胡珊群 梁汝黛 李彤 王晨 劉長(zhǎng)利

摘? ? 要：近年來(lái)，隨著我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)的持續(xù)發(fā)展，藥用植物次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用途徑逐漸增多，藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值逐年上升，其市場(chǎng)需求量也持續(xù)增長(zhǎng)，而藥用植物野生資源蘊(yùn)藏量下降、生態(tài)環(huán)境破壞等問(wèn)題使得藥用植物面臨著嚴(yán)重的市場(chǎng)供需矛盾。藥用植物人工栽培面臨著栽培困難、品種退化、成本高昂等難題。采用植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可快速獲得成熟的植物細(xì)胞、積累植物中的活性成分，為獲得藥用植物資源開(kāi)辟了新途徑。簡(jiǎn)要介紹了懸浮細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件和方法、大規(guī)模生產(chǎn)懸浮細(xì)胞的研究以及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的前景。

關(guān)鍵詞：藥用植物;懸浮細(xì)胞;培養(yǎng)條件;植物生長(zhǎng)物質(zhì);誘導(dǎo)子

文章編號(hào)：1005-2690（2021）18-0007-06? ? ? ?中國(guó)圖書分類號(hào)：S567? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

藥用植物的次生代謝產(chǎn)物有極高的藥用價(jià)值，比如柴胡皂苷可抗病毒、甘草甜素有免疫調(diào)節(jié)作用[1]。此類化合物除藥用外也可作為良好的保健品、農(nóng)藥及化妝品原料，需求量與日俱增。而人工栽培藥用植物對(duì)種子、土壤、氣候等條件要求較高，栽培過(guò)程中易感染病害、栽培時(shí)間長(zhǎng)、管理成本高等問(wèn)題都使藥用植物次生代謝產(chǎn)物供需關(guān)系緊張。

植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一種快速獲得成熟植物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物的新技術(shù)，運(yùn)用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可以大量生產(chǎn)藥效成分[2]。目前已運(yùn)用懸浮細(xì)胞技術(shù)成功獲得包括人參、甘草、厚樸[3-5]等大宗藥材的次生代謝產(chǎn)物。植物懸浮細(xì)胞不僅可用于生產(chǎn)藥用活性物質(zhì)，還能用于遺傳多樣性分析、研究轉(zhuǎn)基因植物和探究代謝產(chǎn)物生物合成路徑等方面[6]。目前已有200余種植物進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，中國(guó)、日本、德國(guó)已成功進(jìn)行人參、紫草等植物的大規(guī)模生產(chǎn)，能夠滿足人參、皂苷等植物次生代謝產(chǎn)物的市場(chǎng)需求[7]。

植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可在人工精確設(shè)計(jì)下獲得藥用植物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物，不僅能緩解藥用植物資源緊缺的問(wèn)題，還能減少對(duì)土地資源的占用，是獲取藥用活性成分、保護(hù)藥用植物資源的重要手段。盡管國(guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的初步嘗試，但是此技術(shù)還需要不斷優(yōu)化和改進(jìn)。本文將對(duì)懸浮細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件和方法、大規(guī)模生產(chǎn)懸浮細(xì)胞的研究以及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的前景進(jìn)行綜述。

1? ?懸浮細(xì)胞制備

獲得植物懸浮細(xì)胞的操作流程如圖1所示，建立良好的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系受多方面因素影響，確定各因素的最佳條件是成功建立及優(yōu)化懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵。

懸浮細(xì)胞的制備是建立良好的懸浮細(xì)胞體系的基礎(chǔ)，制備流程主要包括選擇外植體、選擇最佳誘導(dǎo)愈傷部位、選擇最佳愈傷狀態(tài)、懸浮細(xì)胞的篩選和繼代4個(gè)方面。

外植體的選擇能夠影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，適宜的外植體可誘導(dǎo)出胚性愈傷率和再生率較高的體系，更容易建立起高頻再生的懸浮細(xì)胞系[8-18]。部分植物的最佳外植體誘導(dǎo)部位見(jiàn)表1，說(shuō)明不同的植物對(duì)誘導(dǎo)部位的選擇差異較大。

