肖婉鈺 孫藝嘉 周賢玉 任海龍 鄒集文 張晶 許東林

摘? ? 要：水稻種子DNA的提取質(zhì)量直接影響水稻種子真實(shí)性檢驗(yàn)的效果。選取市面上常見的8種植物基因組DNA提取試劑盒（K1～K8）進(jìn)行水稻種子DNA提取效果比較研究，結(jié)果表明，試劑盒K2提取得到的水稻種子DNA在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中，條帶最明亮、整齊且無拖尾，質(zhì)量最高，試劑盒K8、K3的提取質(zhì)量次之;試劑盒K1、K6提取的水稻種子DNA純度最佳，試劑盒K2、K3、K5、K7、K8的提取產(chǎn)物純度次之。因此，試劑盒K2的提取效果最好，K8、K3次之，8種試劑盒均適用于基于SSR片段分析的水稻品種真實(shí)性檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：水稻;DNA提取試劑盒;品種真實(shí)性

文章編號(hào)：1005-2690（2021）18-0005-02? ? ? ?中國圖書分類號(hào)：S511? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

種子真實(shí)性檢測(cè)是加強(qiáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、促進(jìn)種業(yè)健康發(fā)展的保障[1]。目前，我國水稻、玉米等大宗農(nóng)作物已普遍開展種子真實(shí)性檢測(cè)，無論是目前主流第二代分子標(biāo)記即SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）的檢測(cè)方法，還是新一代SNP分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，都需要高質(zhì)量的基因組DNA作為基礎(chǔ)。因此，確保植物DNA提取的質(zhì)量是種子真實(shí)性檢測(cè)能否保質(zhì)保量完成的關(guān)鍵因素。

在種子真實(shí)性檢測(cè)中，選取的材料大多為水稻新鮮葉片、幼苗或水稻幼嫩莖 [2-7]。但將水稻的種子播種，發(fā)苗之后再進(jìn)行核酸抽提耗時(shí)太久，如能直接用水稻種子抽提核酸，將大大提升試驗(yàn)效率，但是在水稻的各部位組織中，種子稻米的成分最為復(fù)雜，含更多的淀粉等物質(zhì)，所以提取水稻種子基因組DNA 難度更大。通過比較不同DNA試劑盒水稻種子DNA的提取效果，旨在為今后種子真實(shí)性檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1? ?材料和方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

以10個(gè)雜交水稻品種的干種子為試驗(yàn)材料，材料均來自于2020年廣東省種子監(jiān)督抽查的備份樣品。試驗(yàn)樣品編號(hào)如下，A：深優(yōu)9516，B：野香優(yōu)莉絲，C：恒豐優(yōu)778，D：荃優(yōu)絲苗，E：創(chuàng)優(yōu)華占，F(xiàn)：隆優(yōu)3206，G：廣8優(yōu)金占，H：軟華優(yōu)6100，I：廣8優(yōu)金占，J：恒豐優(yōu)387。

1.2? ?單粒種子DNA提取

取 1 粒水稻干種子，用MP FastPrep-24組織勻漿器磨成粉末，再用8種DNA提取試劑盒（見表1）分別提取上述10個(gè)水稻品種的DNA，按照每種試劑盒中的使用說明來進(jìn)行提取，共獲得80個(gè)水稻基因組DNA。

1.3? ?DNA產(chǎn)物質(zhì)量測(cè)定

1.3.1? ?瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

用超純水將80個(gè)DNA模板稀釋到50 ng/μL，吸取5 μL DNA 與1 μL 上樣緩沖液混勻， 0.8%的瓊脂糖凝膠，85 V電壓，電泳20 min，用Proteinsimple AlphaImager HP凝膠成像系統(tǒng)上觀察和拍照。

1.3.2? ?DNA 質(zhì)量濃度和純度的測(cè)定

用Thermo Scientific NanoDrop One超微量分光光度計(jì)檢測(cè)80個(gè)DNA 模板的質(zhì)量濃度和純度。其中A260/A280的大小代表DNA 純度;DNA 模板在260 nm?的吸光度代表DNA 質(zhì)量濃度，A260=1代表DNA 質(zhì)量濃度為50 ng/μL[8]。

1.4? ?水稻SSR的PCR擴(kuò)增與毛細(xì)管電泳檢測(cè)

