馬建功，侯怡帆，王美萍，馬 玲，王曉聞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030800）

小米營養(yǎng)成分豐富，有悠久的食用歷史。許多地方都有將小米粥自然發(fā)酵后飲用的習(xí)慣，但傳統(tǒng)的方法依靠自然發(fā)酵，發(fā)酵過程不好控制，最終產(chǎn)品的風(fēng)味也不好，因而利用選育的乳酸菌結(jié)合現(xiàn)代加工工藝技術(shù)進行益生菌發(fā)酵，不僅可以實現(xiàn)定向發(fā)酵，而且可顯著提高小米淀粉及蛋白質(zhì)的消化率，提高營養(yǎng)價值，改善口感及風(fēng)味，使發(fā)酵過程容易控制，有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[1-3]。

國內(nèi)外有關(guān)小米發(fā)酵的研究報道較多，KOUAKOU B等[4]研究發(fā)現(xiàn)，小米發(fā)酵1～2 d時還原糖的含量顯著增加，而蛋白含量降低。SONGRé-OUATTARA L T等[5]從傳統(tǒng)的ben-saalga中篩選的兩株植物乳桿菌A6.1及A6發(fā)酵小米花生混合粥，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌A6比A6.1的水解及酸化作用更顯著，且植物乳桿菌A6.1發(fā)酵后小米花生混合粥中有大量的麥芽三糖和四糖。姚世聰?shù)萚6]報道小米經(jīng)過米曲霉和米根霉3.2751發(fā)酵后的總酸、還原糖以及氨基酸態(tài)氮含量顯著提高。秦慧彬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，單一乳酸菌在1%接菌量下發(fā)酵48 h后得到的酸粥風(fēng)味最佳，自由氨基酸含量達到177.23 μg/mL。張麗萍等[8]得出富含L-乳酸小米發(fā)酵飲料的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度36.6 ℃，發(fā)酵劑接種量3.15%，氮源添加量2.86%，發(fā)酵時間7.76 h。王丹丹[9]研究發(fā)現(xiàn)，從傳統(tǒng)酸粥中分離得到的乳酸菌和酵母菌（3∶1）按照10%接種量在34 ℃進行24 h發(fā)酵后的小米飲料風(fēng)味最好。張桂芳等[10]研究得到在白砂糖添加量8%，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌（1∶1∶2）接種量2.5%，38 ℃條件下發(fā)酵9 h得到的發(fā)酵小米漿感官評分和多酚含量較高。譚海剛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小米與玉米粉以1∶5的比例配比后添加神曲0.26%，添加纖維素酶167 U/g，然后發(fā)酵1.5 d后的飲品口感較好。靳志強等[12]將濕熱處理后的小米進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)賴氨酸、總氨基酸的生物可給性以及抗氧化活性都得到提高。還有相關(guān)的研究發(fā)酵對小米淀粉結(jié)構(gòu)及物化特性的影響[13-14]，但對熟制小米漿益生菌發(fā)酵工藝的研究及特性分析鮮有報道，因而本試驗以熟制小米漿為原料，利用植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌為復(fù)合菌種進行發(fā)酵，以感官評分和菌落總數(shù)為評價指標(biāo)，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，以期為開發(fā)風(fēng)味獨特、富含營養(yǎng)成分且具有一定功能的發(fā)酵小米飲品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（山西晉谷21）、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工實驗室。

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、無水硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、吐溫-80、硫酸銅：天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚：索萊寶（北京）有限公司；福林酚（分析純）：美國Sigma公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114電子天平：帝豪斯儀器有限公司；LDZX-50S立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海躍進醫(yī)療器械廠；LC-406立式冷藏陳列柜：江蘇阪神電器股份有限公司；LD5-2B低速離心機：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；pHSJ-3F pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵小米漿工藝流程及操作要點

