鴨，發(fā)現(xiàn)該毒株可引起鴨群發(fā)病，且日齡越小越易感，死亡率也越高，其中對10日齡雛鴨的致死率可達到90%；而Li等[17]使用FAdV-4 SD0828分離株感染SPF雛鴨后未見任何臨床癥狀和剖檢病變，通過熒光定量方法也未檢測到組織病毒載量。本研究中，16株鴨源FAdV-4分離株的Hexon蛋白氨基酸與雞源參考毒株相比均有不同數(shù)量的突變，但這些突變的氨基酸能否影響病毒致病性，其重要的生物學意義如何，仍需要進一步試驗證明。

由于我國部分商品肉鴨、蛋鴨場存在養(yǎng)殖條件差、管理水平落后、防范意識淡薄等問題，導致鴨病復雜化[20]，如鴨源FAdV檢出率快速提升，并出現(xiàn)較高的混合感染率，使鴨病防控難度進一步增加。對于該病防控，首先要完善飼養(yǎng)管理，注重生物安全，利用有效手段切斷腺病毒的水平傳播及垂直傳播；其次要選擇高效疫苗，建立有效的免疫程序，這對鴨群腺病毒病防控十分必要。