王雅芝，段燦燦，2，何天目，張建永，2

(1. 遵義醫(yī)科大學 藥學院藥劑學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，貴州 遵義 563099)

附子湯，首見于東漢醫(yī)學家張仲景的《傷寒論》，由附子、茯苓、人參、白術與芍藥組成，具有溫陽祛寒，寧心安神，健脾利水之功，主治陽虛寒濕內侵之證[1]。其中附子[2-3]辛甘大熱，具有回陽救逆、溫腎助陽，散寒止痛的功效，為君藥；白術[4]、茯苓[5-6]利水滲濕、健脾益氣且白術可增強附子去寒濕之邪的功效，為臣藥；氣屬陽，陽虛必兼氣虛，故用人參[7]補益元氣，不僅可加強附子的回陽救逆之功，而且有助于復脈固脫、祛除邪氣，為佐藥；更佐芍藥[8-9]養(yǎng)血柔肝、斂陰收汗、和營止痛，以監(jiān)附子之悍等癥狀。古代運用此方一般多用來治療少陰陽虛、寒濕停聚肢體關節(jié)的疼痛[10]。現(xiàn)代多將其用于治療心血管系統(tǒng)疾病、類風濕性關節(jié)炎、婦科病以及妊娠病等[1]，然而其在臨床治療疾病的精準定位還不甚清楚，作用機制也有待進一步研究。

近年來，中藥網(wǎng)絡藥理學在人類疾病研究方面被廣泛應用[11-12]。中藥方劑由多味中藥根據(jù)“君臣佐使”的原則進行配伍而得，是由多種化學成分及多個靶點之間協(xié)同作用的復雜體系，使得對中藥方劑的深入研究出現(xiàn)很大的困難，網(wǎng)絡藥理學整合了系統(tǒng)生物學、網(wǎng)絡生物學、網(wǎng)絡分析和傳統(tǒng)藥理學等多學科的技術和內容，具有整體性、系統(tǒng)性等優(yōu)點，是闡明中藥配方中活性成分和潛在機理的新策略[13-15]。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法分析附子湯中活性成分相關靶點的作用器官及其藥效物質基礎，進一步發(fā)現(xiàn)附子湯的臨床精準定位，為深入開展附子湯的作用機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選 本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以附子、人參、茯苓、白術、白芍為關鍵詞，檢索附子湯中5味中藥的全部化學成分。以化合物口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18作為活性成分的篩選條件[16-17]。但是，依據(jù)上述活性成分篩選方法，仍會將部分具有藥理作用的有效成分篩除。因此，本研究根據(jù)已有的文獻報道進一步驗證和補充，最終確定出附子湯中具有活性的成分。

1.2 靶點的預測與構建 通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、ChEMBL數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)、TargetNet數(shù)據(jù)庫(http://targetnet.scbdd.com/calcnet/index/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，最后得到活性成分的相關靶點。然后采用Cytoscape 3.7.1軟件構建“藥味-活性成分-相關靶點”網(wǎng)絡，根據(jù)網(wǎng)絡特征指標度(Degree)和介數(shù)(Betweenness)進行分析，篩選出附子湯的關鍵活性成分。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡的構建 基于STRING平臺(https://string-db.org/)將所獲取的相關靶點導入數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”，選擇Highest confidence(0.9)，然后采用Cytoscape3.7.1軟件構建附子湯作用靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，根據(jù)點度中心性(DC，Degree centrality)、接近中心性(CC，Closeness centrality)和中介中心性(BC，Betweenness centrality)的大小進行篩選，將其設置靶點的顏色，從而篩選出附子湯中發(fā)揮重要作用的靶點。

1.4 器官定位及靶點-疾病-器官網(wǎng)絡的構建 將所得的附子湯活性成分對應的靶點導入CTD在線分析平臺(http://ctdbase.org/)，得到與靶點相關的疾病，將相關疾病根據(jù)疾病類型進行分類，采用BioGPS數(shù)據(jù)庫[18](http://biogps.org/)對相關靶點進行器官定位，將所獲得的信息導入Cytoscape 3.7.1軟件繪制“靶點-疾病-器官”網(wǎng)絡，進一步分析附子湯治療疾病的臨床定位，并結合文獻報道研究其治療的主要疾病。