而同一植物的不同部位所誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)也不同，祖恩凡等[19]研究發(fā)現(xiàn)金銀花的嫩莖能誘導(dǎo)出活力最佳的愈傷組織，因此選擇合適的外植體部位才能誘導(dǎo)出生長(zhǎng)良好的愈傷組織，從而構(gòu)建良好的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系。

試驗(yàn)所得的愈傷組織通常有3種類型：Ⅰ型為質(zhì)地堅(jiān)硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織;Ⅱ型為質(zhì)地疏松、易分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織，外觀往往呈現(xiàn)淡黃綠色;Ⅲ型為柔軟、水漬、形狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷組織。懸浮細(xì)胞系的建立通常選擇Ⅱ型愈傷組織作為建立懸浮細(xì)胞系的材料。在培養(yǎng)朱砂根、印楝、何首烏、油棕、相思樹(shù)等[20-24]植物的懸浮細(xì)胞時(shí)，均使用到質(zhì)地疏松、分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織進(jìn)行懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。愈傷組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)隨著繼代次數(shù)的增加逐漸變得疏松，且細(xì)胞體積增大，畸形細(xì)胞明顯增加。這表明，愈傷組織中的細(xì)胞逐漸由胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化為非胚性愈傷組織。張靜等人對(duì)山西野葛懸浮細(xì)胞的研究顯示，選用繼代第三次的愈傷組織進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的野葛[25-26]總黃酮含量最高。

為得到均一性、分散性良好且生長(zhǎng)旺盛的懸浮細(xì)胞系，在繼代時(shí)需對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到均一性、良好的細(xì)胞系。目前主要操作的方法有小細(xì)胞團(tuán)篩選法、直接傾倒法和移液管接種法[27]。小細(xì)胞團(tuán)篩選法指用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)[28]篩選細(xì)胞團(tuán)，收集小細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在對(duì)刺山柑[29]研究中發(fā)現(xiàn)，隨細(xì)胞團(tuán)直徑增加，細(xì)胞中總黃酮含量下降[30-31]。

懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線為S型，分為延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期及衰亡期4個(gè)階段。3種植物的生長(zhǎng)周期見(jiàn)表2，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，由于培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，細(xì)胞開(kāi)始代謝積累有害物質(zhì)，使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。不同植物的懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期不同，但繼代培養(yǎng)都應(yīng)選擇在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的末期或穩(wěn)定期進(jìn)行。

2? ?培養(yǎng)條件

對(duì)懸浮細(xì)胞中次生代謝物的產(chǎn)生影響較大的是懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)條件，主要包括兩個(gè)方面，一個(gè)是培養(yǎng)基的選擇，另一個(gè)是外部條件的控制，包括pH值、溶氧水平等。

2.1? ?培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基成分主要包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、大量元素、植物生長(zhǎng)物質(zhì)、前體物質(zhì)和誘導(dǎo)子。目前，建立或優(yōu)化植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系時(shí)，多就植物生長(zhǎng)物質(zhì)和誘導(dǎo)子的種類和濃度進(jìn)行研究。

常見(jiàn)的培養(yǎng)基種類有B5、MS、White、N6等，郭紫娟[32]發(fā)現(xiàn)，三七的懸浮細(xì)胞細(xì)胞干重增長(zhǎng)量在B5培養(yǎng)基中比在MS培養(yǎng)基中高1.25 g/L。因此選擇合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有助于提高次生代謝產(chǎn)物的含量。植物培養(yǎng)基中的大量元素包括碳、氮、磷等，碳源是植物細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源。氮源在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中主要用于合成蛋白質(zhì)與核酸等細(xì)胞物質(zhì)。磷是組成生物遺傳因子與諸多代謝相關(guān)輔酶的重要元素。為更好地促進(jìn)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，應(yīng)當(dāng)注意大量元素的使用濃度。蔗糖不僅是培養(yǎng)液中碳源的主要來(lái)源，還能夠維持培養(yǎng)基滲透壓。糖的濃度過(guò)高易導(dǎo)致細(xì)胞失水，產(chǎn)生褐化反應(yīng)[33]。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中蔗糖的濃度在28 g/L時(shí)，三七幼葉的懸浮細(xì)胞干重增長(zhǎng)量達(dá)到最高[34]。

