余冰清，嚴(yán)漢池

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

1 CNGC 的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)研究

細(xì)胞信號傳導(dǎo)是一種可以響應(yīng)并適應(yīng)各種內(nèi)部及外部因素的進(jìn)化上的保守機(jī)制。環(huán)核苷酸門控離子通道（Cyclic nucleotide-gated ion channels，CNGC）是一類陽離子通道，它可以非選擇性地直接被環(huán)核苷酸（cAMP 和cGMP）這類細(xì)胞內(nèi)信使小分子活化［1］。

對于CNGC 通道的研究最早在動(dòng)物中進(jìn)行。但是，與哺乳動(dòng)物宿主中環(huán)狀核苷酸信號傳導(dǎo)的研究進(jìn)展相反，這一主題在植物中的研究還較少。植物中的CNGC 不僅能夠調(diào)節(jié)花粉的正常發(fā)育并且能維持體內(nèi)離子的穩(wěn)態(tài)，另外，在植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中也起重要作用［2］。在植物中，1998年在大麥（Hordeum vulgare）中篩選鈣調(diào)素（Calmod?ulin，CaM）結(jié)合伴侶時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)CNGC 基因。隨后，在其他植物中也鑒定出CNGC，例如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大 麥、水 稻［3］（Oryza sati?va）、玉米（Zea mays）等。對CNGC 家族的研究表明，植物CNGC 基因可能在功能上以群依賴的方式區(qū)分。例如，可以依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系將擬南芥CNGC家族分成5 個(gè)亞家族組（I、II、III、IVa 和IVb）。擬南芥CNGC 家族中包括20 個(gè)成員［4］，目前對于植物環(huán)核苷酸門控離子通道的研究已經(jīng)較為清晰地闡明其分子結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)它與Shaker 型鉀離子電壓門控離子通道的結(jié)構(gòu)相似［5］，其核心結(jié)構(gòu)包括6 個(gè)跨膜α 螺旋（S1-S6），并且在S5 和S6 的中間有孔狀結(jié)構(gòu)，即P loop，該區(qū)域是植物CNGC 區(qū)別于其他離子通道蛋白的重要標(biāo)志，因?yàn)槠溆绊戨x子的選擇性［6］。C末端具有環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域（Cyclic Nucleotide mo?nophosphates Binding Domain，CNBD）和鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)域（Calmodulin Binding Domain，CaMBD），CNBD由3 個(gè)α 螺旋（αA、αB、αC）和2 個(gè)β 折疊（β1 和β2）構(gòu)成，β1 和β2 構(gòu)成的片層結(jié)構(gòu)位于αA 和αB 中間，CaMBD結(jié)合Ca2+后可以反饋調(diào)節(jié)CNGC的通道活性，當(dāng)Ca2+濃度高時(shí)，Ca2+與CaM結(jié)合，CNGC通道關(guān)閉。

盡管有關(guān)CNGC 的報(bào)道較多，但由于大多數(shù)研究都集中在CNGC 的基因組表征、系統(tǒng)發(fā)育比較和潛在作用上，因此對其激活和功能機(jī)制的了解較少。動(dòng)物的環(huán)核苷酸結(jié)合域位于肽鏈的C 端，鈣調(diào)蛋白結(jié)合域位于N 端；許多研究證明了植物的CaMBD 和CNBD 都位于C 末端［6］（圖1）。序列比較分析結(jié)果顯示，植物的CaM 結(jié)合域和CNBD 結(jié)合域有部分重疊。Arazi 等［7］利用生物化學(xué)手段研究了煙草（Nicotiana tabacum）的CNGC 與模式植物擬南芥的CNGC，比較準(zhǔn)確地詮釋了環(huán)核苷酸結(jié)合域（CNBD）與鈣調(diào)蛋白結(jié)合域（CaMBD）相重疊的論斷。也就是說，植物CNGC 與動(dòng)物之間的主要區(qū)別在于植物CNGC 中包含了重疊的鈣調(diào)蛋白結(jié)合域（CaMBD）和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域（CNBD），該結(jié)構(gòu)上的區(qū)別表明，動(dòng)植物的CNGC 之間調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的機(jī)制和功能有所不同。然而近期有關(guān)多個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)正向和負(fù)向調(diào)節(jié)擬南芥CNGC12 的研究對于植物CNGC 調(diào)控模式產(chǎn)生了新的見解［8］，為CNGC 調(diào)控新模型的建立提供了新的可能性。

