李彩霞,焦 揚(yáng),崔 瑋*,張 勇,高海寧
(1.河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 張掖 734000;2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 張掖 734000)
原花青素廣泛存在于各種植物核、皮或種籽中,是由單體黃烷-3-醇類物質(zhì)以不同聚合度連接而成的多酚類化合物[1]。研究證明,原花青素具有抗氧化、清除自由基[1-2]、抗腫瘤、抗心肌缺血、抗炎癥,抑制阿爾茲海默癥、動脈粥樣硬化,護(hù)肝解毒、抗菌、美白皮膚、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性[2-6],主要應(yīng)用于食品、化妝品和藥品等領(lǐng)域。
葡萄梗是葡萄深加工中的主要廢棄物,資源豐富,并含有大量的原花青素、單寧等多酚類物質(zhì)[7-8]。目前對葡萄梗的研究和開發(fā)主要集中于單寧、多酚的提取和測定[9]。而葡萄梗作為葡萄加工工序中的第一道廢棄物,其研究價值尚未引起人們的重視。據(jù)統(tǒng)計(jì),生產(chǎn)100 L紅葡萄酒可產(chǎn)生25 kg的果渣,其中葡萄梗占4 kg[10],葡萄采摘時也有大量的葡萄梗因被丟棄而造成資源的大量浪費(fèi)。葡萄梗資源豐富,若能采用現(xiàn)代技術(shù)對原花青素等成分進(jìn)行提取和純化,并研發(fā)成抗氧化劑,既能充分利用該資源,又能減少環(huán)境污染。
本研究采用超聲輔助雙水相從赤霞珠葡萄梗中提取原花青素,提取液濃縮后經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化,通過紅外和紫外光譜對原花青素提取物進(jìn)行表征,并檢測葡萄梗原花青素對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)自由基、羥基自由基(·OH)和H2O2的清除作用,以及總抗氧化力和酪氨酸酶的抑制活性,旨在為葡萄梗資源在保健品和化妝品領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
葡萄梗:由甘肅省濱河食品有限公司提供(原料來源于張掖板橋莊園),將樣品去除雜質(zhì),清洗陰干,粉碎過60目篩。
無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、過硫酸銨、香草醛等(均為分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純):天津市光復(fù)科技有限公司;兒茶素、原花青素(純度≥98%):上海金穗生物科技有限公司;總抗氧化力試劑盒:南京建成生物工程研究所;AB-8大孔樹脂:南開大學(xué)化工廠。
DR6000型紫外可見分光光度計(jì):美國哈希公司;MiLLROCK型冷凍干燥機(jī):美國米爾洛克公司;SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;KQ-250B型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;BT600F恒流泵:雷弗流體科技有限公司;Nicolet iS50型紅外光譜儀:美國Thermo Scientific公司;Φ3.5×40 cm層析柱:上海亞榮生化儀器廠。
1.3.1 葡萄梗原花青素粗提物的制備及純化
葡萄梗原花青素粗提物的制備及純化[11]:配制乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙水相,按料液比1∶40(g∶mL)加入過60目篩的葡萄梗粉末,在35 ℃超聲條件下(40 kHz、250 W)提取50 min后分兩相,將上相減壓濃縮至漿狀物,凍干。將凍干后的固體研磨成粉末,密封保存。
葡萄梗原花青素粗提物的純化:采用濕法裝柱[12],將處理好的AB-8樹脂裝入Φ3.5 cm×40 cm的層析柱,柱床體積為86.55cm3,按10倍的柱床體積上樣(粗提物質(zhì)量濃度6mg/mL,pH=6),以0.5 mL/min流速上樣至動態(tài)吸附飽和后,用4倍的蒸餾水洗柱,至流出液澄清,然后用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為解吸劑,以0.5 mL/min流速解吸至解吸液為無色,將體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫液減壓濃縮至原體積的1/10,冷凍干燥,得原花青素褐色粉末,保存?zhèn)溆?。并測定純化前后樣品中原花青素的質(zhì)量,按下式計(jì)算純化倍數(shù):
1.3.2 原花青素含量的測定