常用的植物生長(zhǎng)物質(zhì)有6-苯甲基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA），萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D），激動(dòng)素（Kinetin，KT）等，選用不同的生長(zhǎng)物質(zhì)，對(duì)懸浮細(xì)胞影響不同。在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D時(shí)，白木香懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況最好，而添加NAA的培養(yǎng)基中，白木香的懸浮細(xì)胞出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，細(xì)胞鮮重出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)[35]。此外，同一生長(zhǎng)物質(zhì)的不同濃度對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)也有影響，如紫蘇懸浮細(xì)胞的干重及迷迭香酸的含量隨6-BA的使用濃度先增加后減少[36]。目前研究發(fā)現(xiàn)，植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響有以下兩種情況：①低濃度促進(jìn)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，高濃度抑制懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。②在各個(gè)濃度下均抑制懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。值得注意的是，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有一定毒性。NAA能夠抑制小鼠肝細(xì)胞增殖并促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，使小鼠體重減輕[37]。2，4-D是一種常用的除草劑，能降低小鼠精子質(zhì)量，引起生殖毒性損傷[38]。因此在提取懸浮細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物時(shí)，必須洗凈懸浮細(xì)胞上的液體培養(yǎng)基。在篩選植物生長(zhǎng)物質(zhì)的使用濃度時(shí)，可進(jìn)行正交試驗(yàn)，這樣在降低試驗(yàn)成本的同時(shí)可研究各激素之間的協(xié)同或拮抗作用。

誘導(dǎo)子可以促使植物抗毒素信號(hào)形成，將誘導(dǎo)子應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)可提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的含量，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。誘導(dǎo)子主要分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。常見(jiàn)的非生物誘導(dǎo)子[39-45]有茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）、重金屬鹽、稀土元素等，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)MeJA和SA的研究比較多。段永波等研究發(fā)現(xiàn)蜀葵的懸浮細(xì)胞內(nèi)總黃酮的含量隨MeJA使用濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。MeJA和SA處理均能顯著促進(jìn)生物堿在半夏懸浮細(xì)胞中的累積，150 μmol/L的MeJA和50 μmol/L的SA分別處理可以使半夏生物堿含量為對(duì)照組的3.6倍和2.5倍。適當(dāng)濃度的金屬離子可激活一些次生代謝過(guò)程中相關(guān)酶的活性，增加植物次生代謝產(chǎn)物的積累。范寰等人在培養(yǎng)長(zhǎng)春花的懸浮細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入低濃度的Ce4+可增加細(xì)胞H2O2的產(chǎn)生和長(zhǎng)春質(zhì)堿的合成，此作用可能是通過(guò)激活長(zhǎng)春花中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。生物誘導(dǎo)子包括真菌、細(xì)菌、病毒等，目前對(duì)植物內(nèi)生真菌的研究較多。內(nèi)生真菌可能是道地藥材形成的原因之一，內(nèi)生真菌可能通過(guò)參與細(xì)胞代謝途徑調(diào)節(jié)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)。在對(duì)宜賓當(dāng)?shù)赜驼翍腋〖?xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)生真菌可通過(guò)影響H2O2通路來(lái)調(diào)節(jié)揮發(fā)油的代謝，在添加40 mg/L內(nèi)生真菌后，懸浮細(xì)胞中揮發(fā)油的含量約為對(duì)照組的2.0倍。

前體物質(zhì)[46-48]是合成次生代謝產(chǎn)物的前提條件，在植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入不同種類、濃度的前體物質(zhì)，會(huì)對(duì)目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)生不同的影響。紫杉醇合成的前體物質(zhì)苯丙氨酸、苯甲酸鈉及乙酸鈉對(duì)紅豆杉懸浮細(xì)胞的紫杉醇產(chǎn)量有顯著影響。當(dāng)在培養(yǎng)基中分別加入15 mg/L苯丙氨酸及30 mg/L苯甲酸鈉時(shí)，紅豆杉懸浮細(xì)胞中的紫杉醇產(chǎn)量分別提高了21.76%和26.14%。

