周淑貞，辜質(zhì)純，李成應(yīng)，張瑞雪，張 悻，顧萬軍，黃良宗*

（1.佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，廣東 佛山 528234；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231）

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陽性、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌。芽孢桿菌種類繁多、數(shù)量龐大，是自然界中廣泛存在的非致病性細菌[1-2]。芽孢桿菌作為飼料添加劑可提高飼料利用率，降低飼養(yǎng)成本，預(yù)防和減少疾病的發(fā)生。某些天然活性物質(zhì)，如抗菌肽，具有潛在的可能性，特別是來源于芽孢桿菌的抗菌肽，因其廣譜抗菌能力以及較為高效的活性而備受關(guān)注[3]。芽孢桿菌海陸共棲，是一類公認的抗菌肽或細菌素產(chǎn)生菌[4-6]?？咕牡碾逆溄Y(jié)構(gòu)通過與?；B接的脂肪酸形成脂肽，由環(huán)形肽和脂肪酸組成的脂肽，具有抗菌譜廣、作用迅速強大、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[7]。細菌素是由細菌核糖體合成的抗菌肽，一般作用于目標菌株細胞膜，通過破壞膜結(jié)構(gòu)完整性、造成細胞內(nèi)容物滲漏進而導(dǎo)致細菌死亡。這種不同于抗生素的作用機制使細菌素成為新型抗菌活性物質(zhì)的研究熱點[4]。

本文從不同環(huán)境和益生素產(chǎn)品中分離鑒定12 種共21 株芽孢桿菌。應(yīng)用濾紙片方法進行芽孢桿菌抑菌性的比較試驗，篩選抑菌性較強的菌株，為益生素的應(yīng)用研究和芽孢桿菌抗菌肽研發(fā)的候選菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基瓊脂：葡萄糖10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蛋白胨10 g、瓊脂17 g（固體培養(yǎng)基添加），調(diào)節(jié)pH 值7.0，121 ℃，20 min滅菌，備用。

1.2 指示菌

大腸桿菌（K12D31）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.3 試驗菌株及來源

試驗分離芽孢桿菌菌種（株）均分離自自然環(huán)境和益生菌產(chǎn)品，見表1。

表1 試驗分離鑒定菌種（株）來源Tab.1 Isolate and identify the source of strain

1.4 細菌培養(yǎng)

1.4.1 指示菌培養(yǎng)

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于LB 培養(yǎng)基，37 ℃，120 r/min 培養(yǎng)16～24 h，細菌濃度約為OD600nm=1.0，取出，4 ℃保存，備用。

1.4.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌應(yīng)用普通瓊脂平板分離培養(yǎng)，挑取典型菌落，接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)24 h，取出菌液，置4 ℃，備用。

1.5 抑菌試驗

1.5.1 指示菌抑菌平板制備

取熔化后冷卻至50～56 ℃LB瓊脂，取指示菌液，加每平皿約20 μL，澆注平板，風(fēng)干表面凝集水，備用。

1.5.2 紙片抑菌法

取出待測枯草芽孢桿菌菌液，使用濾紙片（直徑6 mm，121 ℃、20 min 干燥，備用）蘸取被測菌液（約15～20 μL），貼附指示菌平皿表面，以培養(yǎng)基做對照，每株菌做3 皿次重復(fù)，置37 ℃，18～24 h 取出，使用游標卡尺計量抑菌圈直徑（mm），記錄結(jié)果。

1.5.3 結(jié)果判定

參照藥物敏感性判定標準，判定抑菌強度。抑菌圈直徑0 mm判定為“-”；10 mm以下為“+”；10～14 mm為“++”；15～20 mm為“+++”；20 mm以上為“++++”。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗分離菌種鑒定（見圖1、圖2）

圖1 12種21株芽孢桿菌16S rDNA序列同源性比較Fig.1 Comparison of 16S rDNA sequence homology of 21 Bacillus strains from 12 species

試驗分離的芽孢桿菌菌種通過分離純化，對16S rDNA 基因片段測序，并與基因BANK 數(shù)據(jù)庫進行序列同源性比較，并建立試驗菌種（株）系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖1、圖2可知，分離用于試驗的菌株均為芽孢桿菌。

圖2 12種21株芽孢桿菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA sequence phylogenetic tree of 21 Bacillus strains from 12 species

2.2 試驗分離鑒定芽孢桿菌種抑菌性比較（見表2、圖3～圖5）

表2 不同來源12種芽孢桿菌抑菌性篩選比較結(jié)果Tab.2 Bacteriostatic screening and comparison of 12 Bacillus isolates from different sources

圖3 芽孢桿菌抑菌試驗（1）Fig.3 Bacteriostatic test of Bacillus(1)

圖4 芽孢桿菌抑菌試驗（2）Fig.4 Bacteriostatic test of Bacillus(2)

圖5 芽孢桿菌抑菌試驗（3）Fig.5 Bacteriostatic test of Bacillus(3)