圖1 動(dòng)植物環(huán)核苷酸門控離子通道（CNGC）的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

2 CNGC 的調(diào)控因子——cNMP、Ca2+/CaM

CNGC 是一類陽離子通道，其特點(diǎn)在于具有不同程度的離子傳導(dǎo)選擇性，這些通道可以允許單價(jià)、二價(jià)陽離子的擴(kuò)散，而CNGC 的活性受兩個(gè)方面的調(diào)控，一方面受cGMP、cAMP 的調(diào)節(jié)，另一方面受CaM 與CNBD 的可逆結(jié)合調(diào)節(jié)，結(jié)合后蛋白的變構(gòu)導(dǎo)致通道的開放和閉合。

2.1 cNMP

環(huán)狀核苷酸（cNMP）是動(dòng)植物體內(nèi)非常重要的第二信使。cNMP 在調(diào)控離子動(dòng)態(tài)變化中起重要作用，環(huán)核苷酸通過與環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CNBD）結(jié)合來調(diào)節(jié)其開放?，F(xiàn)有的證據(jù)已經(jīng)表明，環(huán)狀核苷酸門控通道是植物細(xì)胞中主要的cNMP 效應(yīng)子。這些通道是重要的細(xì)胞開關(guān)，可將細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀核苷酸濃度的變化轉(zhuǎn)化為膜電位和離子濃度的變化。環(huán)狀核苷酸（cNMP），如3'，5'-環(huán)腺苷酸（cAMP）和3'，5'-環(huán)鳥苷酸（cGMP）與所有活生物體中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)［9］。

2.2 Ca2+/CaM

鈣調(diào)素（CaM）是細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號傳導(dǎo)途徑中的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它作為一種重要的鈣受體蛋白，可以通過與Ca2+結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一些鈣調(diào)結(jié)合蛋白（CaMBPs）的活性，介導(dǎo)調(diào)節(jié)通過Ca2+濃度變化引發(fā)的各種生理生化反應(yīng)。

在 調(diào) 控 方 面，Ca2+/CaM 結(jié) 合CNGCs 是CNGC 家族首次被鑒定出來的生物化學(xué)功能。目前的研究顯示，Ca2+/CaM 病原菌入侵細(xì)胞后會(huì)引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量增多，一方面激活下游Ca2+依賴型的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞一系列的相關(guān)生理過程；另一方面，被激活的CaM 能夠反饋抑制鈣信號。CNGC 之所以能夠被胞質(zhì)內(nèi)增多的Ca2+/CaM 抑制，可能是由于Ca2+/CaM 阻礙了環(huán)核苷酸激活CNGC，因?yàn)樵撔盘柤壜?lián)通過病原菌響應(yīng)。電生理學(xué)試驗(yàn)顯示，在施加CaM 拮抗劑后，持續(xù)的胞外刺激會(huì)導(dǎo)致Ca2+不斷內(nèi)流［10］。用CaM 拮抗劑處理植物細(xì)胞，在病原菌刺激下Ca2+含量依然會(huì)升高，也就是說Ca2+/CaM 對于CNGC 的反饋抑制可能阻礙了Ca2+的持續(xù)內(nèi)流，因此，其對于維持胞內(nèi)Ca2+含量穩(wěn)定具有重要作用［11］。