根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]并稍作修改。準(zhǔn)確稱取兒茶素20 mg,用無水甲醇溶解并定容100 mL,配制成0.2 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL,無水甲醇補(bǔ)充至0.5 mL,依次加入4%香草醛溶液3.0 mL,1.50 mL濃鹽酸,各管避光反應(yīng)15 min,以試劑空白為對照,在波長500 nm處測定吸光度值。以吸光度值(y)為縱坐標(biāo),兒茶素含量(x)為橫坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為y=4.985x+0.021 5,R2=0.999 3。
提取物中原花青素的測定:稱取葡萄梗粗提物和純化品各50 mg,用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解并定容至50 mL。吸取0.5 mL(純化樣品吸取0.1 mL),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法測定的吸光度值,按以下公式計(jì)算原花青素的含量:
式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的原花青素含量,mg;Vt為原花青素提取液總體積,mL;N為樣品的稀釋倍數(shù);W為樣品的質(zhì)量,g;Vs為測定時所取溶液的體積,mL。
1.3.3 樣品純化前后原花青素紫外光譜和紅外光譜表征
將1.3.1節(jié)制備的樣液分別稀釋15倍,采用紫外可見分光光度計(jì)在波長200~400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,根據(jù)峰型的高低進(jìn)一步確定純化的效果。
紅外光譜表征:傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)T-IR)用于確定生物表面活性劑提取物中存在的官能團(tuán)和化學(xué)鍵,然后確定其化學(xué)性質(zhì)。將1.3.1制備的樣品使用Nicolet iS50型FT-IR光譜儀ATR附件實(shí)現(xiàn)FT-IR分析,在波數(shù)4 000~650 cm-1范圍內(nèi)掃描純化前后葡萄梗原花青素的紅外光譜圖。
1.3.4 原花青素提取物的抗氧化活性檢測
原花青素提取物對DPPH自由基(DPPH·)的清除活性:根據(jù)文獻(xiàn)[15]稍有改動。分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度(10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL)的樣品和陽性對照(20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的原花青素溶液),加入1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇和2 mL的DPPH溶液(0.15 mmol/L)為測定組,2 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇和2 mL的DPPH溶液為對照組,混合均勻,避光30 min后,在波長517 nm處測定吸光度值,按下式計(jì)算DPPH·的清除率:
式中:A0為未加原花青素溶液對照組吸光度值;Ai為加原花青素溶液吸光度值。
葡萄梗原花青素對ABTS自由基(ABTS+·)的清除活性:ABTS自由基的清除作用根據(jù)文獻(xiàn)[16]稍有改動。分別吸取測定DPPH自由基的清除活性時配制的溶液各0.1 mL,加入2.3 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和0.6 mL ABTS溶液為測定組,2.4 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和0.6 mL ABTS溶液為對照組,搖勻,避光反應(yīng)6 min后,在波長734 nm處測定吸光度值,按下式計(jì)算ABTS+·的清除率:
式中:A0為未加原花青素溶液對照組吸光度值;Ai為加原花青素溶液吸光度值。
原花青素提取物對H2O2的清除活性:原花青素溶液對H2O2清除能力測定參考文獻(xiàn)[17]稍作修改。配制40 mmol/L過氧化氫溶液,吸取600 μL過氧化氫溶液和100 μL不同質(zhì)量濃度的試樣(20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL),然后用蒸餾水補(bǔ)至3 mL并搖勻,在室溫條件下反應(yīng)30 min為樣品管,以等體積的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇代替樣品為對照管,空白調(diào)零管為2.9 mL蒸餾水和100 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液。以相應(yīng)濃度的原花青素為陽性對照,反應(yīng)結(jié)束后以空白管調(diào)零分別在波長230 nm處測定各反應(yīng)管溶液的吸光度值,吸光度值越低,樣品對H2O2的清除活性就越高。按以下公式計(jì)算H2O2的清除率:
