劉青云 辛嘉英, 路雪純 肖婧泓 夏春谷

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，哈爾濱 150076)(中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，蘭州 730000)

阿魏酸(Ferulic acid，F(xiàn)A)，是肉桂酸家族中的一種酚類成分，作為植物細(xì)胞壁中半纖維素和木質(zhì)素的一種成分以及在葉子和其他植物部分的木栓質(zhì)和蠟質(zhì)表面而廣泛存在于整個(gè)植物界中[1]，它在322 nm處具有最大紫外吸收，可用作潛在的紫外吸收物質(zhì)，使皮膚免受陽(yáng)光照射，由于其優(yōu)異的抗氧化、抗癌癥和抗誘變活性等生理功能，阿魏酸成為一種很有前途的功能性食品、藥物和化妝品的原料[2]。然而，在水和油中的低溶解度限制了它的應(yīng)用，需引入親水或疏水基團(tuán)來(lái)改善其水溶性或油溶性。

阿魏酸的羧酸部分容易被生物酯酶和脂肪酶酯化和酯交換，在谷物膜中酯化為植物甾醇，在草本植物和植物莖中酯化為糖，在塊莖和花中酯化為甘油[3]。阿魏酸甘油酯是阿魏酸的水溶性衍生物，包括阿魏酸單甘油酯(Glyceryl Ferulate, FG)、二阿魏酸甘油酯(Glyceryl Diferulate, F2G)和三阿魏酸甘油酯，在280～360 nm處表現(xiàn)出良好的紫外吸收性能，在322 nm處有最大λ值。阿魏酸甘油酯的高度共軛結(jié)構(gòu)賦予其強(qiáng)紫外線吸收特性，酚羥基的存在賦予其抗氧化能力[4，5],是天然的紫外線過(guò)濾器和抗氧化劑。這些功能特性長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是有價(jià)值的屬性，可用作食品、健康和個(gè)人護(hù)理應(yīng)用[6，7]。它通常從天然植物源(如小麥、馬鈴薯、百合)中提取，但是分離較困難，因?yàn)楹糠浅５?<0.1%)，這推進(jìn)了阿魏酸甘油酯化學(xué)合成研究的開(kāi)展；在以前的報(bào)告中，阿魏酸可通過(guò)化學(xué)和酶法制備，高溫、反應(yīng)劇烈、污染等缺點(diǎn)使得阿魏酸甘油酯的化學(xué)合成受到限制，與化學(xué)法相比，酶法合成具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、對(duì)映選擇性高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[8，9]。

注：sn-1(3)-FG表示sn-1(3)-阿魏酸單甘油酯；sn-1,3-DFG表示sn-1,3-二阿魏酸甘油酯，余同。圖1 阿魏酸甘油酯的合成[11]

目前，阿魏酸甘油酯的合成途徑主要有2種(圖1)：一是阿魏酸與甘油(Glycerol)經(jīng)過(guò)催化劑催化進(jìn)行酯化反應(yīng)獲得[10，11]；二是阿魏酸乙酯(Ethyl ferulate，EF)和甘油經(jīng)過(guò)催化劑催化進(jìn)行酯交換反應(yīng)獲得[12，13]。本文綜述了阿魏酸甘油酯酯化合成和酯交換合成的實(shí)例以及2種快速分離純化鑒定技術(shù)，并分析了各個(gè)合成方法的優(yōu)缺點(diǎn)，簡(jiǎn)述了其應(yīng)用，為學(xué)者進(jìn)一步研究阿魏酸甘油酯的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 酯化合成