引物來自于2014 年原農(nóng)業(yè)部水稻品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR 標(biāo)記法NY/T 1433—2014》。選用5 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，見表2。

20 μL 反應(yīng)體系：10×buffer 2μL，dNTP0.5 μL，Taq酶0.5 μL，10 μmol/L的正向熒光引物1 μL，1 μL 10 μmol/L的反向普通引物，50 ng/μL 的模板DNA1 μL，加無菌水補(bǔ)齊至20 μL。

擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min;變性94 ℃ 45 s，退火50～67 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。

上機(jī)準(zhǔn)備：PCR 結(jié)束以后，取一塊96 孔板加入70%乙醇至總體積為50 μL，震蕩充分混勻。3 700 r/min，4 ℃離心30 min。靜置15 min 后加入內(nèi)標(biāo)LIZ500 和HiDi，振蕩充分混勻，離心10 s。放入PCR 儀，95 ℃ 條件下4 min 變性。放到Thermo Scientific ABI 3500中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?DNA 提取物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

由圖1可見，試劑盒K2呈現(xiàn)出整齊清晰的條帶，無拖尾現(xiàn)象;試劑盒K3和K8條帶亮度較弱，也無拖尾現(xiàn)象;試劑盒K7條帶明亮，但拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重;試劑盒K1、K4、K5、K6條帶亮度很弱，有明顯拖尾現(xiàn)象。

2.2? ?DNA提取物濃度和純度檢驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，8種試劑盒提取方法的DNA質(zhì)量濃度中，試劑盒K7的濃度為25.4～266.3 ng/μL，濃度最高;試劑盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA質(zhì)量濃度在18.4～137.4 ng/μL，濃度適中;試劑盒K4、K6的DNA質(zhì)量濃度低于20 ng/μL，濃度較低。

8種試劑盒提取方法的A260/A280比值情況如下：純DNA 的A260/A280 約為1.8，>1.8 表明有RNA污染，<1.8 表明有蛋白質(zhì)污染[9-10]。試劑盒K2、K3、K8的A260/A280為1.74～2.06，純度最高;試劑盒K1、K5、K6、K7的A260/A280在1.42～2.29，純度次之;試劑盒K4的A260/A280為1.04～1.74，純度最低。

2.3? ?毛細(xì)管電泳結(jié)果

在ABI3700 基因分析儀器上利用熒光標(biāo)記的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，8個(gè)樣品在5個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增片段帶型清晰，8個(gè)試劑盒的表現(xiàn)一致。

3? ?討論

試劑盒K2、K3、K8提取質(zhì)量和產(chǎn)量都比較高。采用試劑盒K2、K3、K8提取得到的DNA純度較高，DNA 帶清晰; PCR擴(kuò)增結(jié)果較好，每個(gè)引物均可擴(kuò)增出清晰的波峰，但操作比較煩瑣，耗時(shí)耗力，提取10個(gè)基因組DNA需2.5 h，所用試劑對(duì)人體有毒。與試劑盒K2、K3、K8相比，試劑盒K6步驟簡(jiǎn)單，用時(shí)少，擴(kuò)增效果也較好，但DNA 純度較低，也用到了一些對(duì)人體有害的試劑，安全性不高。試劑盒K1、K4、K5、K7步驟較復(fù)雜，提取得到的DNA純度較低;試劑盒K7的DNA質(zhì)量濃度太高，需要稀釋才能使用;試劑盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA質(zhì)量濃度適中;試劑盒K4、K6的DNA質(zhì)量濃度低于20 ng/μL，濃度較低。

在進(jìn)行SSR-PCR 反應(yīng)中，模板DNA 如果含有多糖、酚類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[10]， 會(huì)影響DNA 聚合酶活性，干擾引物與模板的結(jié)合。試劑盒K2提取的數(shù)量多，PCR 結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性也好， 在進(jìn)行水稻干種子DNA 抽提時(shí)，試劑盒K2是實(shí)驗(yàn)室提取水稻基因組DNA 的一種好方法。

通過對(duì)8種DNA提取試劑盒提取10個(gè)水稻品種的DNA進(jìn)行DNA提取試劑盒篩選，結(jié)果表明，試驗(yàn)篩選出最優(yōu)DNA提取試劑盒具有穩(wěn)定、高效和可重復(fù)性的特點(diǎn)，可應(yīng)用于水稻真實(shí)性檢測(cè)工作。

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