2.2? ?外部條件的控制

制備生長(zhǎng)狀態(tài)良好的懸浮細(xì)胞，選擇最適培養(yǎng)基是進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的重要準(zhǔn)備工作，而控制合適的外部條件也是懸浮細(xì)胞長(zhǎng)期生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累的必要條件。外部條件主要包括培養(yǎng)液的pH值和溶氧水平、溫度及光照條件。

一般藥用植物細(xì)胞生長(zhǎng)最適pH值范圍為5.8～6.0。培養(yǎng)基的pH值對(duì)懸浮細(xì)胞的影響很大，過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境都會(huì)加劇懸浮細(xì)胞的褐化甚至引起懸浮細(xì)胞死亡，因此在配制懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)其酸堿度，使其適合懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)。劍麻及南方紅豆杉[49-50]懸浮細(xì)胞在pH值為5.8時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好。也有一些細(xì)胞的最適pH值偏大，Malik等[51]研究發(fā)現(xiàn)，適合紫草細(xì)胞生長(zhǎng)及紫草寧衍生物形成的pH值為7.25～9.50。除了pH值之外，培養(yǎng)液的溶氧量也影響懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)。在培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時(shí)，通常通過(guò)改變搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)液體積調(diào)節(jié)溶氧量。液體培養(yǎng)基的溶氧量和細(xì)胞分散度與轉(zhuǎn)速呈正相關(guān)，最適的轉(zhuǎn)速在100～150 r/min范圍內(nèi)。徐薯[52-53]的懸浮細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)速敏感，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，徐薯懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度最快。適宜的裝液量有利于在離心力的作用下使懸浮細(xì)胞分散，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，能夠?yàn)閼腋〖?xì)胞提供足夠的生長(zhǎng)空間和溶氧量。程玉鵬等[54]在建立柴胡懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，固定接種量（2 g）和培養(yǎng)瓶容積（250 mL），將培養(yǎng)基體積從50 mL逐步增加至100 mL時(shí)，細(xì)胞增重量明顯增加，若持續(xù)增加培養(yǎng)基體積，細(xì)胞增重量則明顯下降;當(dāng)固定轉(zhuǎn)速，愈傷組織接種量在2.0 g，培養(yǎng)液體積占容器的2/5時(shí)，細(xì)胞鮮重增至最大。

培養(yǎng)植物懸浮細(xì)胞時(shí)，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的最佳溫度為20～28 ℃。當(dāng)培養(yǎng)溫度與植物細(xì)胞正常生長(zhǎng)所要求的溫度相差很大時(shí)，可引起某些應(yīng)激效應(yīng)，或?qū)Υ渭?jí)代謝產(chǎn)物積累產(chǎn)生激活作用。不同植物對(duì)溫度的需求不同，部分植物懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)所需的最佳溫度和懸浮細(xì)胞代謝所需的最佳溫度不同，是因?yàn)闇囟葘?duì)植物細(xì)胞生物合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)節(jié)物質(zhì)有影響。對(duì)葡萄懸浮細(xì)胞[55]的研究表明，在38 ℃時(shí)，葡萄懸浮細(xì)胞中褪黑素生物合成的相關(guān)基因色氨酸脫羧酶（Tryptophan decarboxylase，TDC），血清素N-乙?；D(zhuǎn)移酶（Serotonin N-acetyltransferase，SNAT）和N-乙?；?5-羥基色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶（N-acetyl-5-hydroxytryptamine-methyl transferase，ASMT）的表達(dá)量有明顯上調(diào)。牛曉娟等[56]研究不同溫度對(duì)石斛懸浮細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)在31 ℃條件下培養(yǎng)的石斛懸浮細(xì)胞的增殖系數(shù)最小;而當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，石斛懸浮細(xì)胞的增殖系數(shù)增大。除溫度外，藥用植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)光照時(shí)間[57]的長(zhǎng)短、光質(zhì)和光的強(qiáng)度來(lái)增加次生代謝產(chǎn)物的積累。在光照時(shí)間12 h/d、光照1 200 lx時(shí)，仙茅懸浮細(xì)胞干重和仙茅苷含量均處于較高水平，分別是黑暗組的1.85倍和2.18倍。光照對(duì)懸浮細(xì)胞的影響可能與光信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子引起的基因調(diào)控有關(guān)。李漢生等[58]的研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光照射培養(yǎng)的龍眼懸浮細(xì)胞比黑暗培養(yǎng)的龍眼懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝更加旺盛，藍(lán)光照射組干重比黑暗組多0.28 g/L，比類黃酮含量多0.77 mg/g。光照對(duì)懸浮細(xì)胞的影響也可能與植物本身的習(xí)性有關(guān)，因此在進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)可與原植物對(duì)光照的需求進(jìn)行對(duì)比，以得到最適合懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的光照條件。