雖然，研究者已經(jīng)了解到CaM/Ca2+可以調(diào)控其活性，但是，與動(dòng)物相比，對其活性調(diào)控的具體機(jī)制還不了解。已有的鈣調(diào)蛋白與擬南芥環(huán)核苷酸門控離子通道的結(jié)合的研究顯示，CaM 與其動(dòng)物中的對應(yīng)部分相似，對植物的CNGC 具有負(fù)調(diào)控作用。另一方面，CaM 結(jié)合親和力的改變會(huì)導(dǎo)致CNGC 調(diào)控情況的復(fù)雜變化。

2.3 動(dòng)植物CNGC 活性受cNMP 和CaM 調(diào)控

動(dòng)物CNGC 主要分布于化學(xué)感受器和光感受器中，在轉(zhuǎn)換膜外信號中起作用。在嗅覺和視覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，CNGC 通道通過cAMP 或cGMP 調(diào)節(jié)通道活性，引起Na+流入，從而介導(dǎo)嗅覺神經(jīng)元的嗅覺轉(zhuǎn)換以及桿狀細(xì)胞中光感受器的光轉(zhuǎn)換［12］。而植物CNGC 被激活的方式有2 種，除了被直接激活外，也可以通過與環(huán)核苷酸（cAMP/cGMP）可逆性結(jié)合的方式被激活，但其門控作用主要依賴于cAMP 和cGMP 的存在［13］，同時(shí)受Ca2+調(diào)控。環(huán)核苷酸信號的產(chǎn)生和消退取決于腺嘌呤環(huán)化酶和鳥嘌呤環(huán)化酶，以及可以將環(huán)狀核苷酸水解成ATP 和GTP 的磷酸二酯酶［14］。當(dāng)環(huán)狀核苷酸與通道蛋白結(jié)合時(shí)，它會(huì)誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象的變化，導(dǎo)致P 區(qū)域的旋轉(zhuǎn)，然后通道大門打開，從而促使陽離子跨膜移動(dòng)［15］。

如上所述，CaMBD 位于與CNBD 的C 末端α-螺旋重疊的部位。CaMBD 具有4 個(gè)氨基酸殘基，為Trp-Arg-Thr-Trp（WRTW），是CaM 結(jié)合所必需的。CaMBD 在CNBD 內(nèi)的位置允許CaM 與cNMP 作為通道電導(dǎo)的變構(gòu)門控中的配體競爭。最近，在模式植物AtCNGC20 中發(fā)現(xiàn)通過獨(dú)特的異亮氨酸-谷氨酰胺（IQ）CaM 結(jié)合基序與CaM 結(jié)合，該基序與CNBD中的α-螺旋相鄰但不重疊［8］。一些番茄和擬南芥CNGC 家族的域組織分析試驗(yàn)也證明了一些成員是含有IQ CaM 結(jié)合基序的，該結(jié)果首次讓人們意識到植物CNGC 可能含有2 個(gè)替代的CaM 結(jié)合基序（CaMBD 和IQ CaM 結(jié)合基序）。除此之外，分析結(jié)果還顯示，它類似于動(dòng)植物中的電壓依賴性Ca2+通道，表明通過CaM 對植物CNGC 的配體調(diào)控可能比以往預(yù)期的更加復(fù)雜，因?yàn)樯鲜? 個(gè)結(jié)構(gòu)域（CaMBD和IQ）具有不同的功能，具體調(diào)控模式還需進(jìn)一步研究分析。

