朱娜　張樹武　徐秉良等

中圖分類號(hào)：S 436. 611. 12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2020174

蘋果炭疽葉枯病（Glomerella leaf spot）是蘋果樹近年來(lái)嚴(yán)重發(fā)生的一種病害。1988年，Leite等首次報(bào)道該病害是由病愿菌有性態(tài)圍小叢殼Glomerella cingulata，無(wú)性態(tài)膠孢炭疽菌Colleto trichum gloeosporioides引起。該病害主要發(fā)生在‘金冠‘嘎啦和‘喬納金等蘋果品種的葉片上，還可危害‘金冠‘富士和‘秦冠等品種的果實(shí)。同時(shí)，該病害的病原菌寄主范圍較廣，可侵染1000多種植物，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致蘋果樹葉片快速干枯脫落，果面形成大量褐色圓形小斑點(diǎn)，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)蘋果炭疽葉枯病的防治已有報(bào)道，主要以化學(xué)防治為主。宋梁棟等研究發(fā)現(xiàn)波爾錳鋅與代森錳鋅對(duì)蘋果炭疽葉枯病防效理想。韓文啟等發(fā)現(xiàn)波爾多液，溴菌腈與甲基硫菌靈與吡唑醚菌酯對(duì)蘋果炭疽葉枯病具有很好防效。但隨著化學(xué)藥劑長(zhǎng)時(shí)間的大量使用，病原菌抗藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致防治效果大幅降低。Spalding等研究發(fā)現(xiàn)芒果炭疽菌對(duì)苯菌靈產(chǎn)生高水平抗性;陳聃等報(bào)道浙江省葡萄炭疽菌Colleto trichum gloeosporioides對(duì)甲基硫菌靈與乙霉威產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性。同時(shí)，化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用造成的農(nóng)藥殘留和生態(tài)環(huán)境污染問題也很嚴(yán)重。

鑒于化學(xué)防治存在的不足，急需尋求安全且對(duì)蘋果炭疽葉枯病高效的防治措施。因此，生物防治已成為國(guó)內(nèi)外蘋果炭疽葉枯病防治研究的新趨勢(shì)。張穎等研究表明，水楊酸可通過提高葉片中防御酶活性以及調(diào)節(jié)SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量，誘導(dǎo)‘嘎啦蘋果葉片對(duì)炭疽葉枯病的抗性。朱學(xué)明等的研究結(jié)果表明，內(nèi)生放線菌A-1對(duì)蘋果炭疽葉枯病的防效達(dá)70. 42%，但是目前應(yīng)用生防菌對(duì)蘋果炭疽葉枯病的防治主要集中于誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性，而且報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)通過生防菌株解淀粉芽胞桿菌TS-1203對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌菌落及孢子萌發(fā)抑制作用的室內(nèi)和離體測(cè)定，旨在為蘋果炭疽葉枯病的生物防治提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試病原菌和生防菌：蘋果炭疽葉枯病菌Glomerella cin.gulata和解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens（TS-1203）均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 TS-1203菌液與發(fā)酵液制備

參考侯寶宏等的方法。將NA培養(yǎng)基上活化24 h的TS-1203菌株取一環(huán)接種于100 mL NB培養(yǎng)液中，置于黑暗，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)12 h后獲得種子液。取5 mL種子液接種于無(wú)菌NYBD培養(yǎng)基中，置于黑暗，28℃，180r/min振蕩48 h后得到菌液。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)4℃ 10000r/min，離心30 min，2次離心后將上清液用無(wú)菌的微孔濾膜過濾器（孔徑0. 22μm）過濾2次，最終獲得液體為發(fā)酵液無(wú)菌原液，4℃保存待用。

1.2.2 TS-1203菌液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定TS-1203菌液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌抑制活性。將直徑為5 mm的濾紙片經(jīng)121℃滅菌25 min后干燥備用。然后，將經(jīng)滅菌的濾紙片置于TS-1203菌液中浸泡，待其完全浸濕后置于無(wú)菌超凈工作臺(tái)中晾干備用。同時(shí)，將25℃光照條件下培養(yǎng)5d的蘋果炭疽葉枯病菌菌餅（d=0.5 cm）接種于PDA培養(yǎng)基中央，沿菌餅四周等距離（距菌餅2cm處）放置4個(gè)浸有菌液的濾紙片，并置于25℃，L∥D=16 h∥8h光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)以等距離浸有等量無(wú)菌水的濾紙片作為對(duì)照，且每個(gè)處理和對(duì)照均為3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24、48、72、96 h后采用“十字交叉法”測(cè)定蘋果炭疽病菌的菌落直徑，并計(jì)算其抑菌率。培養(yǎng)96 h后，挑取處理和對(duì)照中的蘋果炭疽病菌的菌絲，比較和觀察其形態(tài)特征。