3? ?大規(guī)模生產(chǎn)懸浮細(xì)胞

為實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)，需選用合適的生物反應(yīng)器，以便于控制物理和化學(xué)條件。目前常用的生物反應(yīng)器類型及其性能對(duì)比如表3所示[59-61]。工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)在選用生物反應(yīng)器的類型時(shí)，需綜合考慮剪切力、混合能力及溶氧能力，剪切力過(guò)大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞褐化甚至死亡;混合能力不足則營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能均勻分布、懸浮細(xì)胞分散性差;溶氧能力差則細(xì)胞不能與氧氣充分接觸，細(xì)胞生長(zhǎng)受限。

4? ?討論與展望

植物離體培養(yǎng)技術(shù)除細(xì)胞懸浮培養(yǎng)外還有愈傷組織培養(yǎng)、不定芽、毛狀根培養(yǎng)等。相較于愈傷組織，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)使細(xì)胞能夠與培養(yǎng)基充分接觸，避免有毒物質(zhì)在局部大量聚集而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)搖培使空氣進(jìn)入培養(yǎng)基，使細(xì)胞更容易生長(zhǎng)。與不定芽、毛狀根的培養(yǎng)相比，懸浮細(xì)胞的制備則更加簡(jiǎn)便。以快速、大量獲取植物活性成分為目的時(shí)，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有較大的優(yōu)勢(shì)。目前這項(xiàng)技術(shù)為基因工程在植物細(xì)胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化形成植株，即可獲得攜帶有目標(biāo)基因的個(gè)體。

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)存在比較大的問(wèn)題是褐化反應(yīng)，褐化反應(yīng)使細(xì)胞破損，次生代謝產(chǎn)物減少，主要發(fā)生在懸浮培養(yǎng)初期。王佳琦等的研究顯示，甘草細(xì)胞的褐化主要由酶促反應(yīng)引起，其主要機(jī)理是植物細(xì)胞從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基產(chǎn)生機(jī)械損傷，使細(xì)胞內(nèi)多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性增加，細(xì)胞內(nèi)外酚類化合物含量增多，發(fā)生氧化反應(yīng)生成棕色醌類化合物。褐化過(guò)程主要受培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)速及滲透壓影響，細(xì)胞褐化的程度與轉(zhuǎn)速正相關(guān)，當(dāng)培養(yǎng)基中不含蔗糖時(shí)，細(xì)胞不發(fā)生褐化反應(yīng)，但生長(zhǎng)緩慢，因此在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可考慮梯度增加蔗糖的濃度和轉(zhuǎn)速，以避免培養(yǎng)初期的褐化。工業(yè)大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)也可適當(dāng)添加防褐化劑，避免褐化反應(yīng)。

工業(yè)化培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時(shí)還可以用兩步培養(yǎng)法：將懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)分為兩個(gè)階段，第一階段初期在適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮細(xì)胞避免褐化反應(yīng)，第二階段將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至能夠促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物生成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這樣能夠有效提高懸浮細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物含量[62-63]。

目前建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的技術(shù)已經(jīng)非常成熟，對(duì)懸浮細(xì)胞的研究可將重點(diǎn)放在以下3個(gè)方面。