由表2、圖3～圖5可知，同一菌種，如4株枯草芽孢桿菌之間抑菌強度不同，枯草芽孢桿菌07 和16 對金黃色葡萄球菌的抑菌強度達到“++++”，但對大腸桿菌的抑菌強度較弱僅達到“++”；其他菌種，如海氏芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌的2株菌的抑菌強度也有差異。不同菌種之間抑菌強度差異明顯，尤其是對大腸桿菌的抑菌強度更為突出。枯草芽孢桿菌07 菌株、枯草芽孢桿菌16 菌株、貝萊斯芽孢桿菌02 菌株和韋氏芽孢桿菌A菌株對金黃色葡萄球菌抑菌強度達到“++++”，對大腸桿菌的抑菌強度達到“++”以上。芽孢桿菌sp.菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌強度達到“+++”。

3 討論

枯草芽孢桿菌作為益生菌飼料添加劑已納入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼用益生菌名錄，并得到廣泛應(yīng)用[8]。根據(jù)益生菌飼料添加劑研發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用的實踐認為，芽孢桿菌的不同菌種抑菌強度也不同。本試驗對不同來源的芽孢桿菌種的抑菌試驗比較也證明了上述觀點。周映華等[9]對3株芽孢桿菌進行生理功能分析，結(jié)果表明，試驗用3種芽孢桿菌對病原菌的抑制效果無顯著差異，因此進一步猜測原因可能是指示菌種類有限，不能清晰反映芽孢桿菌的作用特點，也可能是芽孢桿菌不同菌株的抑菌作用本身就是多方式的。芽孢桿菌多種多樣，其代謝產(chǎn)物也不盡相同，細菌素是許多細菌的核糖體合成肽，可用于對抗致病菌和抗生素耐藥菌[10]，而且細菌素的抗菌機制通常針對與生產(chǎn)者相同或密切相關(guān)的物種，作用范圍比較狹窄。然而，芽孢桿菌屬除了核糖體產(chǎn)生細菌素之外，還能產(chǎn)生非核糖體合成的脂肽，因而表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性[11-12]。因此，上述不同結(jié)果可能是由芽孢桿菌代謝產(chǎn)物不同、抑菌作用方式多樣化造成的。

芽孢桿菌是一類公認的抗菌肽產(chǎn)生菌?？咕耐ㄟ^干擾細胞壁的合成或通過在細胞膜上形成孔來對抗靶細胞[13]。芽孢桿菌的抑菌作用強度主要取決于產(chǎn)生抗菌肽的性質(zhì)和產(chǎn)生量[14-16]。源自芽孢桿菌的抗菌肽，因其廣譜抗菌能力以及較為高效的活性而備受關(guān)注。本試驗通過培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基篩選或單菌多次級代謝策略比較篩選出4種（5株）芽孢桿菌所產(chǎn)生的抗菌肽具有抑菌性，但是抗菌肽產(chǎn)生量的提高有待于進一步研究。

通過抑菌強度比較的4 種（5 株）芽孢桿菌，其中貝萊斯芽孢桿菌02菌株、韋氏芽孢桿菌A菌株對金黃色葡萄球菌抑菌強度達到“++++”，對大腸桿菌的抑菌強度達到“++”以上。芽孢桿菌sp.菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌強度達到“+++”，使得芽孢桿菌抗菌肽的研究更具重要價值。目前，有報道稱韋氏芽孢桿菌可產(chǎn)生能殺死線蟲的揮發(fā)性物質(zhì)[17]，關(guān)于抑菌性的報道較少。有學(xué)者研究貝萊斯芽孢桿菌粗提物對于食源性金黃色葡萄球菌的作用，結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌對于食源性金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用[18]。此外，從青海藏羊瘤胃中分離篩選出的貝萊斯芽孢桿菌對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌有較強的抑菌能力，且抗逆性強、生長速度快[19]。有研究者從蝦腸道分離出一些芽孢桿菌菌株，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌sp.T-J-1 可有效抑制擬態(tài)弧菌Vibrio mimicus、溫和氣單胞菌Aeromonas sobria、副溶血性弧菌V.parahaemolyticusATCC17802、大腸埃希菌Escherichia coli的生長，并認為BacillusspT-J-1在水產(chǎn)養(yǎng)殖中（尤其是蝦的養(yǎng)殖）具備開發(fā)利用的價值[20]。綜上所述，本研究與他人的研究結(jié)果基本一致。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別為革蘭氏陽性和陰性細菌。相比革蘭氏陽性細菌（G+細菌），能有效拮抗革蘭氏陰性細菌（G-細菌）的細菌素更為稀缺。早在2009年，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯[21]，本研究也證明這一觀點。多黏菌素是目前針對G-細菌感染的最后一道防線。對多黏菌素不敏感的超級細菌在世界范圍內(nèi)多有報道，能抑制G-細菌的海洋細菌素有可能成為多黏菌素的替代方案[22]。本研究為益生素菌株應(yīng)用和芽孢桿菌抗菌肽研發(fā)的候選菌株選擇奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌07菌株、枯草芽孢桿菌16菌株、貝萊斯芽孢桿菌02 菌株和韋氏芽孢桿菌A 菌株對金黃色葡萄球菌抑菌強度達到“++++”，對大腸桿菌的抑菌強度達到“++”以上。芽孢桿菌sp.菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌強度達到“+++”，對大腸桿菌的抑菌強度也達到“+++”。對于芽孢桿菌，同一菌種的不同菌株抑菌強度不同；不同菌種之間，抑菌強度差別明顯，并且不同菌種對大腸桿菌的抑菌強度尤為突出。