3 CaM 對CNGC 調(diào)節(jié)的復(fù)雜模式

迄今為止研究的所有植物和動(dòng)物CNGC 具有至少1 個(gè)鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究表明，動(dòng)植物CNGC 的N 端和C 端都延伸至細(xì)胞質(zhì)中，除了CaMBD 的位置不同外，其他基本相同，其中CNBD在多肽的C 末端，由3 個(gè)α 螺旋（αA、αB、αC）和2 個(gè)β 折疊（β1 和β2）構(gòu)成，由β1 和β2 組成的片層結(jié)構(gòu)位于αA 和αB 之間。動(dòng)物CNGC 的CaMBD 位于肽鏈的N 末端的上游，但植物中CaMBD 位置與動(dòng)物不同，它位于多肽的C 末端，即CNBD 截短的αC 螺旋的起點(diǎn)處。因此，由于植物CNBD 是重疊的結(jié)合域，它既參與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合，又參與環(huán)核苷酸的結(jié)合。

3.1 動(dòng)物CNGC 的變構(gòu)調(diào)節(jié)模式

首先，對于動(dòng)物中cNMP 對CNGC 的調(diào)節(jié)，響應(yīng)激活胞內(nèi)嘌呤核苷酸環(huán)化酶（NCs）的細(xì)胞外信號合成cNMP，它們分別由腺苷三磷酸腺苷（ATP）和鳥苷三磷酸鳥苷（GTP）催化cAMP 和cGMP 合成。細(xì)胞內(nèi)cNMP 的濃度受磷酸二酯酶（PDEs）調(diào)節(jié)，磷酸二酯酶進(jìn)而將cAMP 和cGMP 代謝為無活性的核苷酸單磷酸［16］。cNMP 結(jié)合并激活環(huán)狀核苷酸結(jié)合蛋白（CNBP），包括依賴于cAMP 和cGMP 的蛋白激酶（PKA 和PKG），這被認(rèn)為是動(dòng)物中環(huán)狀核苷酸信號傳導(dǎo)的主要作用因子。通過環(huán)狀核苷酸來激活在動(dòng)物各種生理過程中起基本作用的通道，其中包括環(huán)狀核苷酸門控通道（CNGC）［17］。具體調(diào)控過程如下：氣味分子與化學(xué)感受器中的G 蛋白耦聯(lián)型受體可以通過結(jié)合進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，打開cAMP 門控陽離子通道（cAMP-gated cation channel），并引起Na+內(nèi)流，膜去極化，從而產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，最終形成嗅覺或味覺。

哺乳動(dòng)物CNGC 變構(gòu)調(diào)節(jié)的機(jī)制被充分表征，其中環(huán)核苷酸單磷酸酯cAMP 和cGMP 與C 端CNBD的結(jié)合提供了通道傳導(dǎo)的門控機(jī)制［18］，而哺乳動(dòng)物CNGC 功能的變構(gòu)抑制又由CaM 結(jié)合調(diào)節(jié)，這降低了通道對cAMP/cGMP 的親和力［19］。哺乳動(dòng)物CNGC具有多種CaM 結(jié)合位點(diǎn)，目前在6 種不同CNGC 同種型的N 末端及C 末端均已發(fā)現(xiàn)至少9 種CaMBD，然而，到目前為止，試驗(yàn)只提供了N 端CaMBD 的功能作用的證據(jù)。通常，CaM 是在升高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平下，在CNGCs 的反饋調(diào)節(jié)中通過結(jié)合到1 個(gè)或多個(gè)CaMBD，從而變構(gòu)性抑制CNGC 電導(dǎo)［20］。

3.2 鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控植物CNGC 的復(fù)雜模式

植物中的CNGC 是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)（Signal transduction cascades）的組成部分。通過這種級聯(lián)反應(yīng)，它們將細(xì)胞外部信號轉(zhuǎn)換成可以穿過細(xì)胞膜并作用于細(xì)胞的陽離子流［12］。如前文所述，植物CNGC 能夠直接被激活，還受cAMP/cGMP 以及Ca2+調(diào)控。

cAMP/cGMP 分別通過跨膜（tmAC）或可溶性（sAC）腺苷酸環(huán)化酶/跨膜（tmGC）或可溶性（sGC）胍基環(huán)化酶合成。它們都被磷酸二酯酶（PDE）水解成無活性的AMP 和GMP。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)際研究發(fā)現(xiàn)，CNGC 是植物細(xì)胞中cNMP 的主要靶標(biāo)。環(huán)狀核苷酸可以直接與環(huán)狀核苷酸結(jié)合域（CNBD）結(jié)合，以誘導(dǎo)蛋白的構(gòu)像變化，調(diào)節(jié)CNGC 孔的打開或關(guān)閉，并促進(jìn)陽離子跨膜移動(dòng)。