阿魏酸對(duì)熱敏感，且在一定的酸堿度條件下容易氧化，此外?；w移是甘油酯合成過(guò)程中常見(jiàn)的現(xiàn)象，可在堿、酸和高溫等條件下發(fā)生，因此保護(hù)阿魏酸的酚羥基和溫和的去保護(hù)步驟是很必要的。早在2002年，在Mitsunobu反應(yīng)的溫和條件下，咖啡酸的一些酯已經(jīng)成功制備[14]。由于這種方法已被證明能產(chǎn)生羧酸酯而不是酚酸酯，Daniela等[15]利用這一反應(yīng)對(duì)阿魏酸與甘油直接進(jìn)行酯化，嘗試了阿魏酸甘油酯的從頭合成。為了只獲得單甘酯，實(shí)驗(yàn)從R，S-酮取代甘油開(kāi)始，并通過(guò)Mitsunobu方案將其轉(zhuǎn)化為酚酸酯，用濕Aberlyst15去保護(hù)所產(chǎn)生的乙酰苯胺，在合成過(guò)程中，收獲了一些關(guān)于酸的反應(yīng)活性和產(chǎn)物收率的意想不到的結(jié)果。

通過(guò)合成單酯而不是二酯來(lái)滿足獲得更具親水性的紫外濾光器的目的，Holser等[16]在較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)成功地完成了甘油和4-甲氧基肉桂酸的直接一步反應(yīng)，酯化反應(yīng)在甲苯中使用對(duì)甲苯磺酸催化劑催化等摩爾量的反應(yīng)物在回流條件下進(jìn)行，獲得產(chǎn)率約為20%的產(chǎn)物。然后對(duì)其進(jìn)行表征分析，結(jié)果顯示，4-甲氧基肉桂酸和甘油的伯羥基之間形成酯鍵，液質(zhì)聯(lián)用顯示生成的產(chǎn)物是sn-1位4-甲氧基肉桂酰單甘油酯。

與化學(xué)方法相比，酶法合成阿魏酸甘油酯具有產(chǎn)物得率高、反應(yīng)環(huán)境綠色、對(duì)映選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。阿魏酸與甘油的酶催化直接合成也有實(shí)例，Moriyasu等[17]在二甲基亞砜溶劑體系中通過(guò)酶促酯化反應(yīng)合成比阿魏酸更易溶于水的阿魏酸衍生物，還篩選了具有高催化阿魏酸與甘油酯化能力的酶制劑，最后成功地從黑曲霉的果膠酶PL中純化出一種阿魏酸酯酶，其比活性為9.7 U/mg，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較高濃度的甘油和阿魏酸產(chǎn)生較高量的阿魏酸甘油酯，這表明在高濃度的阿魏酸和反應(yīng)產(chǎn)物存在下酶活性沒(méi)有損失，產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜分析確定是1-阿魏酸單甘油酯。

注：①含水量為7.5%(質(zhì)量比)的甘油儲(chǔ)罐，②泵，③阿魏酸的溶解容器，④磁力攪拌器，⑤填充有來(lái)自南極假絲酵母的固定化脂肪酶的反應(yīng)器，⑥含有阿魏酸甘油酯的反應(yīng)器流出物的容器，⑦烘箱。圖2 一種連續(xù)合成阿魏酸單甘油酯的反應(yīng)器系統(tǒng)[18]

在間歇反應(yīng)器中，在50～90 ℃條件下，Takemasa[18]用南極假絲酵母固定化脂肪酶(Chirazyme?L-2C2)催化阿魏酸和不同含水量的甘油直接酯化得到主產(chǎn)物阿魏酸單甘油酯，二阿魏酸甘油酯和三阿魏酸甘油酯的量很少。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿魏酸在較高溫度和較低含水量的甘油中表現(xiàn)出較高的溶解度，其中含水量為7.5%的甘油進(jìn)行酯化反應(yīng)最受歡迎。然后構(gòu)建用于連續(xù)合成的反應(yīng)器系統(tǒng)(圖2)，并穩(wěn)定運(yùn)行以實(shí)現(xiàn)430 kg/[m3-反應(yīng)器(d)]的生產(chǎn)率，并證明了在至少6 d內(nèi)以高生產(chǎn)率生產(chǎn)所需的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率沒(méi)有任何降低。