式中:A0為空白組吸光度值,A1為含樣品溶液吸光度值。
葡萄梗原花青素對羥基自由基(·OH)的清除作用的測定:參照文獻(xiàn)[18],F(xiàn)eSO4與H2O2反應(yīng)生成·OH。水楊酸可以捕獲自由基,510 nm處的吸光度值的降低可用于評從原花青素清除·OH能力。精確取1 mL質(zhì)量濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的樣品溶液,加入1 mL 10mmol/L的FeSO4、1mL10mmol/L的H2O2,混勻,靜置10 min 再加入1 mL 10 mmol/L水楊酸混勻,37 ℃反應(yīng)30 min,在波長510 nm處測量反應(yīng)溶液的吸光度值A(chǔ)1,以1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇代替樣品溶液對照管測量吸光度值A(chǔ)0。按下式計(jì)算·OH的清除率:
式中:A0、A1分別為空白溶液和樣品溶液的吸光度值。
總抗氧化能力的測定:嚴(yán)格按照總抗氧化能力試劑盒操作,總抗氧化能力的定義:在37 ℃時,每分鐘每毫升不同質(zhì)量濃度的提取液和陽性對照溶液,使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位(U)??偪寡趸σ韵率接?jì)算:
葡萄梗原花青素對酪氨酸酶抑制活性的測定:蘑菇酪氨酸粗酶提取液的制備參照文獻(xiàn)[19],稱取新鮮的雙孢蘑菇50 g切成小塊置于研缽中加入0.2 moL/L內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH=6.8)50mL,迅速置于冰浴中進(jìn)行研磨,研磨成漿后再加入PBS溶液100mL,在冰浴中提取1h,在4℃、10000r/min離心20 min,取其上清液即為得到蘑菇酪氨酸粗酶提取液。
酪氨酸酶活性的測定參照文獻(xiàn)[20]。在試管中依次加入2.9 mL PBS溶液,2 mmol/L的L-左旋多巴(L-levodopa,L-DOPA)(pH=6.8的PBS配制)0.8 mL,再加入0.3 mL酪氨酸酶溶液為實(shí)驗(yàn)組,用0.3 mL緩沖液代替酶液為空白對照調(diào)零,在475 nm處,并每隔30 s測定1次吸光度值,測定6 min,并制作酶活性隨時間的動力學(xué)曲線。酪氨酸酶活性的定義:在測定條件下以每分鐘多巴醌在波長475 nm的吸光度值增加0.001為一個酶活單位(U)。
葡萄梗原花青素對酪氨酸酶的抑制作用:在0.2 mol/L的PBS(pH=6.8)中,按表1順序加入緩沖液、提取液、酪氨酸酶液,最后各管加入質(zhì)量濃度為2 mmol/L的L-多巴溶液,在波長475 nm處測定4 min內(nèi)的吸光度變化值,按下式計(jì)算酪氨酸酶的抑制率:
表1 反應(yīng)液組成與體積Table 1 Composition and volume of reaction solution
式中:A1為不加提取液空白管的吸光度值;A2為不加提取液和酶液的空白對照管的吸光度值;A3為加提取液和酶液的吸光度值;A4為不加酶液對照管的吸光度值。
1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理
采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù),用Origin 8.5軟件作圖,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個重復(fù)的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差。
2.1.1 赤霞珠果梗純化樣品中原花青素的純度
經(jīng)計(jì)算純化后樣品中原花青素的含量為487.80 mg/g,與純化前原花青素的含量(81.11mg/g)比較增加了406.69mg/g,其純化倍數(shù)為6.01,由此說明AB-8樹脂對赤霞珠果梗原花青素的純化是非常有效的。
2.1.2 原花青素的紫外光譜
由圖1可以看出,純化前后葡萄梗原花青素的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液在波長279 nm處均具有特征峰,在300~325 nm內(nèi)無吸收,250~260 nm具波谷(257 nm)。這可能是原花青素結(jié)構(gòu)單元含A和B兩個共軛苯環(huán),其上有多個羥基取代,使苯環(huán)的B帶(波長255 nm處)顯著紅移,光譜圖與微波法提取的葡萄籽原花青素的全波長掃描光譜一致[21],在280 nm處出現(xiàn)的兒茶素的特征吸收峰,說明葡萄梗原花青素主要是由兒茶素和表兒茶素組成的原花青素類[22-23],且純化物特征峰明顯高于未純化的提取物,由此說明,AB-8大孔樹脂對葡萄梗中原花青素的純化效果非常顯著。