（1）工業(yè)化生產(chǎn)方面，優(yōu)化培養(yǎng)體系，提高次生代謝產(chǎn)物合成量，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，以此緩解藥用植物資源緊缺的問(wèn)題。

（2）代謝途徑研究方面，以懸浮細(xì)胞為基礎(chǔ)研究材料，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞系，再經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成植株，研究植物細(xì)胞代謝途徑上相關(guān)關(guān)鍵酶基因和轉(zhuǎn)錄因子的功能。

（3）優(yōu)選作物和資源保護(hù)方面，懸浮細(xì)胞可通過(guò)激素誘導(dǎo)培養(yǎng)成人工種子，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的研究，篩選出具有抗干旱、抗鹽、可大量繁殖的植物品種，瀕危植物也可以通過(guò)建立其懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行品種保存。

總而言之，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物生產(chǎn)研究中的應(yīng)用，一方面可以緩解目前藥材資源緊張的情況，另一方面也為藥用植物的代謝途徑研究提供了基礎(chǔ)，最重要的是，利用懸浮細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行組織培養(yǎng)有利于作物優(yōu)選和資源保護(hù)。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 姜雪，孫森鳳，王悅，等.甘草藥理作用研究進(jìn)展[J].化工時(shí)刊，2017，31（7）：25-28.

[ 2 ] 董燕，刁玲武，周聯(lián).藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響因素[J].中醫(yī)藥信息，2011，28（3）：36-40.

[ 3 ] 黃景嘉，羅眺，湯欽，等.藥用植物人參愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)與懸浮細(xì)胞體系建立[J].生命科學(xué)研究，2014，18（2）：121-123.

[ 4 ] 李雅麗，孟婷婷，王毛毛，等.甘草細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的放大培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)報(bào)，2015，51（3）：302-306.

[ 5 ] 陳慧麗. 厚樸細(xì)胞培養(yǎng)與超低溫保存的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[ 6 ] 王娟，李金鑫，李建麗，等.植物組織培養(yǎng)技術(shù)在中藥資源中的應(yīng)用[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（12）：2236-2246.

[ 7 ] 王沐蘭，楊生超，郁步竹，等.紅豆杉高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系建立及其紫杉醇誘導(dǎo)的研究進(jìn)展[J].廣西植物，2016，36（9）：1137-1146.

[ 8 ] 李鑫，李炎林，李清明，等.塊根塊莖類植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用[J].現(xiàn)代園藝，2017（19）：70-73.

[ 9 ] 王超，姚晨輝，朱林琳，等.桑樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)及懸浮細(xì)胞系的建立[J].蠶業(yè)科學(xué)，2016，42（1）：23-29.

[ 10 ] 龍炎杏，張學(xué)文，羅莎，等.黃花蒿懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，44（6）：607-612.

[ 11 ] 劉薇，栗茂騰，朱玉梅，等.藥用植物刺山柑懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集體理化性質(zhì)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008（21）：19-22.

[ 12 ] 李金亭，郭曉雙，王召陽(yáng)，等.懷牛膝懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)研究[J].北方園藝，2016（5）：132-136.

[ 13 ] 馬麗娜. 新塔花的快速繁殖與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立[D].烏魯木齊：新疆大學(xué)，2019.

[ 14 ] 郭佳祺. 蒺藜懸浮培養(yǎng)體系建立及不同因子對(duì)黃酮醇含量影響[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[ 15 ] 方芳，戴傳超，張波，等.茅蒼術(shù)懸浮細(xì)胞系建立及內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)其揮發(fā)油積累的影響[J].中草藥，2009，40（3）：452-455.

[ 16 ] 姚喜紅，魏臻武，耿小麗.苜?；ㄋ帒腋∨囵B(yǎng)體系的建立及其影響因素[J].草地學(xué)報(bào)，2010，18（3）：358-364.

[ 17 ] 張玉瓊，陳娜，周建輝，等.石蒜懸浮細(xì)胞系的建立及其生物堿累積的研究[J].中草藥，2013，44（24）：3540-3545.