近年來(lái)，離子液體因其寬的液體區(qū)域、可忽略的蒸汽壓、低腐蝕性、不易燃性、可多次使用、熱穩(wěn)定性、可變的特異性和良好的溶劑化性質(zhì)和可調(diào)節(jié)的極性等優(yōu)異的性質(zhì)，從而作為許多反應(yīng)的催化劑和替代溶劑，使得阿魏酸甘油酯的合成更加高效和綠色，這引起了人們的極大興趣[19-21]。在早些的時(shí)候，Sun[22]在離子體系下，通過(guò)阿魏酸與甘油的酯化反應(yīng)合成1-阿魏酸單甘油酯(圖3)；并取得了阿魏酸的轉(zhuǎn)化率和1-阿魏酸單甘油酯的收率均為98%的好效果。這一結(jié)果表明，用離子液體代替有機(jī)溶劑，使得阿魏酸甘油酯的合成更加高效和綠色。

注：[Bmim]BF4表示1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽。圖3 對(duì)甲基苯磺酸催化阿魏酸和甘油在[Bmim]BF4中的酯化反應(yīng)[22]

2 酯交換合成

阿魏酸甘油酯的另一種合成方式是利用阿魏酸乙酯和甘油或植物油發(fā)生酯交換反應(yīng)。此法相比較于酯化合成，產(chǎn)率會(huì)提高，例如，Sun等[23]曾嘗試通過(guò)用南極假絲酵母脂肪酶(Novozym435)催化阿魏酸和甘油來(lái)合成阿魏酸甘油酯。然而，在反應(yīng)14 h后阿魏酸甘油酯的產(chǎn)率僅為10%，如此低的反應(yīng)速率在于阿魏酸在甘油中的有限溶解。接著，改用Novozym435催化阿魏酸乙酯與甘油(摩爾比1∶10)的酯交換反應(yīng)獲得阿魏酸甘油酯，并比較了真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空磁力攪拌和軌道培養(yǎng)箱搖動(dòng)三種合成方法下阿魏酸乙酯轉(zhuǎn)化率和阿魏酸甘油酯收率的大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)合成方法下，阿魏酸乙酯實(shí)現(xiàn)全部轉(zhuǎn)化，且阿魏酸甘油酯收率高達(dá)96%，這一結(jié)果歸因于外部傳質(zhì)的消除和乙醇去除的效率；也說(shuō)明相較于阿魏酸，Novozym435對(duì)阿魏酸乙酯具有更高的底物活性。產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜和液質(zhì)聯(lián)用分析確定是1-阿魏酸單甘油酯。為了減少甘油的使用量，David等[24]將阿魏酸乙酯和甘油按照1∶1的比例在固定化酶的催化下合成阿魏酸單甘油酯，雖然降低了甘油的用量，但該反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)(7 d)，其中未知的因素會(huì)對(duì)最后的得率產(chǎn)生一定影響。

在上述反應(yīng)中，需要通過(guò)添加大量的甘油或是延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間來(lái)提高反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的得率。為了彌補(bǔ)缺陷，秦飛等[25]提出一種新型的具有反應(yīng)時(shí)間短、反應(yīng)物甘油含量低、轉(zhuǎn)化率和得率均高的阿魏酸甘油酯合成路徑，即在新型綠色溶劑離子液體體系中，用Novozym435催化摩爾比為1∶1.4阿魏酸乙酯和甘油的酯交換反應(yīng)(圖4)，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)5 h后，反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)99.47%。產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)分析確定有sn-1-阿魏酸單甘油酯和sn-1,3-二阿魏酸甘油酯。

注：Novozym435表示固定化酶435；離子液體指的是1-乙基-3-甲基咪唑雙[(三氟甲基)磺?；鵠酰亞胺([EMIM]TF2N)，余同。圖4 Novozym435催化阿魏酸和甘油在[EMIM]TF2N中的酯化反應(yīng)[25]