抑菌率=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑/對(duì)照菌落直徑-0.5×100%。

1.2.3不同濃度rlrS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

采用菌落生長(zhǎng)速率法測(cè)定。取0.1、0.2、0.5、1、2、3 mL發(fā)酵原液，分別加入19.9、19.8、19.5、19、18、17 ml_未冷卻的PDA中，其終濃度分別為0. 5%，1%、2.5%、5%、10%、15%。在病原菌菌落邊緣打取菌餅（d=0.5cm）將其接種于上述培養(yǎng)基中央，在25℃下光照培養(yǎng)。以加入與發(fā)酵原液等量無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)Sd后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算其抑菌率。

1.2.4 TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌孢子萌發(fā)的影響

用無(wú)菌水將炭疽葉枯病菌的分生孢子配制成1×10⁶個(gè)/ml_的孢子懸浮液備用。然后，將孢子懸浮液與發(fā)酵原液按1：1的比例混勻，取60μL均勻涂布于水瓊脂培養(yǎng)基，置于25 0C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以孢子懸浮液與無(wú)菌水按1：1的比例混勻?yàn)閷?duì)照，分別于處理后6、12、18、24h觀察分生孢子形態(tài)，計(jì)算萌發(fā)抑制率及芽管生長(zhǎng)抑制率。試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察5個(gè)視野。

1.2.5 TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

選取‘富士蘋果樹枝條前端完全展開的葉片，用1%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒30s，無(wú)菌水沖洗2～3次，在超凈工作臺(tái)上自然晾干，用滴有無(wú)菌水的無(wú)菌脫脂棉包裹葉柄基部。于葉面（直徑5 mm的圓形區(qū)域內(nèi)）采用“針刺法”進(jìn)行傷口處理，刺傷部位避開葉片主脈，將發(fā)酵液均勻涂抹在葉片表面待風(fēng)干后將培養(yǎng)好的蘋果炭疽葉枯病菌菌餅（d=5 mm）接種于傷口處，試驗(yàn)設(shè)無(wú)菌水處理作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種后觀察病斑擴(kuò)展情況。接種5d后采用“十字交叉法”測(cè)量病斑大小，并計(jì)算抑制率。

抑制率=對(duì)照病斑直徑-處理病斑直徑/對(duì)照病斑直徑×100%。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用SPSS軟件和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1 TS-1203菌液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

與對(duì)照相比，TS-1203菌液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌具有顯著的抑制作用（圖1）。處理24h時(shí)，TS-1203菌液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑菌率為62. 5%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑菌率顯著增加，處理96 h的抑制率為70.4%（表1），蘋果炭疽葉枯病菌菌落生長(zhǎng)至靠近濾紙片后菌絲停止向?yàn)V紙片方向生長(zhǎng)（圖1a和b），而對(duì)照菌落生長(zhǎng)正常，近乎長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿（圖1c和d）。

培養(yǎng)96 h后挑取處理組菌絲及對(duì)照菌絲觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照菌絲生長(zhǎng)正常（圖2a），而TS-1203菌液處理組菌絲出現(xiàn)畸形膨大（圖2b）和部分消解斷裂（圖2c）。

2.2不同濃度TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

不同濃度TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，而且隨著濃度的增加其抑制作用顯著增加（圖3）。與對(duì)照相比，經(jīng)濃度為0.5%、1%、2.5%、5%、10%、15%的TS-1203發(fā)酵液處理5d后的病原菌菌落直徑均顯著小于對(duì)照，隨著濃度增加其菌落直徑顯著減小，不同濃度之間存在顯著差異。當(dāng)TS-1203發(fā)酵液濃度為15%時(shí)，對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌抑菌率最高，為59.0%（表2）。

2.3 TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌孢子萌發(fā)及芽管長(zhǎng)度的影響

TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌分生孢子萌發(fā)和芽管的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵原液處理6h后分生孢子開始萌發(fā)，但芽管的生長(zhǎng)受到顯著抑制（圖4A），而無(wú)菌水對(duì)照處理的孢子芽管長(zhǎng)度是發(fā)酵原液處理的2倍（圖4a）。發(fā)酵原液處理12h后，孢子與對(duì)照處理（圖4b）相比芽管生長(zhǎng)緩慢（圖4B）。隨著處理時(shí)間增加，發(fā)酵液處理與無(wú)菌水處理的孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度均增加，但發(fā)酵原液處理18 h后，病原菌的芽管明顯受到了抑制（圖4C），而對(duì)照芽管生長(zhǎng)正常（圖4c）。發(fā)酵原液處理24h后，病原菌芽管出現(xiàn)粗細(xì)不均、生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象（圖4d），而無(wú)菌水處理的芽管生長(zhǎng)速度較快且生長(zhǎng)正常（圖4d）。

處理6、12、18和24 h后，發(fā)酵原液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制率均高于60%，其中處理6h的孢子萌發(fā)抑制率最低，為66. 7%;處理12h和18 h的孢子萌發(fā)抑制率分別為68. 2%和72.4%，處理24 h后孢子萌發(fā)抑制率最高，達(dá)78. 2%（表3）。隨著處理時(shí)間增加，對(duì)芽管生長(zhǎng)抑制率逐漸增大，處理24h后芽管生長(zhǎng)抑制率最高，為64. 3%（表4）。

