劉延波，李海登，秦夢(mèng)星，趙志軍，王 賢，韓素娜，潘春梅

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州 450046；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；5.賒店老酒股份有限公司，河南 南陽(yáng) 473300）

大曲是白酒釀造過(guò)程中的重要物質(zhì)，在白酒釀造過(guò)程中起著糖化、發(fā)酵、生香的作用[1]。大曲在制作上采用自然接種和開放式發(fā)酵[2]，富集制曲環(huán)境中的各種微生物在曲坯中生長(zhǎng)，包括細(xì)菌、真菌和古菌，它們?cè)谇髦斜讼碎L(zhǎng)，最終形成獨(dú)特的群落結(jié)構(gòu)[3]。古菌相較于細(xì)菌和真菌在大曲中占比較少，但在濃香型白酒的產(chǎn)香過(guò)程中起著重要作用，不僅促進(jìn)己酸發(fā)酵進(jìn)程多產(chǎn)己酸，而且能增加己酸乙酯含量以及有效的降低甲醇的含量，提高酒質(zhì)[4]。因此，研究大曲中古菌群落結(jié)構(gòu)具有重要意義。

近幾年，隨著第二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于釀酒微生物多樣性研究[5]，其相比于傳統(tǒng)微生物分離、熒光原位雜交、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和變性梯度凝膠電泳等方法具有準(zhǔn)確定量、靈敏度高、工作量小、耗費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。

目前，在白酒釀造方面，對(duì)于古菌的研究多見于窖泥[9-12]、酒醅[13]、發(fā)酵黃水[14]，但對(duì)大曲的研究較少，并且利用高通量測(cè)序技術(shù)解析濃香型白酒大曲古菌群落多樣性的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)賒店老酒濃香型白酒大曲的古菌群落多樣性進(jìn)行分析，并進(jìn)行蛋白直系同源簇（clusters of orthologous groups，COG）功能預(yù)測(cè)分析，為探究中原地區(qū)大曲的制作以及白酒創(chuàng)新發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒大曲樣品B1：河南賒店老酒酒業(yè)有限公司。對(duì)稱取樣后，經(jīng)破碎、過(guò)篩（20目）、混勻、縮分，于-20 ℃冰箱存放。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP公司；熒光計(jì)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；T100TM Thermal Cyeler 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 大曲基因組的提取

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取大曲樣品200 mg于滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上清液。加入1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶液，振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上清液。倒置2 mL管于吸水紙上1 min，直至沒(méi)有液體流出。將樣品管放入55 ℃烘箱10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)[15]。

1.3.2 DNA的提取

1.3.3 PCR擴(kuò)增

第一輪擴(kuò)增：利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量。以基因組DNA為模板，采用引物1st-340F（5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3'）、1st-1000R（5'-GGCCATGCACYWCYTCTC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)僧體系：2×Taqmaster Mix 5 μL、引物1st-340F（10 μmol/L）1 μL、引物1st-1000R（10 μmol/L）1 μL、基因組DNA 20 ng、雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s（進(jìn)行5個(gè)循環(huán)）；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s（進(jìn)行20個(gè)循環(huán)）；72 ℃、5 min；10 ℃保存。

第二輪擴(kuò)增：以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用V3-V4通用引物349F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGMGAAW-3'）、806R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3'）對(duì)第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×Taqmaster Mix 5 μL；349F（10 μmol/L）1 μL、806R（10 μmol/L）1 μL、第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 ng、ddH2O補(bǔ)充至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s（5個(gè)循環(huán)）；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s（20個(gè)循環(huán)）；72 ℃、5 min；10 ℃保存。