先前的研究假設(shè)CaMBD 允許CaM 作為配體與環(huán)狀核苷酸單磷酸在通道電導(dǎo)的變構(gòu)門控中競爭結(jié)合CNBD［21］。首次提出該區(qū)域時(shí)，它被視為植物CNGC 的惟一CaMBD，就是說，由于植物CNBD 是1個(gè)重疊的結(jié)合域，CaM 與植物CNGC 的結(jié)合會(huì)干擾CNGC 與環(huán)狀核苷酸的結(jié)合，競爭性的結(jié)合進(jìn)而影響通道的激活［7］，表明由CaM 調(diào)節(jié)的動(dòng)植物CNGC之間具有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。CaM、環(huán)核苷酸和Ca2+不僅各自都能與CNGC 相互作用，而且可以通過整合的方式控制離子通過植物離子通道。當(dāng)環(huán)核苷酸與CNGC 結(jié)合而被激活時(shí)，通道打開導(dǎo)致胞外Ca2+內(nèi)流。一方面，胞內(nèi)Ca2+的增加將導(dǎo)致Ca2+依賴蛋白激酶（CDPKs）的激活，進(jìn)而導(dǎo)致下游靶蛋白的磷酸化；另一方面，由Ca2+激活的鈣調(diào)蛋白將會(huì)與環(huán)核苷酸競爭性地結(jié)合CNGC，這就一定程度上阻止了環(huán)核苷酸與CNGC 結(jié)合，通道活性受到抑制，從而限制了Ca2+的進(jìn)一步內(nèi)流。

此前的研究均假設(shè)植物的CNGC 受Ca2+傳感器鈣調(diào)蛋白（CaM）負(fù)調(diào)控，并且先前的工作也都只集中在與植物CNGC 的CNBD 重疊的C 末端的CaMBD上。而近幾年研究發(fā)現(xiàn)，模式植物AtCNGC20 通過與αC-螺旋相鄰卻并不重疊的獨(dú)特異亮氨酸-谷氨酰胺（IQ）基序與CaM 結(jié)合［22］，表明植物CNGC，如哺乳動(dòng)物CNGC，可具有多種CaMBD。

3.3 動(dòng)植物CNGC 在鈣離子變構(gòu)調(diào)節(jié)上的異同

為了進(jìn)一步了解CNGCs 的調(diào)節(jié)和生理作用，DeFalco 等［8］對模式植物擬南芥CNGC12 的CaM 結(jié)合特性和功能進(jìn)行了全面的表征。擬南芥CNGC12的αC-螺旋區(qū)域具有低保守性，因此研究者認(rèn)為其無法結(jié)合CaM，然而，該研究證明這種同種型在其胞質(zhì)N 和C 末端都具有新的CaMBD，提供了單個(gè)植物CNGC 同種型具有多個(gè)CaMBD 的證據(jù)。表明擬南芥CNGC12 在其胞質(zhì)N 和C 末端含有多個(gè)CaMBD，包括NT、CT 和IQ（圖2）。在CNBD 之外的CNGC12的C 末端存在新的CaMBD（CT），該區(qū)域以前并未在任何植物CNGC 中表征過。先前已報(bào)道植物CNGC同種型中沒有N 末端CaMBD，然而在N 末端區(qū)域的覆蓋測定中也觀察到明顯的CaM 結(jié)合（NT）。由于其試驗(yàn)確定了CaM 與IQ 基序的結(jié)合是通道功能所必需的，不僅表明了CaM 可以正向和負(fù)向調(diào)節(jié)CNGC12，同時(shí)說明了CaM 對植物CNGC 調(diào)節(jié)模式較為復(fù)雜，它與先前提出的競爭性配體模型相反，這表明有可能植物和動(dòng)物CNGC 之間存在相似性。