1.5 生物功能注釋分析和通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)分別對PPI網(wǎng)絡中的核心靶點和作用于肝臟和心臟的靶點進行生物功能注釋分析(GO)和通路富集分析(KEGG)，限定物種為“Homo Sapiens”，最后采用ImageGP在線平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php)對富集分析結果進行可視化分析，分析附子湯可能的主治病癥，從而為附子湯臨床定位提供依據(jù)。

1.6 整合網(wǎng)絡分析 將上述的“藥味-活性成分-相關靶點”、“作用靶點-作用器官”和“作用靶點-關鍵通路”等信息分別導入Cytoscape 3.7.1軟件中，運用Merge功能，將其合并得到“藥味-活性成分-靶點-關鍵通路”的分析網(wǎng)絡，從而進一步探討附子湯的整體藥理機制。

1.7 分子對接驗證 運用AutoDock Vina軟件對“藥味-活性成分-相關靶點”網(wǎng)絡中度值前5的關鍵活性成分與PPI網(wǎng)絡中篩選出來的核心靶點進行分子對接驗證。首先通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲取靶點蛋白晶體結構，通過Open Babel軟件將5個關鍵成分的SDF格式轉化為PDB格式；再利用AutoDock對接軟件對蛋白晶體結構去水加氫、計算電荷、去除原配體，對配體分子通過Torsion Tree進行調整，設置配體分子的可扭轉鍵，并分別進行能量優(yōu)化，保存為PDBQT文件。通過AutoDock Vina軟件計算其對接活性位點、結合能及均方根偏差(RMSD)，結合能越低表示成分與靶點蛋白的對接效果越好。最后運用Discovery Studio 4.5軟件對對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 活性成分的篩選結果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別對附子湯中的5味中藥進行檢索，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，得到附子中活性成分21個，其中茯苓中活性成分15個，人參中活性成分22個，白術中活性成分7個，白勺中活性成分13個。剔除重復的活性成分，共收集到附子湯中75個化學成分。根據(jù)已有的文獻報道得知，附子湯中單酯型生物堿具有較強的活性。因此，將苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿3個成分也納入活性成分[19]，最終確定附子湯中78個活性成分。附子湯中篩選出來的主要活性成分信息，如表1所示。

表1 附子湯中主要活性成分信息表

續(xù)表

續(xù)表

2.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡的分析 運用TargetNet數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，共獲得131個相關靶點。利用Cytoscape3.7.1軟件，將附子湯的5味中藥、78個活性成分和131個相關靶點建立可視化網(wǎng)絡拓撲圖，見圖1。“藥味-活性成分-相關靶點”網(wǎng)絡圖由211個節(jié)點，537條邊構成，平均節(jié)點度(degree)為5.1。通過網(wǎng)絡圖中可以看出附子和人參中的活性成分最多，從而證實了附子是附子湯中的君藥，人參作為佐藥調和方劑中的陰陽平衡。運用Network analysis插件對網(wǎng)絡特征指標分析得知：degree排名前5的活性成分是山柰酚(白芍、人參；degree=40)、灌木遠志酮 A(人參；degree=36)、11，14-二十碳二烯酸(附子；degree=33)、花生四烯酸(人參；degree=28)、石竹胺(人參；degree=28)。每味藥材中對應的degree最高的活性成分分別是附子(11，14-二十碳二烯酸，degree=33)、茯苓(常春藤皂苷元，degree=6)、人參(山柰酚、degree=40)、白術((3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-dimethyl-17-[(2R，5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，degree=28)、白芍(山柰酚、degree=40)，其中山柰酚是人參和白芍共有的活性成分，11，14-二十碳二烯酸在總排名和單味中藥中degree均較高，進一步說明這些成分可能是附子湯中發(fā)揮作用的關鍵成分。