第三輪擴(kuò)增：引入Illumina橋式PCR兼容引物。PCR擴(kuò)增體系：2×Taqmaster Mix 5 μL、Bar-PCR primer F（10 μmol/L）1 μL；primer R（10 μmol/L）1 μL、第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 ng、ddH2O水補(bǔ)充至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃、3 min；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s（5個(gè)循環(huán)）；72 ℃、5 min；10 ℃保存。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格后，純化回收DNA，利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，按照1∶1等量混合后委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3.4 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Miseq 2×300 bp測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定，并且通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）分析、Alpha多樣性分析、物種分類學(xué)分析和COG功能預(yù)測(cè)分析等不同方面對(duì)大曲的古菌菌落多樣性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因的PCR擴(kuò)增

古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度為500 bp左右，與目標(biāo)相符，純化回收后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplified products from archaea 16S rDNA V3-V4 region

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果分析

對(duì)古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)barcode標(biāo)簽序列（5'-GCGTGTG-3'）得到樣本的數(shù)據(jù)，為了提高后續(xù)分析質(zhì)量和可靠性，對(duì)原始序列進(jìn)行去接頭、質(zhì)量控制（quality control，QC）等處理，結(jié)果見表1。由表1可知，大曲樣品B1中檢測(cè)到的原始reads數(shù)目為77 563個(gè)，平均堿基長(zhǎng)度為417.01 bp。通過(guò)質(zhì)控去除barcode、兩端引物及部分低質(zhì)量序列，得到74 434條基因序列，平均堿基長(zhǎng)度為379.26 bp；PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生887個(gè)嵌合體；非靶區(qū)域序列數(shù)目有531個(gè)；為保證測(cè)序數(shù)據(jù)信息的分析質(zhì)量，再通過(guò)去除嵌合體與靶區(qū)域外序列發(fā)現(xiàn)，大曲樣品B1中有73 000條基因序列。

表1 大曲樣品B1中古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列測(cè)序結(jié)果Table 1 Sequencing results of 16S rDNA V3-V4 region gene sequence of archaea in Daqu samples B1

2.3 Alpha多樣性分析

Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage等Alpha多樣性指數(shù)常用于衡量微生物群落多樣性[16]，大曲樣品B1中古菌的Alpha多樣性分析結(jié)果見表2。由表2可知，大曲樣品B1的Coverage值為1，證明實(shí)驗(yàn)取樣合理，測(cè)序結(jié)果能反映樣本的真實(shí)情況，其中可注釋的OTU數(shù)為417個(gè)，Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為2.05、474.13、0.34。

表2 大曲樣品B1中古菌的Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Results of Alpha diversity analysis of archaea in Daqu sample B1

2.4 Shannon指數(shù)曲線分析

使用相似度＞97%的OTU，利用mothur進(jìn)行rarefaction分析，利用R制作曲線圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，曲線趨于平坦，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，證明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

圖2 大曲樣品B1的Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.2 Shannon index dilution curve of Daqu sample B1

2.5 物種分類學(xué)分析

將得到的所有OTU和數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)其進(jìn)行物種分類，獲得各個(gè)OTU的分類水平，即門、綱、目、科、屬分類水平?；陂T、屬水平大曲樣品B1中古菌的群落結(jié)構(gòu)分別見圖3和圖4。

圖3 基于門水平大曲樣品B1古菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of archaea community structure in Daqu sample B1 based on phylum level

圖4 基于屬水平上大曲樣品B1古菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of archaea community structure in Daqu sample B1 based on genus level