小米→淘洗、浸泡→煮制→磨漿→加糖→殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→成品

淘洗、浸泡：用適量水將小米淘洗干凈，為充分溶出小米中的可溶性物質(zhì)和煮制方便，淘洗后的小米中加入25倍的水，室溫條件下浸泡12 h。

煮制：將浸泡好的小米在95 ℃條件下連續(xù)煮制20 min。

加糖、殺菌：為保證產(chǎn)品的安全，磨漿后的小米漿再進行殺菌（90 ℃、5 min），在殺菌過程中加入7%的白砂糖，充分溶解后冷卻至37 ℃。

接種、發(fā)酵：為了進行充分的發(fā)酵，接入4%（V/V）的復(fù)合菌種（植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=1∶1），充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笤?7 ℃條件下發(fā)酵24 h。

1.3.2 單因素試驗

在復(fù)合菌種接種量4%、發(fā)酵時間24 h的條件下，考察不同白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）對發(fā)酵小米漿活菌數(shù)和感官評分的影響；在發(fā)酵時間24 h、白砂糖添加量7%的條件下，考察不同復(fù)合菌種（1∶1）接種量（2%、3%、4%、5%、6%）對發(fā)酵小米漿活菌數(shù)和感官評分的影響；在復(fù)合菌種接種量4%、白砂糖添加量7%的條件下，考察不同發(fā)酵時間（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）對發(fā)酵小米漿活菌數(shù)和感官評分的影響。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計3因素3水平正交試驗考察各因素對發(fā)酵小米漿活菌數(shù)和感官評分的影響，正交試驗因素與水平見表1。

表1 小米漿發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for millet pulp fermentation condition optimization

1.3.4 測定方法

感官評價：取一定量的樣品于燒杯中，由10名具有一定專業(yè)知識且經(jīng)過培訓(xùn)的感官評定小組成員依照感官評分標(biāo)準(zhǔn)對其色澤、滋味及氣味、狀態(tài)進行打分。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2[9-11]。

表2 發(fā)酵小米漿的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standards of sensory evaluation of fermented millet pulp

菌落總數(shù)：采用稀釋平板法[7]，取1 mL樣品加入9 mL滅菌生理鹽水，依次進行梯度稀釋，取合適稀釋度的樣液1 mL倒入培養(yǎng)皿中，再加入MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)；

pH值：參考姚世聰?shù)萚6]的方法，取一定量的樣品用pH計直接測定；

還原糖：采用菲林試劑法[15]，取樣品1.0 mL定容至25 mL容量瓶中，加入2.5 mL DNS試劑，充分混勻后沸水浴加熱5 min，流水冷卻，以去離子水為空白，分光光度計于波長540 nm處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖的含量。

總酚：采用Folin-Ciocalteu法[12]。取1 mL樣品，加入30 mL去離子水和2.5 mL福林酚試劑，充分混合均勻后避光放置6 min，再加入7.5 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至50 mL。避光室溫條件下靜置2h，分光光度計于波長760nm處測定吸光度值。

礦物質(zhì)釋放率：參照XIA Q等[16]的方法。取一定量的樣品，加入6 mL 體積分?jǐn)?shù)65%的硝酸、2 mL 體積分?jǐn)?shù)30%的過氧化氫在130 ℃條件下消解4 h。過濾取濾液，用去離子水定容至10 mL后用電感耦合等離子體光譜儀測定鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的含量，并通過發(fā)酵后的游離礦物質(zhì)含量和總礦物質(zhì)含量的比值計算礦物質(zhì)釋放率。

氨基酸態(tài)氮：三氯乙酸沉淀法[17]，取一定量的樣品加入20%三氯乙酸溶液，混勻后靜置60 min，4 000 r/min離心10 min，凱氏定氮儀測定上清液中的總氮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白砂糖添加量對小米漿發(fā)酵的影響