V形代表藥味；六邊形代表活性成分；四邊形代表靶點。圖1 藥味-活性成分-靶點網(wǎng)絡

2.3 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與分析 運用STRING數(shù)據(jù)庫將上述獲得的131個靶點蛋白進行蛋白互作關系分析，限定物種“Homo sapiens”，選擇High confidence(0.9)，保存其TSV格式文件并導入Cytoscape 3.7.1軟件進行拓撲分析，獲取了83個相互作用的重要靶點，其中23個黃色節(jié)點代表第一次拓撲分析中得到的核心靶點。在第一次拓撲分析中，根據(jù)DC≥10、CC≥0.20和BC≥0.00為標準，獲得了23個節(jié)點和163條邊，其中5個黃色節(jié)點代表在第二次拓撲分析中得到的核心靶點；經(jīng)第二次拓撲分析，以DC≥18、CC≥0.25、BC≥0.02為標準，最終得到5個節(jié)點，10條邊，5個核心靶點分別是CXC趨化因子受體4型(CXCR4)、α-2C腎上腺素能受體(ADRA2C)、大麻素受體2(CNR2)、α-2B腎上腺素能受體(ADRA2B)、α-2A腎上腺素能受體(ADRA2A)，見圖2。根據(jù)分析得知CC或BC靶點越大，其DC值越大，說明這些靶點之間有很強的協(xié)同作用。

圖2 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡

2.4 器官定位及靶點相關疾病分析 將篩選出來的相關靶點運用CTD數(shù)據(jù)庫進行分析，以P≤0.01為篩選條件，發(fā)現(xiàn)131個靶點與194種疾病有關，將疾病按CTD數(shù)據(jù)庫默認的系統(tǒng)進行分類，共歸為22種疾病類型，根據(jù)P值和注釋基因數(shù)量排序，排名靠前的疾病有腫瘤、消化系統(tǒng)疾病、先天性及遺傳性、心血管疾病、女性泌尿生殖系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。通過BioGPS數(shù)據(jù)庫對靶點進行器官定位，結果發(fā)現(xiàn)這些靶點主要作用于心、肝、肺、腎等，如圖3，圖中左側的條形圖代表靶點數(shù)，可知心和肝的作用靶點個數(shù)較多，分別是30和22。進一步采用Cytoscape 3.7.1軟件構建“靶點-疾病類別-器官”網(wǎng)絡圖，拓撲異構分析degree排名前5的疾病類型分別是：癌癥、心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、泌尿生殖系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(見圖4)，其中PTGIR為心和肝的共同靶點(見圖5)。PTGIR基因突變會在纖維肌肉發(fā)育不良(FMD)患者中產(chǎn)生富集，同時在自發(fā)性冠狀動脈夾層(SCAD)患者中發(fā)現(xiàn)前列環(huán)素信號在非動脈粥樣硬化性狹窄和夾層中起作用[20]。然后將這5種類型所對應的疾病根據(jù)基因數(shù)量進行排序，得到每種系統(tǒng)類型發(fā)揮療效最高的疾病，見表2。通過圖表得知，這5種類型對應的疾病主要集中在肝臟和心臟，與器官定位結果相吻合，進一步證明這五種類型可能是附子湯發(fā)揮藥理作用及臨床定位的主要方向。