[ 18 ] 戴傳超，余伯陽(yáng)，薛菲，等.藥用植物大戟懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005（2）：57-60.

[ 19 ] 祖恩凡，趙晨晨，張凌霄，等.金銀花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立研究[J].現(xiàn)代園藝，2019（6）：5-6.

[ 20 ] 鄧素芳，楊旸，賴鐘雄.朱砂根愈傷組織培養(yǎng)及懸浮細(xì)胞系建立[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2012，20（1）：33-38.

[ 21 ] 韓廣建，李興林，別振宇，等.氮素對(duì)印楝愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，30（4）：25-29.

[ 22 ] 邵利. 何首烏懸浮細(xì)胞系的建立和穩(wěn)定同位素示蹤研究二苯乙烯苷合成路徑[D].廣州：華南理工大學(xué)，2012.

[ 23 ] 潘登浪，鄒積鑫，曾憲海，等. 油棕細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及植株再生技術(shù)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，46（2）：59-65，173.

[ 24 ] 林秀蓮，葉玲娟，林玉玲，等.相思樹(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及其細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（9）：1786-1793.

[ 25 ] 都曉龍，孫春玉，張美萍，等.繼代次數(shù)對(duì)吉粳88愈傷組織生理生化指標(biāo)及細(xì)胞形態(tài)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：155-158.

[ 26 ] 張靜. 山西野葛主要成分含量測(cè)定與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究[D].太原：山西大學(xué)，2015.

[ 27 ] 胡尚連，尹靜. 植物細(xì)胞工程[M].北京：科學(xué)出版社，2018.

[ 28 ] 羅月芳，唐婕妤，彭菲，等.益母草懸浮細(xì)胞系的建立及轉(zhuǎn)化外源氫醌生成熊果苷研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（2）：80-83.

[ 29 ] 王艷婷，甘露，劉薇，等.藥用植物刺山柑愈傷組織誘導(dǎo)及細(xì)胞生長(zhǎng)代謝特征研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007（12）：1779-1783.

[ 30 ] 劉思妤，楊悅，王鷹，等.北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)體系的建立及優(yōu)化[J].草業(yè)科學(xué)，2017，34（11）：2254-2260.

[ 31 ] 舒孝和，陳志.唐古特大黃細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中的生理生化特性[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（3）：84-88.

[ 32 ] 郭紫娟.白背三七懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立[J].農(nóng)技服務(wù)，2015，32（10）：90-92.

[ 33 ] 王佳琦，牛雯倩，李雅麗，等.甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)初期褐化發(fā)生的機(jī)理研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，48（1）：96-100，108.

[ 34 ] 李濤，李小清，張智慧，等.蔗糖濃度和外源2，4-D與KT濃度對(duì)三七幼葉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響的研究[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，36（4）：61-63.

[ 35 ] 吳燕燕，李明，馬婷玉，等.白木香懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究[J].中藥材，2018，41（5）：1044-1047.

[ 36 ] 李會(huì)珍，李娜，譚永蘭，等.紫蘇細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)迷迭香酸的條件優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，35（28）：32-37.

[ 37 ] 崔靜.萘乙酸對(duì)小鼠肝細(xì)胞增殖與凋亡的影響研究[D].青島：青島大學(xué)，2010.

[ 38 ] 蘇芳菲，胡夢(mèng)青，梅天資，等.2，4-D對(duì)小鼠精子毒性作用的研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，53（1）：13-15，37.

[ 39 ] 別振宇，李興林，汪珊英.誘導(dǎo)子對(duì)蜀葵懸浮細(xì)胞、不定根培養(yǎng)的影響[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，32（3）：23-28.

[ 40 ] 段永波，魯放，崔婷婷，等.非生物誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)半夏懸浮細(xì)胞中生物堿代謝的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2017，24（1）：87-90.

[ 41 ] 范寰.Ce4+對(duì)懸浮培養(yǎng)長(zhǎng)春花細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)作用的研究[D].天津：天津大學(xué)，2007.