圖1 純化前后樣品的紫外光譜Fig.1 Ultraviolet spectra of samples before and after purification
2.1.3 純化前后樣品的紅外光譜
由圖2可知,純化前后樣品的紅外光譜差異明顯,純化后樣品在3 208 cm-1處的吸收峰是-OH的伸縮振動帶,波長1 600 cm-1,1 523 cm-1,1 432 cm-1是苯環(huán)骨架的特征吸收峰,波長1 279 cm-1,1 120 cm-1,1 036 cm-1是C-O-C的伸縮振動帶,在1 520~1 540 cm-1處有一個單峰(1 523 cm-1),在低頻指紋區(qū)780 cm-1~730 cm-1范圍內(nèi)只有一個峰(764 cm-1),根據(jù)B環(huán)上羥基的數(shù)量的不同,將多聚原花青素分為以原翠雀定(B環(huán)含3個羥基)為主的結(jié)構(gòu)單元,或者B環(huán)含有2個羥基的原花青定為主的結(jié)構(gòu)單元,原翠雀定的紅外特征吸收峰在振動頻率區(qū)(1 540~1 520 cm-1)處有2個吸收峰,且在730 cm-1左右有強(qiáng)吸收峰[23-24]。該圖譜顯示,在振動頻率區(qū)(1 540~1 520 cm-1)處只有1 523 cm-1一個吸收峰,在低頻指紋區(qū)(780~730 cm-1)范圍內(nèi)只有764 cm-1一個峰,在730 cm-1附近無吸收譜帶,由此推測,赤霞珠葡萄梗純化物是以原花青定為主要結(jié)構(gòu)單元的原花青素。
圖2 純化前(a)后(b)樣品的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of samples before (a) and after (b) purification
2.2.1 葡萄梗原花青素對DPPH·的清除活性
自由基與機(jī)體的衰老有密切關(guān)系,DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,自由基清除劑可與DPPH反應(yīng),使其醇溶液紫色減弱,在波長517 nm處的吸光度值降低,該方法可用于檢測待測物的抗氧化性[25]。由圖3可知,葡萄梗原花青素與對照原花青素對DPPH·均有一定的清除作用,且隨著質(zhì)量濃度的增加,對DPPH·的清除率也隨著增大,在葡萄梗原花青素質(zhì)量濃度40 μg/mL時,對DPPH·清除率為77.02%,而對照質(zhì)量濃度為40 μg/mL,其清除率為62.05%,說明葡萄梗原花青素對DPPH·的清除活性高于對照。
圖3 葡萄梗原花青素對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on DPPH free radical
2.2.2 葡萄梗原花青素對ABTS+·的清除活性
ABTS+·清除法是通過比色法來測定樣品的抗氧化活性,ABTS 試劑在氧化劑作用下會形成綠色的ABTS+·,在抗氧化物存在時ABTS+·的產(chǎn)生會被抑制,在波長734 nm處的吸光度降低。此法具有操作快速、簡單、高通量等優(yōu)點(diǎn),是目前評價天然產(chǎn)物抗氧化活性常用的方法[26]。由圖4可知,隨著葡萄梗原花青素與對照原花青素質(zhì)量濃度的增加,對ABTS+·的清除作用均在增大,在葡萄梗原花青素質(zhì)量濃度為40 μg/mL時對ABTS+·的清除率為98.15%,而對照濃度為40 μg/mL,其清除率為97.82%,該數(shù)據(jù)表明葡萄梗原花青素對ABTS+·的清除作用高于對照。
圖4 葡萄梗原花青素對ABTS自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on ABTS free radical
2.2.3 葡萄梗原花青素對H2O2的清除活性
H2O2可導(dǎo)致人機(jī)體遺傳物質(zhì)的損傷,基因突變,加速人體的衰老進(jìn)程。由圖5可以看出,葡萄梗原花青素與原花青素對照對H2O2的抑制率隨著濃度的增加而逐漸增大,在質(zhì)量濃度達(dá)40 μg/mL時,抑制效果分別達(dá)到10.78%和8.89%。由此數(shù)據(jù)可知,在低濃度時葡萄梗提取物原花青素對H2O2自由基的清除作用稍高于對照,而在高濃度時,低于對照。
圖5 葡萄梗原花青素對H2O2的清除作用Fig.5 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on H2O2
2.2.4 葡萄梗原花青素對·OH的清除能力