由圖3可知，大曲樣品B1中共注釋到6個(gè)古菌門，其中優(yōu)勢(shì)古菌門（相對(duì)豐度＞1%）為廣古菌門（Euryarchaeota）（98.51%），非優(yōu)勢(shì)古菌門為泉古菌門（Crenarchaeota）（0.63%）烏斯古菌門（Woesearchaeota）（0.40%）、奇古菌門（Thaumarchaeota）（0.31%）、佩斯古菌門（Pacearchaeota）（0.03%）、Others（0.06%）、未分類菌門（unclassified）（0.02%）。邊名鴻等[17]利用核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析（amplifed ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）免培養(yǎng)手段研究醬香型窖泥中的古菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，醬香型窖泥中古菌主要為廣古菌門；李可[18]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和構(gòu)建小亞基核糖體（ribosomal small subunit rRNA，SSU rRNA）文庫(kù)的方法對(duì)中國(guó)濃香型白酒發(fā)酵黃水微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究發(fā)現(xiàn)主要古菌為廣古菌門；WU C等[19]利用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）研究不同窖齡窖泥中的古菌群落，發(fā)現(xiàn)所有古菌的16S rRNA基因序列均歸為廣古菌門；趙東等[20]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)解析五糧液窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，古菌門有廣古菌門、泉古菌門；張應(yīng)剛等[21]基于高通量測(cè)序分析不同窖齡窖泥微生物結(jié)構(gòu)與多樣性，結(jié)果表明古菌主要為廣古菌門、奇古菌門和泉古菌門。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，廣古菌門不僅在窖泥、發(fā)酵黃水中為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，在大曲中也是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，說(shuō)明廣古菌門類古菌在白酒釀造中發(fā)揮著重要作用，對(duì)白酒風(fēng)味的形成至關(guān)重要；除廣古菌門、泉古菌門、奇古菌門外，還新發(fā)現(xiàn)烏斯古菌門、佩斯古菌門，這兩個(gè)菌門的報(bào)道多見于對(duì)甲烷鹽堿環(huán)境和海洋沉積物的研究[22-23]。

由圖4可知，大曲樣品B1中共注釋到20個(gè)古菌屬，其中優(yōu)勢(shì)古菌屬（相對(duì)豐度＞1%）為甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）（61.92%）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）（10.51%）、甲烷發(fā)菌屬（Methanothrix）（7.17%）、鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）（6.30%）、Methanomassiliicoccus（3.84%）、甲烷球形菌屬（Methanosphaera）（1.72%）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）（1.61%）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）（1.07%）、Methanospirillum（1.04%）、甲烷嗜熱桿菌屬（Methanothermobacter）（1.00%）、unclassified（2.02%），非優(yōu)勢(shì)古菌屬為產(chǎn)甲烷石狀菌屬（Methanocalculus）（0.28%）、WoesearchaeotaIncertae Sedis AR16（0.22%）、亞硝化暖菌屬（Nitrososphaera）（0.20%）、Methanosphaerula（0.17%）、甲烷繩菌屬（Methanolinea）（0.11%）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus）（0.11%）、Methanoregula（0.07%）、熱球菌屬（Thermococcus）（0.05%）、WoesearchaeotaIncertae Sedis AR15（0.04%）、Others（0.53%）。

葉光斌等[24]基于免培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)窖泥中古菌屬有甲烷囊菌屬、甲烷八疊球菌屬、甲烷桿菌屬和Methanomassiliic-occus；陶勇等[11]通過(guò)454焦磷酸測(cè)序法在不同窖齡窖泥中發(fā)現(xiàn)古菌的群落有甲烷短桿菌屬、甲烷囊菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷八疊球菌屬；王明躍等[25]應(yīng)用PCR-ARDRA和16S rRNA基因克隆測(cè)序技術(shù)針對(duì)窖泥古菌群落研究發(fā)現(xiàn)，古菌的群落組成是甲烷囊菌屬、甲烷八疊球菌屬、甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）和甲烷桿菌屬；WANG X等[26]通過(guò)對(duì)窖泥和酒醅進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬占主導(dǎo)地位。本研究得益于先進(jìn)的高通量測(cè)序技術(shù)，在大曲優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量上較上述研究發(fā)現(xiàn)的要多。

大曲中的菌群主要為甲烷菌，其對(duì)窖泥的老熟有促進(jìn)作用[27]；甲烷短桿菌屬、甲烷囊菌屬和甲烷桿菌屬等為氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，它們能夠消耗己酸和乙酸代謝的H2和CO2，解除己酸菌代謝的反饋抑制作用，增強(qiáng)與己酸菌的“種間氫轉(zhuǎn)移關(guān)系”，在濃香型白酒生產(chǎn)中促進(jìn)己酸發(fā)酵進(jìn)程多產(chǎn)己酸，從而增加己酸乙酯含量以提高酒質(zhì)[28]；由于產(chǎn)生低沸點(diǎn)的甲烷氣體，不僅能夠帶走大量熱量，抑制雜菌繁殖，而且能使發(fā)酵按照理想的溫度緩慢進(jìn)行，提高發(fā)酵效率，增加產(chǎn)量[29]。