阿魏酸甘油酯的合成有一些是在無(wú)溶劑體系下且使用各種功能化的離子液體作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)的。Sun等[26]在不同功能化的離子液體(Ionic Liquids,ILs)體系中(表1)，在無(wú)溶劑體系下，阿魏酸乙酯和甘油發(fā)生酯交換反應(yīng)合成1-阿魏酸單甘油酯，并以反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物的收率和產(chǎn)物的反應(yīng)選擇性(產(chǎn)物的收率/反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率)為參考指標(biāo)，選出最優(yōu)離子體系。結(jié)果顯示，在1-丁基磺酸-3-甲基咪唑甲苯磺酸鹽([BSO3HMIM]TS)離子液體體系中，獲得了較高反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率(98.0±1.5)%、1-阿魏酸單甘油酯收率(88.7±1.1)%和1-阿魏酸單甘油酯的反應(yīng)選擇性(90.5±2.1)%，這與SO3H-功能化離子液體在溫和條件下顯示出比非功能化離子液體更高的催化活性理論一致，這是因?yàn)镾O3H-官能團(tuán)的存在可以明顯提高反應(yīng)物的酸性和溶解性[27]。

表1 離子液體的名稱和縮寫(xiě)

Sun等[28]考察了工藝參數(shù)(反應(yīng)溫度、酶濃度和底物濃度比)和動(dòng)力學(xué)常數(shù)對(duì)在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM]PF6)離子體系中用固定化脂肪酶Novozym435催化阿魏酸乙酯與甘油的酯交換反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，在[BMIM]PF6離子體系中，在80 ℃、Novozym435濃度為60 mg/mL、反應(yīng)物摩爾比為1∶1時(shí)，阿魏酸甘油酯(sn-1-阿魏酸單甘油酯和sn-1,3-二阿魏酸甘油酯)的產(chǎn)率最高，為(63.72±1.26)%；Lineweaver-Burk圖顯示EF與甘油的酶促酯交換反應(yīng)符合經(jīng)典的米氏動(dòng)力學(xué)，較高濃度的EF和甘油均抑制酶活性。因此，酶促酯交換反應(yīng)可以用Ping-Pong Bi-Bi動(dòng)力學(xué)機(jī)制來(lái)模擬，動(dòng)力學(xué)常數(shù)可通過(guò)上述模型的非線性回歸分析獲得，Vmax、KM分別為12.01 mol/(L·min)、0.23 mol/L，表明酶與阿魏酸乙酯的親和力高于甘油；KI為1.20 mol/L，這歸因于酶微環(huán)境中形成的甘油位阻層以及阿魏酸乙酯的給電子位阻和空間位阻[29,30]。

表2 離子液體的名稱和縮寫(xiě)

雖然功能化離子液體的諸多優(yōu)點(diǎn)使其成為新型綠色催化劑，但其黏度大、價(jià)格高的缺點(diǎn)也會(huì)限制它的使用；超聲波輔助可以降低黏度，且反應(yīng)快速，可以很好地改進(jìn)這些缺點(diǎn)[32，33]。陳小威等[34]在無(wú)溶劑體系中，用超聲波輔助固定化脂肪酶催化阿魏酸乙酯和甘油的酯交換反應(yīng)，并探討了使用超聲和磁力攪拌在真空和密閉條件下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的得率的影響。結(jié)果顯示，在超聲反應(yīng)方式下反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的得率都明顯優(yōu)于在磁力攪拌器中的反應(yīng)效果，分析其原因，超聲可使酶周?chē)乃瘜幼儽?，從而使反?yīng)體系很好地傳質(zhì)，這一結(jié)果對(duì)深入研究阿魏酸甘油酯的合成提供了理論基礎(chǔ)。

Sun等[35]研究了無(wú)溶劑體系中以Novozym435為催化劑催化阿魏酸乙酯與蓖麻油酯交換合成阿魏酸甘油酯的路線，考察了阿魏?；w、反應(yīng)變量(酶負(fù)載量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物濃度比)和乙醇去除對(duì)酯交換反應(yīng)的影響(圖5)。結(jié)果顯示，當(dāng)使用阿魏酸乙酯作為阿魏?；w時(shí)，反應(yīng)完成后其轉(zhuǎn)化率為(53.5±2.5)%，遠(yuǎn)高于阿魏酸的2%，故阿魏酸乙酯是比阿魏酸更優(yōu)選的阿魏?；w；在乙醇去除對(duì)酯交換反應(yīng)的影響中，真空條件下轉(zhuǎn)換率可提高到100%，而在大氣壓力下轉(zhuǎn)化率幾乎保持相同水平，這一結(jié)果證明在真空條件下副產(chǎn)物乙醇的有效去除；最后該反應(yīng)的最優(yōu)條件為：酶負(fù)載量20%、反應(yīng)時(shí)間72 h、反應(yīng)溫度90 ℃和底物濃度比1∶1，得到37.3%的親水性阿魏酸甘油酯(阿魏酸單甘油酯和二阿魏酸甘油酯的總和)。