·OH對人體的攻擊首先是從細(xì)胞膜開始的,一旦細(xì)胞膜破壞就會導(dǎo)致心血系統(tǒng)疾病,更嚴(yán)重的話會導(dǎo)致基因突變,從而引起發(fā)生系統(tǒng)性的混亂。由圖6可以看出,葡萄梗原花青素和對照品對·OH的抑制率隨著原花青素的濃度的增加而逐漸增大,在質(zhì)量濃度達(dá)40 μg/mL時,其抑制分別為57.63%和50.8%。說明,葡萄梗原花青素對·OH有抑制作用,其抑制作用高于對照。
圖6 葡萄梗原花青素對羥基自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on hydroxyl radical
2.2.5 葡萄梗原花青素的總抗氧化能力
由圖7可知,葡萄梗原花青素和對照原花青素的總抗氧化力隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng),并呈正相關(guān),相關(guān)性分別為y梗=0.690 7x+19.471,R2=0.964 6;y對=0.405 6x+0.045 7,R2=0.986 7。在葡萄梗原花青素和對照的質(zhì)量濃度為40 μg/mL時,總抗氧化力分別為49.31 U/mL、15.98 U/mL。總體而言,對照原花青素的總抗氧化力不及葡萄梗原花青素。
圖7 葡萄梗原花青素的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of proanthocyanidins from grape stalks
2.2.6 葡萄梗原花青素對酪氨酸酶的抑制作用
由圖8可知,在4~5 min時,其酶活力最高,在0~4 min范圍內(nèi),酪氨酸酶活性與時間呈相關(guān)性,y=1.489 9x+197.94,相關(guān)系數(shù)R2=0.980 6,因此,在研究提取物對酪氨酸酶的抑制作用時測定4 min內(nèi)的吸光度變化值。
圖8 酪氨酸酶促動力曲線Fig.8 Kinetic curve of tyrosinase activity
酪氨酸酶是人體中黑色素生成代謝與兒茶酚胺密切相關(guān)的關(guān)鍵限速酶,酪氨酸酶活性物質(zhì)已在治療色素障礙類疾病、防腐保鮮、美白和烏發(fā)等方面得到了廣泛的應(yīng)用[27]。由圖9可知,隨著葡萄梗原花青素和對照原花青素質(zhì)量濃度的增加對酪氨酸酶抑制活性也在增加,且呈正相關(guān),y梗=1.2145x-4.7965,R2=0.9801;y對照=0.743 2x-8.076 6,R2=0.981 3。在葡萄梗原花青素40 μg/mL時對酪氨酸酶的抑制率為43.78%,而對照質(zhì)量濃度為40μg/mL時,其抑制率為24.37%。以上結(jié)果表明,葡萄梗原花青素對酪氨酸酶的抑制作用強(qiáng)于對照,因此,具有良好的美白活性。
圖9 葡萄梗原花青素對酪氨酸酶的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of proanthocyanidins from grape stalks on tyrosinase
原花青素對酪氨酸酶的抑制率與DPPH·、ABTS+·、·OH清除率、H2O2還原力及總抗氧化力之間的相關(guān)性見圖10。由圖10可知,隨著酪氨酸酶抑制活性的增加,·OH、DPPH·、ABTS+·、H2O2清除率及總抗氧化力也隨著增加,且呈顯著正相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)R2分別為0.860 4、0.870、0.951 2、0.951 9(P<0.05)和0.986 2,因此推斷葡萄梗原花青素對酪氨酸酶抑制能力與其抗氧化有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性??赡苁峭ㄟ^清除自由基,終止自由基鏈的引發(fā),削弱酪氨酸酶反應(yīng)過程中的供氧而抑制酪氨酸酶催化活性[25],也可能是原花青素與L-多巴競爭酶的結(jié)合部位,或者原花青素能與酪氨酸酶中的金屬離子鰲合,從而抑制酶的活性[26],其機(jī)理需尚待進(jìn)一步研究。
圖10 酪氨酸酶抑制率與抗氧化活性的相關(guān)性Fig.10 Correlation between tyrosinase inhibition rate and antioxidant activity
通過超聲輔助雙水相提取赤霞珠葡萄梗中原花青素、并采用AB-8大孔吸附樹脂對其進(jìn)行純化,純化后的產(chǎn)物中原花青素含量為487.80 mg/g,是純化前(81.11 mg/g)的6.01倍。對純化物進(jìn)行紫外和紅外掃描,均具有原花青素的特征峰,表明AB-8大孔吸附樹脂純化葡萄梗原花青素是有效的。
抗氧化表明,葡萄梗原花青素質(zhì)量濃度為40 μg/mL時,對DPPH·、ABTS+·、·OH和H2O2的清除率分別為77.02%、98.15%、57.63%和10.78,對酪氨酸酶抑制率和總抗氧化力分別為43.78%和49.31 U/mL,均高于對照。說明葡萄梗原花青素具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性。