圖3 靶點器官定位分布情況

V形代表器官，六邊形代表作用靶點，四邊形代表疾病類型。圖4 作用靶點-疾病類型-器官網(wǎng)絡

V型代表器官；六邊形代表作用靶點；四邊形代表疾病類型；圓形代表心和肝共有的作用靶點。圖5 心和肝的作用靶點-疾病類型-器官網(wǎng)絡

表2 相關靶點對應的主要疾病信息

2.5 GO生物進程分析和KEGG通路富集分析 富集分析結果顯示生物過程(BP)主要涉及G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、氧化還原反應、炎癥反應等183個Go-terms；分子功能(MF)涉及鋅離子結合、序列特異性DNA結合、轉錄因子活性、類固醇激素受體等83個Go-terms；細胞成分(CC)主要涉及質膜、膜的組成部分、核質等19個Go-terms。分別篩選出基因數(shù)量大于10的Go-terms進行繪制柱狀圖，見圖6。KEGG分析共得到21條信號通路，見圖7。根據(jù)GeneRatio、P值以及調控通路上的基因個數(shù)篩選出5條關鍵通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、甾體激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis)、花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)、甲狀腺激素信號通路(Thyroid hormone signaling pathway)。其中將作用于肝臟和心臟的靶點單獨進行KEGG分析共得到11條信號通路，主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、甲狀腺激素信號通路(Thyroid hormone signaling pathway)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、胰島素抵抗(Insulin resistance)等通路，見圖8。

圖6 活性成分相關靶點生物功能分析

圖7 活性成分相關靶點通路注釋分析

圖8 作用于心肝的靶點通路注釋分析

2.6 整合網(wǎng)絡分析 附子湯的“藥味-活性成分-靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡由78個活性成分、131個作用靶點及5條關鍵通路之間的關系，構成了一個具有多成分、多靶點、多通路的整合網(wǎng)絡，見圖9。從網(wǎng)絡圖中可以看出附子湯中的活性成分具有多個作用靶點，同時每個作用靶點參與到多條信號通路中，構成了一個具有多成分、多靶點、多通路的整合網(wǎng)絡。同時，將作用于肝臟和心臟的靶點進行KEGG分析，得知神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路和甲狀腺激素信號通路是附子湯富集靶點最多的通路(見圖9A和B)。

圖9 藥味-活性成分-靶點-關鍵通路網(wǎng)絡

2.7 分子對接驗證 根據(jù)結合能篩選出對接結果最好的每個關鍵活性成分與靶點蛋白分別進行可視化分析，見圖10，其中山柰酚和石竹胺均能與靶點CNR2形成氫鍵，11，14-二十碳二烯酸與靶點CNR4形成氫鍵。因此，根據(jù)關鍵活性成分與關鍵靶點的結合能力分析得知：附子湯主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為其臨床定位研究提供了理論依據(jù)。關鍵活性成分與靶點蛋白的分子對接結果，如表3所示。

圖10 關鍵成分與靶點CXCR4、ADRA2C、CNR2、ADRA2B、ADRA2A結合能排序最低的最佳對接構象

表3 關鍵成分及核心靶點的結合能

3 討論

附子湯具有溫經(jīng)助陽、祛寒除濕之功。古代臨床常用本方加減治療風濕性關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎等屬陽虛寒盛類疾病，也用于慢性心功能不全、慢性腎炎、肝炎、月經(jīng)后期等屬脾腎陽虛、寒濕內阻類疾病。為了研究附子湯現(xiàn)代臨床的精準定位及應用，明確其藥理作用的分子機制，本研究通過國內外文獻、TCMSP數(shù)據(jù)庫研究了附子湯5味中藥的活性成分，構建了“藥味-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，同時分析了作用靶點之間的互作關系及器官分布和功能通路富集，發(fā)現(xiàn)附子湯的作用部位主要分布在肝臟和心臟，作用的疾病類型主要有肝癌等癌癥、心血管疾病和消化系統(tǒng)疾病，從而為附子湯的臨床定位提供了科學依據(jù)。