由圖1可知，不同的白砂糖添加量對小米漿發(fā)酵后的感官評分和菌落總數(shù)影響較小，在添加量為5%時，發(fā)酵完成后小米漿菌落總數(shù)和感官評分較低，此后隨著白砂糖添加量的增加，感官評分和菌落總數(shù)不斷增加，當(dāng)白砂糖添加量為7%時，發(fā)酵小米漿感官評分達最高值81.44分，菌落總數(shù)也達到最高值8.23 lg（CFU/mL）。與張桂芳等[10]報道的在糊化酶解后的小米漿加入8%的白砂糖經(jīng)過嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌菌（1∶1∶2）發(fā)酵后的感官評分較高的結(jié)果接近，與楊健等[18-19]報道的結(jié)果一致。復(fù)合菌種發(fā)酵中白砂糖主要影響發(fā)酵后小米飲料甜度和口感，當(dāng)加入量較低時甜度不夠，而加糖量較高時甜度太大，而復(fù)合菌種發(fā)酵過程中優(yōu)先利用小米漿中的低聚糖、還原糖產(chǎn)酸，在本試驗的濃度范圍內(nèi)，白砂糖對發(fā)酵后乳酸菌的數(shù)量影響較小。因此，確定白砂糖添加量以7%為宜。

圖1 白砂糖添加量對發(fā)酵小米漿菌落總數(shù)和感官評分的影響Fig.1 Effect of sugar addition on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp

2.2 接種量對小米漿發(fā)酵的影響

由圖2可知，不同的接種量對小米漿發(fā)酵后的感官評分和菌落總數(shù)有一定影響，復(fù)合菌種接種量低時，發(fā)酵時間延長且發(fā)酵不充分，發(fā)酵完成后菌落總數(shù)較低，代謝產(chǎn)生的酸也較少，致使發(fā)酵后的小米漿感官評分較低，隨著復(fù)合菌種接種量的增加，感官評分和菌落總數(shù)都不斷增加，當(dāng)接種量達到4%時，發(fā)酵完成后菌落數(shù)上升不明顯，而感官評分在接菌量為4%時也不再有明顯變化，此時發(fā)酵小米漿感官評分和菌落總數(shù)分別為83.20 lg（CFU/mL）和8.30 lg（CFU/mL）。這一結(jié)果與宋忠勵[20]研究得出的植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別發(fā)酵小米飲料時最適接種量的結(jié)果一致，而與辛泓均[21]研究得到的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和副干酪乳桿菌（1∶1∶1）發(fā)酵小米飲料最適接種量2%的結(jié)果不同，與趙修報等[22]研究得出的酵母菌、乳酸菌共同發(fā)酵糊化、糖化的大麥芽、小米、赤小豆、燕麥谷物飲料時2.5%的最適接種量也不同，可能與前體原料處理不同以及所用復(fù)合菌種不同有關(guān)。因此，確定復(fù)合菌種接種量以4%為宜。

圖2 復(fù)合菌種接種量對發(fā)酵小米漿菌落總數(shù)和感官評分的影響Fig.2 Effect of compound strains inoculum on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp

2.3 發(fā)酵時間對小米漿發(fā)酵的影響

由圖3可知，不同的發(fā)酵時間對小米漿發(fā)酵后的感官評分和菌落總數(shù)影響較大，發(fā)酵時間太短，發(fā)酵不完全，產(chǎn)酸量也不夠，致使發(fā)酵小米漿菌落總數(shù)和感官評分都較低，而延長發(fā)酵時間后菌落數(shù)和感官評分都不斷增加，但在發(fā)酵24 h后發(fā)酵小米漿菌落總數(shù)達到8.45 lg（CFU/mL）且不再隨著發(fā)酵時間的延長而明顯增加，感官評分也在發(fā)酵32 h后下降，可能因為小米漿中可利用的低聚糖、還原糖等底物在24 h發(fā)酵后大大降低，加上菌體代謝產(chǎn)生的酸等物質(zhì)對自身的抑制，因而再延長發(fā)酵時間菌落數(shù)不再明顯增加。而感官評分在發(fā)酵32 h時達到最高值86.46分，可能因為盡管乳酸菌在24 h后增長不明顯，但其自身代謝產(chǎn)生的酶可以促進部分生化反應(yīng)，進而生成對風(fēng)味有益的物質(zhì)。與宋忠勵等[20-21]研究得出的結(jié)果一致，而與張桂芳等[10，18，23]的結(jié)果不一致，可能與選取的發(fā)酵菌種不同有關(guān)。為降低長時間發(fā)酵過程中污染的風(fēng)險，綜合感官評分和菌落數(shù)的結(jié)果，選擇發(fā)酵時間為24 h為宜。