圖5 酶促蓖麻油與阿魏酸乙酯酯交換合成阿魏酸甘油酯[35]

在以前酶法合成阿魏酸甘油酯時(shí)，Novozym435具有最好的催化活性，而它的高成本和甘油在其上的吸附限制了它的工業(yè)應(yīng)用。為了降低生物催化劑的成本和克服Novozym435對(duì)甘油的吸附，Yao等[36]使用3種市售的游離液體脂肪酶(CAL-A、CAL-B和TL)作為催化劑，阿魏酸乙酯和甘油進(jìn)行酯交換反應(yīng)合成水溶性阿魏酸甘油酯，并分析了游離脂肪酶的催化性能以及評(píng)價(jià)不同阿魏?；w(阿魏酸乙酯和阿魏酸)、反應(yīng)體系壓力(大氣壓和真空壓力)和反應(yīng)變量(溫度、底物比、時(shí)間和酶負(fù)荷)對(duì)產(chǎn)物水溶性阿魏酸單甘油酯的影響。對(duì)于酶的篩選，與CAL-A和TL相比，CAL-B表現(xiàn)出最佳的反應(yīng)活性，即CAL-B活性高于CAL-A和TL[37]；對(duì)于阿魏酰基供體，當(dāng)阿魏酸乙酯作阿魏?；w時(shí)，反應(yīng)24 h后轉(zhuǎn)化率(88.6±2.3)%高于阿魏酸(<30%)，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)體系中，阿魏酸(174 ℃)的熔點(diǎn)高于阿魏酸乙酯(64 ℃)，溶解度低于阿魏酸乙酯，則以阿魏酸為阿魏?；w的體系中存在較大的傳質(zhì)限制；對(duì)于反應(yīng)體系壓力，在相同反應(yīng)時(shí)間條件下，大氣壓下轉(zhuǎn)化率(79.2±2.2)%是真空壓力的2倍，這可能是因?yàn)榇髿庀到y(tǒng)中有水的存在；對(duì)于反應(yīng)變量，結(jié)果顯示在70 ℃，底物摩爾比為1∶10，酶負(fù)載量為11.1%，反應(yīng)39.5 h后阿魏酸乙酯轉(zhuǎn)化率為最高(95.7±1.2)%，阿魏酸單甘油酯收率為(84.8±1.5)%。

綜上，對(duì)酯化合成和酯交換合成中應(yīng)用到的有機(jī)溶劑體系、酶催化體系、離子液體體系和無(wú)溶劑體系進(jìn)行綜合分析，其優(yōu)缺點(diǎn)詳見(jiàn)表3。

表3 阿魏酸甘油酯合成過(guò)程中反應(yīng)體系的優(yōu)缺點(diǎn)

3 阿魏酸甘油酯的分離純化及定性定量分析

在阿魏酸甘油酯合成過(guò)程中，有時(shí)會(huì)生成與阿魏酸、阿魏酸雙甘油酯的混合物，可以利用各組分極性的不同來(lái)進(jìn)行鑒別，鑒別方法有薄層色譜法、液體CO2萃取法、高效液相色譜法、柱層析法和分子蒸餾法等[38]。例如Sun等[23]在反應(yīng)結(jié)束后，先過(guò)濾，然后用常壓C18色譜柱[30 μm，(400±30)mm]分離剩余的混合物，用90%、80%、70%、60%甲醇水溶液以2 mL/min的速度連續(xù)洗脫，在320 nm處檢測(cè)洗脫液，合并含有所需產(chǎn)物的餾分，減壓濃縮至干，即可得到純化的阿魏酸單甘油酯產(chǎn)物。陳小威[39]在反應(yīng)結(jié)束后，將混合物進(jìn)行過(guò)濾，所得濾液通過(guò)水洗得到FG，再用乙醇洗滌得到DFG。