在附子湯“藥味-活性成分-靶點”網(wǎng)絡中，化合物山柰酚、灌木遠志酮A、11，14-二十碳二烯酸、花生四烯酸、石竹胺和靶點PTPN1、CYP17A1、PTPN2的度值排名較高，其中山柰酚可以降低癌癥、肝損傷、肥胖和糖尿病等慢性疾病的風險，同時對小鼠乳腺腫瘤模型的原發(fā)性腫瘤生長和肺轉移也有顯著的抑制作用[21-22]。PTPN1可以減弱細胞增殖、轉移，可能是肺腺癌(LUAD)診斷和治療的腫瘤標志物或潛在靶點[23]。CYP17A1是一種細胞色素P450酶，可以參與脫氫表雄酮和雄烯二酮的甾體生成，是前列腺癌激素治療的靶點，同時CYP酶在類固醇激素合成中起著至關重要的作用，CYP17A1基因變異可以引起各種心血管疾病，包括冠心病、心肌梗死、糖尿病和動脈僵硬等[24-25]。附子湯靶點蛋白互作關系網(wǎng)絡中，本研究發(fā)現(xiàn)CXCR4、ADRA2C、CNR2、ADRA2B、ADRA2A是關鍵靶點，說明附子湯的藥理作用很有可能是這些靶點蛋白相互作用實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，這些靶點蛋白都屬于G蛋白偶聯(lián)受體，它們主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。其中腎上腺素α2受體與抑制性G蛋白偶聯(lián)，可以使腺苷酸環(huán)化酶失活，減少環(huán)磷酸腺苷(AMP)的產(chǎn)生，從而導致動脈血壓下降，具有保護心肌的效果[26-27]。該結果與附子湯的作用部位和作用疾病類型結果相吻合，因此，可推斷附子湯中的活性成分正是通過以上靶點作用于肝臟和心臟對機體進行調控，從而起到抗炎、抗腫瘤、保肝、改善心功能等作用。

為了進一步說明附子湯相關靶點的信號通路，利用DAVID數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)主要富集在以下4條通路：神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、甾體激素生物合成、花生四烯酸代謝和甲狀腺激素信號通路。神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路主要涉及到DRD1、THRA、THRB、DRD5、OPRK1等靶點，其中多巴胺受體(DRD1-DRD5)主要與大腦功能障礙有關。甾體生物合成是一個復雜的過程，膽固醇在多種酶和輔因子的參與下轉化為甾體激素，甾體激素是人體生理過程的重要調節(jié)因子，受基因調控[28]。例如，Pott等[29]驗證了冠心病單核苷酸多態(tài)性與類固醇激素的相關性，并使用孟德爾隨機化(MR)方法調查激素水平和CAD狀態(tài)之間的因果關系，MR結果顯示皮質醇、雄烯二酮、17-羥基孕酮和脫氫表雄酮硫酸酯對冠心病均有因果關系，同時還發(fā)現(xiàn)冠心病患者中皮質醇和睪酮比正常人明顯增加?；ㄉ南┧?AA)是細胞膜脂的主要成分，主要由環(huán)氧合酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和細胞色素P450(CYP450)3種酶進行代謝，從而產(chǎn)生不同的炎癥反應?；ㄉ南┧嵫趸僧a(chǎn)生促炎性和抗炎性的類花生四烯酸，對血小板具有活化作用，并且血小板活化在急慢性心血管疾病中也起著重要作用[30]。由此可以推測，附子湯治療冠心病、慢性心功能不全等心血管疾病，可能是通過以上兩個信號通路來實現(xiàn)的。甲狀腺激素(TH)基因組和非基因組作用的調控包括細胞生長、胚胎發(fā)育、分化、代謝和增殖等幾個生理過程，細胞甲狀腺激素信號傳導的破壞會促進肝癌的發(fā)展[31-32]。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)血清甲狀腺刺激激素(TSH)水平升高可以誘發(fā)氧化應激相關的肝臟疾病。由此可推測，附子湯對肝臟的保護作用正是通過甲狀腺激素信號通路調節(jié)實現(xiàn)的。

附子湯作為溫補元陽的重要方劑，是回陽救逆、扶正以祛邪方藥的化裁基礎。在古代附子湯應用廣泛，主要用于治療失眠、月經(jīng)不調、風濕性關節(jié)炎、慢性腎衰竭疑難病的治療[34-35]。但如今其臨床應用少且主要成分及作用機制尚不明確。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法，對附子湯的化學成分、相關靶點、作用器官及相關通路的復雜網(wǎng)絡進行分析。研究結果表明，附子湯相關靶點的作用器官主要集中于肝臟和心臟，在免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝護肝、改善心功能等疾病的治療中具有較高的臨床價值，同時進一步解釋了附子湯的重要作用機制，為拓展附子湯的臨床定位及應用提供了重要參考依據(jù)。