圖2 模式植物擬南芥CNGC12 的CaMBD 位置（包括NT 和CT 位點(diǎn)的描述）

鑒于對其CaMBD 的生化和生理解剖，DeFalco等［8］提出了CaM 調(diào)節(jié)CNGC12 的模型。該模型假定CNGC12 通過IQ 基序以Ca2+獨(dú)立的方式進(jìn)行組成性調(diào)節(jié)，而Ca2+/CaM 可以順序結(jié)合多個(gè)CaMBD。該模型顯示CNGC12 直接介導(dǎo)Ca2+的內(nèi)流，但是不能排除CNGC12 信號觸發(fā)其他通道介導(dǎo)的Ca2+電流的可能性。該模型包含了一些推測性的特征，這些特征與目前的研究結(jié)果一致，但仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證，其中一些特征與各種動(dòng)物通道有明顯的相似性，例如CaM 介導(dǎo)的亞基間和亞基間相互作用的橋接以及CaM 在多個(gè)CaMBD 之間的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)［23］，類似的CaM 調(diào)節(jié)特征廣泛分布在各種動(dòng)物電壓或Ca2+門控的陽離子通道中，例如很多脊椎動(dòng)物的陽離子通道中就存在類似機(jī)制［24］。

結(jié)構(gòu)性、功能性、生理和電生理學(xué)研究的結(jié)合將有助于闡明Ca2+對CaM 介導(dǎo)的CNGC 調(diào)控的復(fù)雜模式?？紤]到CNGC 和CaM 在免疫中的重要作用［25］，進(jìn)一步表征CaM-CNGC 相互作用對于理解免疫應(yīng)答過程中CNGC 介導(dǎo)的Ca2+信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。

4 展望

環(huán)核苷酸門控通道作為植物細(xì)胞中環(huán)核苷酸的靶點(diǎn)，越來越受到人們的關(guān)注。尤其是近年來細(xì)胞斑塊鉗位、植物基因組測序以及基因組學(xué)方法的進(jìn)一步發(fā)展，促進(jìn)了CNGC 編碼基因的識別和調(diào)控等方面研究的進(jìn)展，為研究人員闡明通道的結(jié)構(gòu)與功能間的聯(lián)系提供了有效方法和技術(shù)支撐。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷的突變體的存在，使人們對CNGC 生理功能的認(rèn)識取得了迅速進(jìn)展。

幾乎所有的植物信號過程都有Ca2+的參與，然而至今為止，植物中只有為數(shù)不多的鈣離子通道家族被發(fā)現(xiàn)。另外，植物中的CNGC、GLR 等鈣通道最早是通過動(dòng)物中的同源蛋白進(jìn)行序列相似性比對而挖掘出來的。在對CNGC 進(jìn)行研究時(shí)，如果能考慮動(dòng)植物間的相似點(diǎn)和區(qū)別，將對闡明植物CNGCs 功能及其調(diào)控機(jī)理有很大的幫助。所以探究CNGCs相應(yīng)的配體、門控分子和活性調(diào)節(jié)機(jī)制是今后研究的一個(gè)重要目標(biāo)。

總而言之，要完全理解CNGC 的功能，還需要采取多種研究手段。結(jié)合更多的結(jié)構(gòu)功能、生理和電生理研究將有助于闡明Ca2+/CaM 介導(dǎo)的CNGC 調(diào)控的復(fù)雜模式。將鈣信號整合到植物中更大的信號網(wǎng)絡(luò)中的研究應(yīng)該得到更多的關(guān)注。