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵小米漿菌落總數(shù)和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp

2.4 正交試驗

以發(fā)酵后的菌落總數(shù)作為參照指標(biāo)，作為活菌型的發(fā)酵制品，期望發(fā)酵后的活菌數(shù)越高越好，通過對正交試驗結(jié)果分析可知，對菌落總數(shù)變化的影響因素順序為C＞B＞A，即發(fā)酵時間＞接種量＞加糖量?？芍?種影響因素中對活菌數(shù)影響最大的是發(fā)酵時間，其次是接種量，影響最小的是加糖量。而以感官評分作為評價指標(biāo)，各因素對感官評分的影響順序為C＞B＞A，即發(fā)酵時間＞接種量＞加糖量。

表3 小米漿發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for millet pulp fermentation condition optimization

9個試驗處理中菌落總數(shù)最高8.98 lg（CFU/mL）的水平組合為A2B3C3，對應(yīng)的感官評分為82.12分，而9個試驗處理中感官評分最高（87.81分）的水平組合為A1B2C3，對應(yīng)的菌落總數(shù)為8.79 lg（CFU/mL）。二者不一致，但作為發(fā)酵飲品，優(yōu)先考慮感官評分，同時感官評分最高組合A1B2C3對應(yīng)菌落總數(shù)8.79 lg（CFU/mL）和最高菌落總數(shù)8.98 lg（CFU/mL）接近，因而綜合確定最優(yōu)的組合為A1B2C3，即白砂糖添加量6.5%、接種量4.0%、發(fā)酵時間28 h。

2.5 發(fā)酵小米漿的理化指標(biāo)

為進一步分析發(fā)酵后小米漿的理化指標(biāo)，對發(fā)酵前后的小米漿pH值、還原糖含量、總酚含量、礦物質(zhì)釋放率以及氨基酸態(tài)氮含量進行比較，結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵小米漿的部分理化指標(biāo)Table 4 Some physicochemical indexes of fermented millet pulp

由表4可知，發(fā)酵后小米漿的pH由6.51降低至4.58，而同時淀粉被糊化后經(jīng)益生菌代謝生成了更多的還原糖，達到0.66 mg/100 g，經(jīng)過發(fā)酵后總酚含量由0.13增加至0.75 μg/mL，可能因為小米中的大部分酚類與蛋白質(zhì)、淀粉等生物大分子結(jié)合變得不可溶，發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的水解酶作用于蛋白質(zhì)和淀粉，從而釋放了復(fù)合物中的酚類，與靳志強等[12，24]的研究結(jié)果相似。礦物質(zhì)釋放率經(jīng)過發(fā)酵后也大大提高，可能因為植酸、酚類化合物等礦物質(zhì)螯合劑影響礦物質(zhì)的釋放，發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的植酸酶將植酸降解，從而可提高礦物質(zhì)的釋放率[25]。發(fā)酵可以降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生的豐富酶系可以將原料中的蛋白質(zhì)分解成游離的氨基酸，從而增加蛋白質(zhì)的消化率，同時部分氨基酸也會增加產(chǎn)品的風(fēng)味，小米漿經(jīng)過發(fā)酵后的氨基酸態(tài)氮大大提高，達到25.76 mg/100 g，說明發(fā)酵可以促進小米漿中的蛋白降解，進而提高其營養(yǎng)價值。

3 結(jié)論

以發(fā)酵小米漿感官評分和菌落總數(shù)為評價指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計優(yōu)化了益生菌發(fā)酵小米漿的工藝參數(shù)，優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)為白砂糖添加量6.5%、接菌量4.0%、37℃條件下發(fā)酵28h。在此工藝下發(fā)酵后的小米漿具有較高的感官評分和活菌數(shù)，同時還原糖含量、總酚含量、礦物質(zhì)釋放率和氨基酸態(tài)氮分別由原來的0.28g/100g、0.13 μg/mL、1.28%、6.32 mg/100 g提高至0.66 g/100 g、0.75 μg/mL、5.43%、25.76 mg/100 g。