周 剛，候海玲，李鵬飛，紀(jì)紫薇，郝美玲

(內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010020)

動(dòng)物組織浸出粉(包括牛肉浸粉、牛心浸粉、肝浸粉等)，是以動(dòng)物的肌肉、心、肝等組織為原材料,以水作為溶劑,將其內(nèi)部的水溶性物質(zhì)浸出后,再經(jīng)過(guò)系列分離、純化、濃縮、干燥等加工手段精制而成。牛心浸粉是專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的營(yíng)養(yǎng)品，含有豐富的促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)，同時(shí)還具有能夠中和蛋白胨和瓊脂含有的某種阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)。牛心浸粉配置的培養(yǎng)基在保持細(xì)菌毒力和毒性作用、莢膜的產(chǎn)生等方面均明顯優(yōu)于牛肉浸粉，同時(shí)牛心浸粉加工成本較牛肉浸粉要低出近三倍以上，因此牛心浸粉目前正在逐步替代傳統(tǒng)的牛肉浸粉而予以推廣使用[1]。

牛心浸粉含有大量氨基酸，目前，氨基酸的檢測(cè)方法有分光光度法[2]、高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4-5]、近紅外光譜法[6]、離子色譜法[7]及氣相色譜法[8]等，其中普遍采用樣品衍生化進(jìn)行前處理，高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，但存在衍生化前處理會(huì)帶來(lái)一定誤差，處理方式復(fù)雜，延期時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了液相色譜的強(qiáng)大分離功能和質(zhì)譜分析的高選擇性、高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性，可以有效提取目標(biāo)化合物，避免了基質(zhì)的干擾，定性定量更為準(zhǔn)確[9-10]，該技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代分析手段中必不可少的一部分，并作為強(qiáng)有力的分析技術(shù)，成為醫(yī)藥衛(wèi)生、生命科學(xué)、食品安全等領(lǐng)域中不可或缺的工具之一[11-15]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了不同種類樣品中氨基酸含量[16-18]。但未見(jiàn)應(yīng)用UPLC-MS/MS測(cè)定牛心浸粉中氨基酸組分的報(bào)道，所以，針對(duì)牛心浸粉中的氨基酸進(jìn)行檢測(cè)分析具有重要意義。本文通過(guò)對(duì)色譜、質(zhì)譜和提取方法的優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛心浸粉中7種氨基酸的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑試藥

超高效液相色譜：Ultimate 3000型，美國(guó)Thermo Fisher公司；三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：TSQ Endura型，配電噴霧離子源(Electron Spray Ionization, ESI)，美國(guó)Thermo Fisher公司；超聲波振蕩器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；萬(wàn)分之一電子天平：AL 204型，瑞士Mettler Toledo公司；超純水機(jī)：Milli-Q型，美國(guó)Milliproe公司。

十七種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：濃度2.50μmol/mL，批號(hào)：APQ6881，F(xiàn)UJIFILM Wako Pure Chemical Corporation。

甲醇、乙腈：色譜純，SIGMA-ALDRICH。

3批牛心浸粉：批號(hào)：NIFDC-205-1；NIFDC-205-2；NIFDC-205-3，錫林浩特市鼎安生物科技有限公司。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

吸取17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液300μL，用超純水定容至10mL得到75.0μmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。根據(jù)需要再用超純水配成適當(dāng)濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取混合均勻樣品0.05g(精確至0.0001g)，置于100mL量瓶中，加適量超純水溶解，超聲20min，放至室溫后定容至刻度，搖勻。再精密量取上述溶液2mL于10mL量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

1.4 儀器工作條件

1.4.1色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore Hilic 色譜柱(150mm×2.1mm,2.6μm，美國(guó)Thermo Fisher公司)；保護(hù)柱：AJO-4287 C18(4mm×3.0mm，美國(guó)Phenomenex公司)；柱溫：25℃；進(jìn)樣室溫度：10℃；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：2μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-甲醇(95∶5)等度洗脫。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式: 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)模式；離子源溫度：350℃；離子傳輸管溫度：310℃；離子噴霧電壓:4500V；鞘氣流速：8.0L/min；輔助氣流速：3.0L/min；碰撞氣：氬氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

使用C18色譜柱和Accucore Hilic色譜柱對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，C18色譜柱分離度不如Accucore Hilic色譜柱，拖尾現(xiàn)象明顯，且基線噪音較高，鑒于大部分氨基酸在C18色譜柱上的保留較差，最終選擇適用于大極性化合物分離的Hillic親水色譜柱，達(dá)到了較好的分離效果。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)化合物的性質(zhì)，7種氨基酸均采用正離子模式，分別得到一個(gè)質(zhì)子形成母離子[M+H]+，繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，分別得到7種化合物的主要碎片離子，并優(yōu)化各化合物的碰撞電壓等相關(guān)參數(shù)，選擇最優(yōu)定性定量離子對(duì)。優(yōu)化后7種氨基酸的MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

圖1 7種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

氨基酸類物質(zhì)屬于強(qiáng)極性化合物，大多易溶于水，對(duì)于極性較強(qiáng)的化合物一般采用甲醇、乙腈和水作為提取溶劑，因此在相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[19-20]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同比例的甲醇、乙腈、水和0.01mol/L鹽酸(pH=2)等5種溶液作為提取溶劑的效果，綜合提取效率、峰型等因素，最終選擇水作為提取溶劑。

以水作為提取溶劑，進(jìn)一步優(yōu)化超聲提取時(shí)間，對(duì)比了加標(biāo)后的樣品在提取10min、20min、30min后，氨基酸的含量，結(jié)果顯示，提取時(shí)間從10min到20min，總含量顯著增加，大于20min時(shí)總含量并無(wú)明顯差異，因此選擇提取時(shí)間為20min。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

將7種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水分別稀釋成不同的濃度，測(cè)定其峰面積(Y)，并分別對(duì)其濃度X(ng/mL)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定各氨基酸的線性范圍和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，7種氨基酸在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99，線性關(guān)系良好。當(dāng)取樣量為0.05g時(shí)，以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢出限和定量限，結(jié)果表明，檢出限和定量限均可滿足測(cè)定要求，方法靈敏度高。相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 7種氨基酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，進(jìn)行3水平6平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別稱取0.05g樣品，加入適量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下測(cè)定7種氨基酸的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3，可知7種氨基酸的平均加標(biāo)回收率在90.2%～105.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.09%～0.79%之間，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合質(zhì)譜測(cè)定要求，所建方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3 7種氨基酸的精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 測(cè)定結(jié)果

按上述所建立的7種氨基酸的含量測(cè)定方法對(duì)3批牛心浸粉進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3批牛心浸粉均檢出7種氨基酸，其中甲硫氨酸的含量最低，在3.28～3.66g/kg之間；賴氨酸含量最高，在17.18～19.21g/kg之間；其他氨基酸含量均在7.77～13.00g/kg之間，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3批牛心浸粉中7種氨基酸的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)樣品的提取方法、色譜條件及質(zhì)譜條件等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛心浸粉中7種氨基酸的方法，該方法與傳統(tǒng)氨基酸測(cè)定方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、選擇性專一的特點(diǎn)，同時(shí)此法補(bǔ)充了牛心浸粉中氨基酸測(cè)定的研究空白，為其他動(dòng)物組織浸粉中氨基酸含量測(cè)定的研究提供參考。