[ 42 ] 曹蓉蓉，黨小琳，行冰玉，等.胞內(nèi)、外Ca2+在水楊酸誘導(dǎo)丹參幼苗迷迭香酸生物合成過(guò)程中的作用[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（20）：3424-3431.

[ 43 ] 李玉平，李惟雄.微量元素對(duì)大花金挖耳懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)與黃酮含量的影響及其化感作用[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，34（1）：1-8.

[ 44 ] YAN K，ZHENG Y，HU L.Effect of H2O2-Mediated endophytic fungal elicitors on essential oil accumulation in suspension Cells of Cinnamomum longepaniculatum[J].Open Access Library Journal，2020，7（1）：1-10.

[ 45 ] Man Yu，Jing-Chao Chen，Jin-Zhuo Qu，et al.Exposure to endophytic fungi quantitatively and compositionally alters anthocyanins in grape cells[J].Plant Physiology and Biochemistry，2020（149）：144-152.

[ 46 ] 羅月芳，江靈敏，譚朝陽(yáng).藥用植物離體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2018，16（6）：787-793.

[ 47 ] O.Parra，A.M.Gallego，A.Urrea，et al.Biochemical precursor effects on the fatty acid production in cell suspension cultures? of Theobroma cacao L.[J].Plant Physiology and Biochemistry，2017（111）：59-66.

[ 48 ] 茍莉.前體及誘導(dǎo)子和發(fā)酵條件對(duì)TMS-26產(chǎn)紫杉醇發(fā)酵體系優(yōu)化[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[ 49 ] 吳良，張世清，陳河龍，等.劍麻懸浮細(xì)胞體系的建立[J].分子植物育種，2019，17（6）：1978-1983.

[ 50 ] 徐志榮，王婷，婁佳蘭，等.南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2019，32（1）：8-14.

[ 51 ] Malik Sonia， Bhushan Shashi， Sharma Madhu， et al. Physico-chemical factors influencing the shikonin derivatives pro-duction in cell suspension cultures of Arnebia euchroma （Royle） Johnston，a medicinally important plant species[J].Cell biology international，2011，35（2）：153-158.

[ 52 ] 王欣，閆會(huì)，顧向華，等.徐薯55-2的胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23（1）：132-137.

[ 53 ] 李雅麗，孟婷婷，張小利，等.甘草細(xì)胞放大培養(yǎng)中攪拌式反應(yīng)器操作策略優(yōu)化[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，33（6）：867-872.

[ 54 ] 程玉鵬，林進(jìn)華，高寧，等.不同因素對(duì)狹葉柴胡懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，36（5）：305-309.

[ 55 ] Li-hua Wang，Meng-jiao An，Wei-dong Huang，et al. Melatonin and phenolics biosynthesis-related genes in Vitis viniferacell suspension cultures are regulated by temperature and copper stress[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture （PCTOC），2019（3）：475-488.

[ 56 ] 牛曉娟，林夢(mèng)瑩，楊德彩，等.不同培養(yǎng)條件對(duì)金釵石斛懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，34（5）：33-35.

[ 57 ] 鐘春水，賴鐘雄，賴瑞聯(lián)，等.金花茶松散型愈傷組織誘導(dǎo)與懸浮細(xì)胞系建立[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2016，37（3）：476-481.

[ 58 ] 李漢生，姚德恒，陳曉慧，等.藍(lán)光對(duì)龍眼細(xì)胞培養(yǎng)及類黃酮代謝的影響[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（4）：694-701.

[ 59 ] 鄒東恢，梁敏.生物反應(yīng)器的選型原則與設(shè)備選型及新發(fā)展[J].食品工業(yè)，2019，40（4）：244-248.

[ 60 ] 陳永偉，張樂(lè)晶.植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的種類特點(diǎn)及展望[J].種子科技，2017，35（11）：28，30.

[ 61 ] 劉連，王義，史植元，等.植物干細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2018，34（11）：1734-1741.

[ 62 ] 李琰，公冶，祥旭，等.雷公藤不定根兩相培養(yǎng)初步研究[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，34（3）：469-474.

[ 63 ] 胡燕花，張本厚，賈明良，等.間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛組培苗[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2016，18（3）：190-194.