此外本研究首次在釀酒領(lǐng)域的研究中發(fā)現(xiàn)鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）、熱球菌屬（Thermococcus）、甲烷繩菌屬（Methanolinea）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus），這極大的豐富了釀酒微生物信息資源庫(kù)。鹽堿球菌屬類古菌多存在于高鹽等極端環(huán)境[30]，這類古菌類群可以分泌蛋白酶降解環(huán)境中的蛋白質(zhì)，形成小分子的肽和氨基酸[31]，因此推測(cè)該菌屬類古菌對(duì)濃香型白酒香氣成分有一定的貢獻(xiàn)；熱球菌屬是一類產(chǎn)環(huán)糊精酶的嗜熱古菌，可以通過(guò)H2發(fā)酵在丙酮酸或麥芽低聚糖上生長(zhǎng)，多用于麥芽七糖的制備[32-33]；甲烷繩菌屬是一種生活于厭氧消化污泥、沼澤中的產(chǎn)甲烷古菌[34-35]；亞硝化侏儒菌屬屬于氨氧化古細(xì)菌，具有一定的硝化能力[36]。目前對(duì)于大曲中古菌的研究仍然滯后，這些菌屬在整個(gè)釀造過(guò)程中是否普遍分布、在白酒發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮什么樣的作用以及具體的影響等都有待研究。

2.6 COG功能預(yù)測(cè)分析

為了得知大曲樣品B1更高層級(jí)水平上的功能情況，通過(guò)對(duì)已有測(cè)序微生物基因組的基因功能的構(gòu)成進(jìn)行分析后，通過(guò)16S rRNA測(cè)序獲得的物種構(gòu)成推測(cè)樣本中的功能基因的構(gòu)成，結(jié)果見表3。由表3可知，預(yù)測(cè)大曲樣品B1古菌群落的COG功能有4類，分別為新陳代謝類（8個(gè)）、細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)類（10個(gè)）、信息存儲(chǔ)與處理類（5個(gè)）和特征差的功能（2個(gè)）。過(guò)濾掉特征差的功能，大曲樣品B1古菌群落的COG功能富集豐度前6的功能有翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，輔酶運(yùn)輸和代謝，復(fù)制、重組和修復(fù)和轉(zhuǎn)錄，反映了大曲中各種酶系的合成活躍。

表3 大曲樣品B1中古菌群落的蛋白COG功能分類結(jié)果Table 3 Results of protein COG function classification of archaea community in Daqu sample B1

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析賒店老酒大曲的古菌群落多樣性及功能情況。結(jié)果表明，大曲的優(yōu)勢(shì)古菌門為廣古菌門（Euryarchaeota），優(yōu)勢(shì)古菌屬有甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷發(fā)菌屬（Methanothrix）、鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）、Methanomassiliicoccus、甲烷球形菌屬（Methanosphaera）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、Methanospirillum、甲烷嗜熱桿菌屬（Methanothermobacter）。此外，首次在大曲中發(fā)現(xiàn)鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）、熱球菌屬（Thermococcus）、甲烷繩菌屬（Methanolinea）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus），COG功能主要富集在翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，輔酶運(yùn)輸和代謝，復(fù)制、重組和修復(fù)，轉(zhuǎn)錄，反映了大曲中各種酶系的合成活躍。本研究結(jié)果極大豐富了濃香型白酒大曲中古菌的數(shù)據(jù)資源，對(duì)中原地區(qū)的大曲的制作以及白酒的創(chuàng)新性發(fā)展具有重要意義，為下一步分離純種進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。