快速色譜(Flash Chromatography)，也稱為低壓或中壓液相色譜(25～200 psi，172～1 380 kPa)，是一種用于物質(zhì)純化的定性分離技術(shù)[40]；與用于化合物定量分離和鑒定的分析技術(shù)，如高效液相色譜或超高效液相色譜(>1 000 psi，>6 895 kPa)相對(duì)。該方法是對(duì)制備型高效液相色譜和柱色譜方法的必要改進(jìn)，能夠有效地處理含量約100 g的物質(zhì)；而之前的方法僅可純化毫克至低克量的阿魏酸甘油酯或用于單獨(dú)分離少量的混合物。

David等[41]研究了一種中試規(guī)模(1 000 kg/年)的連續(xù)進(jìn)料、填充床、酶生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器采用固定化脂肪酶Novozym 435在60 ℃下將阿魏酸乙酯和植物油三酰甘油(如大豆、椰子)進(jìn)行酯交換反應(yīng)，在室溫下放置7 d后，所得阿魏酸化植物油反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生粗黃色沉淀(96.4 g，4.02%)，并利用快速色譜方法對(duì)沉淀物進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果顯示，是含阿魏酸甘油酯的混合物，其中在甘油骨架上至少有一個(gè)阿魏酸部分和一個(gè)脂肪酸部分[42]。

具體操作流程為使用CombiFlash Rf 200i快速色譜系統(tǒng)純化粗黃色沉淀物，該系統(tǒng)在325 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)，并通過(guò)改變RediSep柱尺寸、溶劑流速、溶劑梯度和粗產(chǎn)品樣品負(fù)載來(lái)優(yōu)化阿魏酸單甘油酯和二阿魏酸甘油酯的純化。分離過(guò)程為將粗黃色沉淀物(3.0 g)溶解在丙酮(10 mL)中，并用注射器將溶液裝載到12 g RediSep柱上，將其真空抽吸至干1 h用作垂直于120 g RediSep分離柱上方的裝載柱，接著以57 mL/min的速度在“液體加載”模式下進(jìn)行分離，首先用己烷平衡堆積柱的三柱體積(CV)，然后用0～80%丙酮/己烷二元梯度在7 CV上開(kāi)發(fā)堆積柱，接著用80%丙酮/己烷二元梯度洗脫1 CV，最后用100%己烷洗脫2 CV；合并含有目標(biāo)峰的溶劑收集管，通過(guò)旋蒸除去溶劑。將所得白色固體(二阿魏酸甘油酯)或黃色油狀液體(阿魏酸單甘油酯)在真空(11.6 Pa)下于30 ℃干燥18 h。合并所有分離，得到:二阿魏酸甘油酯39.1 g(相對(duì)于粗黃色沉淀為40.6%)和阿魏酸單甘油酯 9.4 g(相對(duì)于粗黃色沉淀為9.8%)。

用快速色譜法處理95.0 g以上的粗副產(chǎn)物混合物，這與通過(guò)高效液相色譜、1H核磁共振、13C核磁共振和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜對(duì)阿魏酸甘油酯表征結(jié)果一致。阿魏酸甘油酯分別被分離為sn-1，3和sn-1位置異構(gòu)體二阿魏酸甘油酯(F2G)和阿魏酸單甘油酯(FG)，并且在快速色譜純化過(guò)程中或在儲(chǔ)存期間沒(méi)有表現(xiàn)出?；倪w移。

在之前的報(bào)道中已進(jìn)行了阿魏酸甘油酯中試規(guī)模的生產(chǎn)，如果生物反應(yīng)器系統(tǒng)的水活度沒(méi)有最小化(<250 mg/L)，或者如果反應(yīng)是用單?；视瓦M(jìn)行的，那么阿魏酸甘油酯的形成增加(4%～30%)，并且這些分子物質(zhì)從阿魏酸化的植物油產(chǎn)品中沉淀出來(lái)[43]，但由于含量較低，一般的分析方法較難完成，而且分析過(guò)程中需要溶解或消耗分離出的阿魏酸甘油酯，因此需要一種快速分析方法對(duì)通過(guò)生物反應(yīng)器合成從植物提取物中以毫克量或以克量分離的阿魏酸甘油酯，且不需要消耗樣品。