2.4 TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

經(jīng)TS-1203發(fā)酵液處理的蘋果離體葉片接種炭疽葉枯病菌后保濕培養(yǎng)3d后，蘋果葉片均未出現(xiàn)明顯病斑，5d后蘋果葉片發(fā)病但病斑面積較小，且擴(kuò)展緩慢。而以無(wú)菌水作為對(duì)照處理的蘋果葉片發(fā)病較快，接種3d后葉片出現(xiàn)褐色病斑，發(fā)病率為100%，5d后出現(xiàn)不規(guī)則形褐色壞死斑，病斑直徑為18.4 mm;TS-1203發(fā)酵原液處理組發(fā)病輕且緩慢，5d后病斑直徑僅5.5 mm（圖5，表5）。同時(shí)，與對(duì)照相比，處理5d后，TS-1203發(fā)酵原液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的抑制率高達(dá)70.1%（表5）。

3討論

解淀粉芽胞桿菌Bacillus

amylolique faciens-是一種安全且對(duì)逆境條件有良好耐受力和抵抗力的菌株，它與枯草芽胞桿菌極為相似，可作為根圍有益菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)。同時(shí)也可以產(chǎn)生抗生素和抑菌蛋白等活性物質(zhì)抑制植物病原菌。陳成等報(bào)道解淀粉芽胞桿菌HN06對(duì)黑曲霉Aspergillus niger、稻瘟菌Magnaporthe oryzae、水稻紋枯菌Rhizoctonia solani和苦瓜枯萎病菌Fusarium orysporum f.sp.momdicae均有良好的抑制作用。陳士云等研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌菌株CH-2不僅可以抑制油菜核盤菌Sclerotinia sclerotiorum菌絲的生長(zhǎng)，而且能抑制菌核的形成。解淀粉芽胞桿菌的抑菌機(jī)理主要包括抑制菌絲生長(zhǎng)使其菌絲畸形消融、變細(xì)，原生質(zhì)體滲漏，以及抑制孢子萌發(fā)。

關(guān)于解淀粉芽胞桿菌的抑菌作用，劉超等報(bào)道解淀粉芽胞桿菌菌株BA-26使灰葡萄孢Botrytiscinerea菌絲生長(zhǎng)受阻、膨大變粗、并能抑制其孢子萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌TS-1203菌液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌具有顯著地抑制作用（70.1%）;顯微觀察發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲出現(xiàn)畸形、膨大、縊縮、斷裂等現(xiàn)象，表明解淀粉芽胞桿菌TS-1203可通過接觸病原菌菌絲使其菌絲不能正常生長(zhǎng)從而達(dá)到抑制病原菌的作用。TS-1203發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌的孢子萌發(fā)以及芽管生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用，且抑制率隨著發(fā)酵液濃度的增加而上升。不同時(shí)間段顯微觀察發(fā)現(xiàn)，TS-1203發(fā)酵液可導(dǎo)致病菌分生孢子萌發(fā)時(shí)間延遲、萌發(fā)率降低，芽管畸形、生長(zhǎng)緩慢。隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子的萌發(fā)抑制率與芽管的生長(zhǎng)抑制率也顯著增加。說明菌株TS-1203發(fā)酵液可通過抑制病原菌的孢子萌發(fā)及生長(zhǎng)達(dá)到抑制病原菌的目的。李揚(yáng)等發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌ZJ01對(duì)棗黑斑病菌Alternaria alternata的抑制率達(dá)到53. 3%，且發(fā)酵液處理過的病原菌菌絲出現(xiàn)了頂端膨大、原生質(zhì)割裂、孢子萌發(fā)受抑制等現(xiàn)象。

另外，在芽胞桿菌對(duì)病斑擴(kuò)展的抑制作用研究中，紀(jì)兆林等發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌Bacillus lichen-iformis W10對(duì)炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)都有明顯的破壞或抑制作用，且對(duì)病斑擴(kuò)展具有明顯的抑制作用。本試驗(yàn)中TS-1203發(fā)酵液處理蘋果樹離體葉片并接種病原菌后發(fā)病遲緩且發(fā)病較輕，說明解淀粉芽胞桿菌可以有效地抑制植物病原菌的侵染并對(duì)離體葉片上的病斑擴(kuò)展有顯著的抑制作用。

因此，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌TS-1203菌株及其發(fā)酵液對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌具有顯著的抑制作用，研究結(jié)果為后期的生物防治提供了基礎(chǔ)，但是對(duì)TS-1203菌株的抑菌機(jī)理和抑菌活性物質(zhì)的研究及TS-1203菌株在田間防治蘋果炭疽葉枯病尚需進(jìn)一步研究。