拉曼光譜(Raman spectroscopic)相對(duì)于核磁共振、液相色譜和其他基于光譜學(xué)的檢測(cè)方法，其優(yōu)勢(shì)是在時(shí)間上有所改進(jìn)，還可以解決以毫克或克為單位的反應(yīng)產(chǎn)物，且對(duì)粗產(chǎn)品樣品無(wú)損失；但由于其可用性、專業(yè)知識(shí)和成本等原因，阻礙其廣泛應(yīng)用。David等[44]報(bào)告了一種快速、方便地使用拉曼光譜來(lái)定性阿魏酸甘油酯的技術(shù)。峰強(qiáng)度的比例性為物質(zhì)的鑒定提供了一種額外的手段，且阿魏酸甘油酯的拉曼光譜在其峰之間具有唯一的比例性，這有助于鑒定；并選擇B3LYP密度泛函計(jì)算作為理論參考，因?yàn)樗晒Φ孛枋隽祟愃品肿拥姆肿觾?nèi)相互作用、幾何結(jié)構(gòu)、紫外和拉曼光譜[45，46]。分析結(jié)果顯示(圖6)，二阿魏酸甘油酯在實(shí)驗(yàn)拉曼光譜中有4個(gè)峰，其強(qiáng)度從熒光中可以清楚地識(shí)別，分別在1 593 cm-1(1.0)、1 634 cm-1(0.94)、1 703 cm-1(0.47)和1 155 cm-1(0.71)處識(shí)別；對(duì)于阿魏酸單甘油酯，識(shí)別峰和比例強(qiáng)度分別為1 593 cm-1(1.0)、1 629 cm-1(0.74)、1 685 cm-1(0.74)和1 275 cm-1(0.82)，這些峰與密度泛函理論的計(jì)算結(jié)果一致。密度泛函理論計(jì)算的熒光光譜中強(qiáng)度最大的峰在1 637 cm-1，與熒光的芳香環(huán)的伸展有關(guān)，在1 668 cm-1和1 732 cm-1有兩個(gè)強(qiáng)度較低的突出峰；1 668 cm-1處的計(jì)算峰與阿魏酸甘油酯的烯烴雙鍵的拉伸有關(guān)，1 732 cm-1處的計(jì)算峰歸因于阿魏酸甘油酯的羰基的拉伸。盡管阿魏酸單甘油酯和二阿魏酸甘油酯具有相似的官能團(tuán)，并且對(duì)于具有最大強(qiáng)度的峰具有相似的拉曼位移，但是可以用相對(duì)強(qiáng)度來(lái)識(shí)別其他重要的拉曼峰，該相對(duì)強(qiáng)度可以在歸一化光譜中很好地將其區(qū)分。

圖6 阿魏酸單甘油酯和二阿魏酸甘油酯的實(shí)驗(yàn)拉曼光譜[44]

4 結(jié)語(yǔ)

目前，對(duì)于阿魏酸甘油酯的合成研究主要有兩大方向，一是在不同離子液體體系下，用酶或有機(jī)溶劑催化合成阿魏酸甘油酯；另一是在研究者開(kāi)發(fā)的生物反應(yīng)器中，通過(guò)減少反應(yīng)物甘油的用量來(lái)合成阿魏酸甘油酯。日前實(shí)驗(yàn)取得了一定的成果，解決了一些問(wèn)題，但仍然存在需要用到有機(jī)溶劑、離子液體價(jià)格過(guò)高、反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、產(chǎn)物難分離等缺陷，因此，設(shè)計(jì)一種既高效、綠色，又能使用快速分離技術(shù)使其分離的實(shí)驗(yàn)方案，是很有必要的，隨著各學(xué)科各領(lǐng)域的相互交叉，這一設(shè)想不難實(shí)現(xiàn)，也為工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。